YÖNTEM 1. Hücre Kültürü

Başlıca özellikleri Tablo 3.1.’de verilen MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatları, %1 L-glutamin, %1 penisilin/streptomisin ve ısı ile inaktive edilmiş %10 FBS içeren DMEM besin ortamında, T75 hücre kültür kabı içinde 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren inkübatörde çoğaltılmıştır. Hücrelerin morfolojik özellikleri ve çoğalma süreçleri ışık mikroskobu ile gözlemlenmiştir (Şekil 3.1.). Bu doktora tezi kapsamında gerçekleştirilmiş olan tüm deneyler Şekil 3.2.’de özetlenmiştir.

Tablo 3.1. MCF-7 ve MDA-MB-231 hücre hatlarının başlıca özellikleri.

Özellik MCF-7 MDA-MB-231

Meme Kanseri Alt

Grubu Luminal A Düşük Klaudinli

Hücre Tipi/Morfoloji Epitelyal Epitelyal

Hücresel Özellik Adherent Adherent

Hastalık Adenokarsinoma Adenokarsinoma

Yaş, Köken ve Cinsiyet 69 yaşında beyaz bir kadın 51 yaşında beyaz bir kadın

TP53 geni Vahşi tip Homozigotik mutant

(c.839G>A) ATCC Katalog No. ATCC^® HTB-22^™ ATCC^® HTB-26^™

Şekil 3.1. MCF-7 (A) ve MDA-MB-231 (B) hücrelerinin ışık mikroskobu altındaki görüntüleri (40X).

Şekil 3.2. Tez kapsamında gerçekleştirilmiş olan deneyler.

3.2.2. Hücre Canlılığının Ölçülmesi

SRB deneyi, 1990 yılında geliştirilen, hücre canlılığının in vitro ölçümünde sık kullanılan bir yöntemdir (230). SRB, aminoksanten yapıda bir boya olup, zayıf asidik ortamda yapısındaki iki adet sülfonik grup ile proteinlerin bazik amino asit kalıntılarına bağlanmaktadır. SRB’nin sitokiyometrik bir boya olmasından kaynaklı olarak, boyanmış hücrelerdeki boya miktarı, direkt olarak hücre kütlesi ile orantılı kabul edilmektedir (231). SRB’nin kimyasal yapısı Şekil 3.3.’de; bazik bir amino asit olan histidin ile yaptığı bağ ise Şekil 3.4.’de şematize edilmiştir. Bu tez

kapsamında verilen tüm kimyasal yapılar Chemdraw Professional 15.0 yazılım programı ile çizilmiştir.

Şekil 3.3. Sülforodamin B’nin kimyasal yapısı (232).

Şekil 3.4. SRB’nin zayif asidik oramda, bazik bir amino asit olan histidin kalıntısı ile yaptığı bağ (233).

Bu deney için, öncelikle hücreler steril 96 kuyucuklu plakalara, her bir kuyucukta 5×10³ hücre olacak şekilde ekilmiştir. Hücreler kuyucuklarda doluluğa ulaştığı zaman, farklı dozlarda doksorubisin ile muamele edilmiştir. Hücrelerin 48 saat süresince inkübatörde bekletilmelerinin ardından SRB deneyi gerçekleştirilmiştir.

İlk olarak hücreler, %10 (w/v)’luk TCA ile 1 saat süresince 4°C’de inkübe edilerek plakaya fikse edilmiştir. Hücreler plakaya fikse olduktan sonra plaka dH2O ile yıkanarak TCA’nın ortamdan uzaklaştırılması sağlanmıştır. Plaka kurutulduktan sonra her bir kuyucuğa %0,06 (w/v) SRB çözeltisi eklenerek 30 dakika süresince oda sıcaklığında inkübe edilmiş ve böylelikle boyanın hücresel proteinlere bağlanması sağlanmıştır. İnkübasyon süresinin sonunda, plaka %1 (v/v) asetik asit ile yıkanarak bağlanmamış boya uzaklaştırılmıştır. Plakanın kurutulmasının ardından her bir kuyucuğa 200 μL Tris bazı (10 mM, pH 10,5) eklenip homojen hale gelmesi için plaka 10 dakika süre ile çalkalayıcıda çalkalanmıştır. Boyanın tamamen çözündüğüne emin olunduktan sonra, plaka okuyucuda her bir kuyucuk için 510 nm dalga boyunda absorbans ölçülmüş ve kaydedilmiştir. Hiç ajan eklenmemiş, sadece hücre bulunan kuyucuklarda hücre canlılığı %100 kabul edilerek, diğer kuyucuklardaki hücre canlığı da absorbansa göre orantılı olarak belirlenmiş ve grafik çizilerek her bir ajan için IC50 değerleri hesaplanmıştır. Bu deney n=6 olacak şekilde tekrarlanmıştır.

3.2.3 Laktat Dehidrogenaz Aktivite Deneyi

LDH bütün hücrelerde, sitoplazmada bulunan bir enzimdir ve hücrelerin plazma zarlarının hasar görmesi durumunda hızla hücre dışına çıkmaktadır. Bu sebepten ötürü, LDH deneyi, çeşitli molekül ve ajanların sitotoksisitesinin saptanmasında kantitatif bir test olarak sıklıkla kullanılmaktadır (234). Laktat dehidrogenaz enziminin katalizlediği reaksiyon, Şekil 3.5.’de sunulmuştur.

Şekil 3.5. Laktat dehidrogenaz enziminin katalizlediği reaksiyon (ΔG'° = -25,1 kJ/mol).

Bu tez çalışması kapsamında, DOX’un MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatları üzerindeki sitotoksisitesinin incelenmesi amacıyla LDH aktivite deneyi gerçekleştirilmiştir. Hücreler steril 96 kuyucuklu plakalara, her bir kuyucukta 5×10³ hücre olacak şekilde ekilmiştir. Hücreler istenilen doluluğa ulaştığında, hücrelerin bulunduğu besiyeri ortamına artan dozlarda (50, 200, 400, 800 ve 8000 nM) DOX eklenmiştir. Hiç ajan uygulaması yapılmamış olan hücreler negatif kontrol olarak kabul edilmiştir. 48 saat inkübasyon sonrasında ilaç içermeyen belirli kuyucuklara %2’lik Triton X-100 uygulaması yapılmış ve 45 dakika süresince inkübe edilmiştir. Bu şekilde, bu kuyucuklardaki hücrelerin zarlarının tamamen parçalanması ve tüm LDH içeriklerinin besiyeri ortamına salınması sağlanarak pozitif kontrol elde edilmiştir. Bu sürenin sonunda pozitif kontrol, negatif kontrol ve örnek kuyucuklarından 50 μL alınarak yeni bir 96 kuyucuklu plakaya aktarılmıştır.

Bütün kuyucukların üzerinde 200 mM Tris-hidroklorik asit (HCl) (pH 7,3), 6,6 mM NADH ve 30 mM pirüvik asit içeren karışımdan 50 μL eklenmiştir. Plaka okuyucuda, örneklerin 340 nm’deki absorbans değerleri kinetik olarak ölçülmüş ve kaydedilmiştir. Bu deney 3 tekrar (n=3) olacak şekilde çalışılmıştır. Elde edilen veriler doğrultusunda, Formül 3.1.’e göre hesaplamalar yapılmış ve grafikler çizilmiştir.

% Sitotoksisite= Örnek−Negatif Kontrol

Pozitif Kontrol−Negatif Kontrol×100 (3.1.)

3.2.4. TUNEL Apoptoz Deneyi

DOX’un MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde apoptozu tetikleyip tetiklemediği, TUNEL yöntemi ile kalitatif olarak gösterilmiştir. Öncelikle hücreler her bir kuyucukta 24×24 mm^’lik lameller bulunan 6 kuyucuklu plakalara, her bir kuyucukta 1×10⁵ hücre olacak şekilde ekilmiş ve hücreler %80-90 doluluğa ulaşıncaya kadar inkübatörde bekletilmiştir. Daha sonra hücrelere iki farklı dozda (200 ya da 800 nM) DOX uygulaması yapılmış ve 48 saat inkübasyonun ardından deney gerçekleştirilmiştir. DOX uygulaması yapılmayan hücreler kontrol grubunu oluşturmaktadır. Deney sırasındaki tüm inkübasyon süreçlerinde, eklenen materyalin etkisinin arttırılması amacıyla lameller üstü parafilm ile kaplı şekilde, karanlıkta ve nemli bir kutu içinde muhafaza edilmiştir. Öncelikle hücreler, üzerlerinde bulundukları lamellere saf metanol ile fikse edilmiştir. Fiksasyon işleminin sonunda hem hücrelerin permeabilizasyonunu arttırmak hem de nükleaz ve proteinleri uzaklaştırmak amacıyla örneklere 20 μg/mL proteinaz K⁺ uygulaması yapılmıştır. 15 dakika boyunca bekletildikten sonra dH2O ile yıkanan örnekler, endojen peroksidazı bloke etmek maksadıyla %3 (v/v)’lük H2O2 ile muamale edilmiş ve 5 dakika süresince oda sıcaklığında tutulmuştur. 1X fosfat tamponlu salin (phosphate buffered saline, PBS) (10 mM, pH 7,4) ile yıkanan örnekler 1X dengeleyici tampon ile 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmiştir. Reaksiyon tamponu ile seyreltilmiş terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) enziminin lamel üzerindeki örneklere uygulanması ve 37°C’de 1 saat inküsyonun ardından bu enzim yardımıyla, DNA fragmentlerinin serbest 3’-OH ucuna dNTP’lerin bağlaması sağlanmıştır.

Örnekler dH2O ile seyreltilmiş durdurma tamponu ile yıkanmış ve anti-digoksigenin peroksidaz enziminin eklenmesi sonrasında örneklerin oda sıcaklığında 30 dakika bekletilmeleri sağlanmıştır. Bu sürenin sonunda pozitif renk reaksiyonu için örnekler 3-6 dakika boyunca oda sıcaklığında peroksidaz substatı olan diaminobenzidin (DAB) ile muamele edilmiştir. Böylece DNA kırıkları içeren apoptotik hücrelerin önce bej; daha sonra da kahverengiye boyanmaları sağlanmıştır. Deneyin devamında 1 dakika boyunca %0,5’lik metil yeşili uygulaması ile canlı hücreler yeşile boyanmıştır. Bağlanmamış boyanın uzaklaştırılması için örnekler saf etanol ile

yıkanmıştır. Örneklerin 30 saniye süresince tolüende tutulmalarının ardından entellan uygulaması ile daimi preparat elde edilmiştir. Hücrelerin hangi oranda apoptoza yöneldiğinin anlaşılması amacıyla bu daimi preparatlar ışık mikroskobu altında incelenmiş ve kontrol ile karşılaştırmalı ve kalitatif olarak apoptoz gözlenip gözlenmediğine karar verilmiştir. TUNEL deneyinde apoptotik hücrelerin saptanma esası Şekil 3.6.’de şematize edilmiştir.

Şekil 3.6. TUNEL deneyi ile apoptotik hücrelerin DNA kırıkları üzerinden saptanması (235).

3.2.5. Apoptoz Tayin Deneyi

DOX’un MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinin apoptoza yönelme süreçleri üzerindeki etkisini incelemek ve karşılaştırmak amacıyla Tali^® apoptoz deneyi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla hücreler, 6 kuyucuklu plakalara, her bir kuyucukta 1×10⁵ hücre olacak şekilde ekilmiştir. Hücrelerin doluluğa ulaşmalarının ardından hücrelere 50, 200 ya da 800 nM derişimde DOX uygulanmış ve hiç ajan uygulaması yapılmayan hücreler kontrol olarak kabul edilmiştir. 48 saat inkübasyon sonrasında hücreler tripsin ile muamele edilerek kaldırılmış ve 25°C sıcaklıkta, 500 × g’de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Hücrelerin PBS ile yıkanmasının ardından, 1X anneksin bağlama tamponu (annexin binding buffer, ABB) ve annexin V alexa fluor 488 uygulaması yapılmıştır. 20 dakika süresince oda sıcaklığında karanlıkta

bekletilmelerinin ardından örnekler santrifüj edilmiş; ABB ve potasyum iyodür (PI) karşımı eklenmiş ve homojen hale gelmesi sağlanmıştır. Son olarak karanlıkta ve oda sıcaklığında 1-5 dakika inkübe edilen örnekler 25’er μL olmak üzere özel kuyucuklu örnek slaytlarına yüklenerek Tali^® görüntü temelli hücre sayıcı ile analiz edilmiştir.

Bu deneyde kullanılan anneksin V, ilk olarak güçlü pıhtılaşma önleyici özelliğe sahip bir damar proteini olarak keşfedilmiştir. Anneksinler, Ca²⁺ bağımlı bir yol ile fosfolipidlere affinite göstermekte; anneksin V ise özellikle normalde dış hücre zarında bulunmayan PS’e yüksek ilgi ile bağlanmaktadır. Apoptoz sırasında PS iç hücre zarından dış hücre zarına geçmekte ve floresan ile işaretlenmiş olan anneksin V bu şekilde apoptotik hücrelerin saptanmasına yardımcı olmaktadır. Anneksin V aynı zamanda parçalanmış hücre zarları dolayısıyla nekrotik hücrelerin içine de girebilmektedir. Bu sebeple sadece nekrotik hücrelerin içine giren PI da bu deneyde kullanılmakta ve böylece apoptotik ve nekrotik hücrelerin ayrımının yapılabilmesi sağlanmaktadır (236, 237).

3.2.6. Hücre Döngüsü Aşamasının Belirlenmesi Deneyi

Hücre çoğalması, başarılı bir hücre bölünme döngüsüne bağlıdır ve bu süreç hücre canlılığı ve ölümü ile sıkı bir biçimde kontrol edilmektedir. Aksi takdirde hücre çoğalması kontrolden çıkmakta ve kanser gelişmektedir (238). Hücre döngüsü G1, S, G2 ve M olmak üzere 4 fazdan oluşmaktadır. S fazında DNA replikasyonu gerçekleşmekte, M fazında hücre bölünmektedir. G1 ve G2 fazları ise ara fazlar olarak kabul edilmektedir. G0 fazı, hücrelerin yüksek hücre yoğunluğu ya da mitojen yokluğuna cevap olarak hücre bölünme döngüsünün durakladığı ya da hücrelerin senesense girmesi ve ya nöronlar ve miyositler gibi kalıcı olarak farklılaşması sonucu tamamen durduğu fazdır (239, 240). Hücre döngüsü fazları Şekil 3.7.’de gösterilmiştir.

Şekil 3.7. Hücre döngüsü fazları (241).

DOX muamelesi sonucu hücrelerin hangi hücre döngüsü safhasında bulunduğunun saptanması amacıyla Tali^® hücre döngüsü kiti kullanılmıştır.

Öncelikle hücreler 6 kuyucuklu plakalara ekilmiştir (1×10⁵ hücre/kuyucuk).

Hücrelerin doluluğa ulaşmalarının ardından hücrelere 50, 200 ya da 800 nM derişimde DOX uygulaması yapılmış ve hiç ajan ile karşılaşmayan hücreler kontrol olarak kabul edilmiştir (n=3). 48 saat inkübasyon sonrasında hücreler tripsinlenmiş ve 25°C sıcaklıkta, 500 × g’de 5 dakika santrifüj edilmiştir. PBS ile yıkama aşamalarının ardından hücreler 4°C’de ve 1000 × g’de 5 dakika santrifüj edilmiştir.

Pellet kısmı kontrol örnekleri için PBS’de; diğer örnekler için ise Triton X-100, PI ve RNaz içeren Tali^® hücre döngüsü çözeltisi ile yeniden süspanse edilmiştir. Oda sıcaklığında 30 dakika bekletilmelerinin ardından 25’er μL olmak üzere örnekler, özel kuyucuklu örnek slaytlarına yüklenerek Tali^® görüntü temelli hücre sayıcı ile analiz edilmiştir. Bu deneyin sonuçları ModFit LT 4.1 yazılım programı ile değerlendirilmiştir.

3.2.7. H2O2 Düzeyinin Ölçülmesi

Kanser hücrelerinde, elektron taşıma zinciri enzimlerinin aşırı reaksiyonu ile yüksek miktarda ROS üretilmesi sebebiyle H2O2 miktarı sağlıklı hücrelere kıyasla daha fazladır (242). Buna ek olarak, O2•− radikalini H2O2 radikaline dönüştüren SOD enziminin aşırı ekspresyonu da hücre içinde H2O2 miktarında artışa yol açmaktadır (243, 244).

Hücrelerin besiyeri ortamına saldıkları H2O2 düzeyinin belirlenmesi için kolorimetrik OxiSelect™ H2O2 deney kiti tercih edilmiştir. Bu kit, sulu örneklerde sorbitol peroksitinin peroksil radikaline dönüştürülmesi; peroksil radikalinin de AFS ayıracındaki Fe²⁺’yi Fe³⁺’e yükseltgemesi esasına dayanmaktadır. Daha sonra Fe³⁺

asit ortamında, eşit molar miktardaki ksilenol turuncusu ile reaksiyona girmekte ve 540-600 nm’de maksimum absorbans gösteren mor renkli ürünü oluşturmaktadır.

Sorbitol + OH^• → Sorbitol^• + H2O

Sorbitol^• + O2 → Sorbitol^•O2 → Sorbitol (keto) + HO2•

Fe²⁺ + HO2• → Fe³⁺ + H2O2

Bu deney için öncelikle MCF-7 ve MDA-MB-231 hücreleri 6 kuyucuklu plakalara her bir kuyucukta 1×10⁵ hücre olacak şekilde ekilmiş ve besiyeri ortamında çoğaltılmıştır. Hücreler doluluğa ulaştığında, önceden belirlenen dozlarda DOX uygulaması yapılmıştır. 48 saat süresince ajan ile inkübasyonun ardından hücreler tripsin muamelesi ile flask tabanından ve birbirlerinden ayrılmıştır. Hücrelerin 10 dakika süresince oda sıcaklığında 250 × g’de santrifüj edilmelerinin ardından süpernatan steril bir ependorfa aktarılmış ve 10000 × g’de 5 dakika santrifüj edilerek çözünmeyen kısmın çökmesi sağlanmıştır. Elde edilen süpernatan, örnek olarak değerlendirilerek deney gerçekleştirilmiştir.

200 μM derişime kadar artan düzeyde H2O2 içeren 10 adet standart hazırlanmış ve 96 kuyucuklu bir plakada belirlenen kuyucuklara en az n=2 olacak şekilde 25 μL uygulanmıştır. Plaka tasarımına uygun biçimde örnekler de en az n=3 olmak üzere 25 μL eklenmiştir. Örnek ya da standart içermeyen; sadece dH2O içeren kuyucuklar kör olarak kabul edilmiştir. Daha sonra her kuyucuğa 1:100 oranında ksilenol turuncusu, 1:40 oranında sorbitol ve 1:100 oranında AFS ayıracı içeren çalışma çözeltisinden 250 μL uygulanmıştır. Plaka, çalkalayıcı üzerinde 30 dakika süresince oda sıcaklığında çalkalanarak inkübe edilmiştir. Bu sürenin bitiminde 595 nm dalga boyunda absorbans ölçülmüştür. Örneklerdeki H2O2 derişimi, standart eğri denkleminden yararlanılarak hesaplanmış ve kontrol ile kıyaslanmıştır.

3.2.8. Protein Miktar Tayini

Hücrelerdeki total protein düzeyinin tayin edilmesinin yanında, kaspaz 8/9 ve sitokrom c deneylerinden elde edilen sonuçların protein miktarlarına uygun olarak normalize edilmesi amacıyla BCA protein miktar tayini deneyi gerçekleştirilmiştir.

BCA deneyi, oda sıcaklığında sistein, sistin, tirptofan ve tirozin amino asit kalıntılarının Cu2+’ı Cu1+’a indirgemesi esasına dayanmaktadır. Daha yüksek sıcaklıklarda (37-60°C), proteinlerdeki peptit bağlarında da bu indirgenme reaksiyonu gerçekleşmektedir. Böylece her bir Cu1+ iyonu BCA çözeltisi ile 562 nm dalga boyunda maksimum absorbans gösteren mor renkli kompleksi oluşturmaktadır.

Bu deney için öncelikle 2000 μg/mL kadar artan derişimlerde 8 adet standart hazırlanmış ve 96 kuyucuklu bir plakada belirlenen kuyucuklara en az iki tekrar olacak biçimde 25 μL uygulanmıştır. Örnek için belirlenen kuyucuklara ise lize edici tampon ile muamele edilmiş örneklerden de 25 μL aktarılmıştır. Daha sonra kuyucuklara 1:50 oranında bakır sülfat (CuSO4) içeren B ve bikinkoninik asit içeren A ayıraçlarının karışımdan oluşan çözeltiden 200 μL eklenmiştir. Plakanın 37°C’de 30 dakika süresince inkübe edilmesinin ardından 562 nm dalga boyunda standart ve örneklerin verdiği absorbans değerleri tespit edilmiştir. Standart kuyucuklarından elde edilen absorbans değerleri ile standart eğri grafiği ve denklemi elde edilmiştir.

Bu denklem yardımıyla da örneklerdeki protein miktarı hesaplanmıştır.

3.2.9. Sitokrom c Salınım Düzeyinin İncelenmesi

Çeşitli apoptotik uyarıların etkisi ile mitokondri dış zar geçirgenliğinin artması sonucunda, mitokondriden sitokrom c salınımı gerçekleşmektedir. Sitokrom c de Apaf-1’e katılmak suretiyle apoptozom yapısı oluşturmakta ve belirli kaspazları aktive ederek sonunda apoptoza yol açmaktadır (245). Bu nedenlerden ötürü apoptozun ileri tayini ve hücrelerin izlemiş olduğu apoptotik yolağın saptanması amacı ile sitokrom c düzeyinin ölçülmesi amaçlanmıştır.

DOX ile muamele edilmiş olan hücrelerdeki sitokrom c düzeyinin belirlenebilmesi maksadıyla sitokrom c miktar tayin kiti tercih edilmiştir. Bu kit, şerit halindeki kuyucuklara tutturulmuş olan primer antikora sitokrom c’nin

bağlanmasının ardından ikincil antikorun ve yabanturbu peroksidazı (horseradish peroxidase, HRP)’nın eklenmesi ile substratın işaretlenmesi esasına dayanmaktadır.

Renksiz substrat peroksidaz aktivitesi ile maviye dönüşmekte ve miktar tayini kontrole kıyasla yapılabilmektedir.

MCF-7 ve MDA-MB-231 hücreleri steril 6 kuyucuklu plakalarda kültür edilmiş (1×10⁵ hücre/kuyucuk) ve hücrelerin doluluğa ulaşmalarını takiben hücreler 800 nM derişimdeki DOX ile muamele edilmiştir. 24 saat inkübasyon sonrasında hücreler tripsinlenip santrifüj edilmiştir. Örneklere, örnek hacminin 1/10’u kadar hacimde kit dahilindeki deterjandan eklenmiştir. Hemen karıştırıldıktan sonra final derişimi 1X olacak biçimde bloke edici tampon uygulanmıştır. Örnekler 20000 × g’de 20 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatan toplanıp steril yeni bir tübe aktarılmış ve oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir. Bu örneklerden primer antikor içeren kuyucuklu şeritlere, 200 μL eklendikten sonra sitokrom c’nin primer antikora bağlanması için 3 saat boyunca oda sıcaklığında bekletilmiştir. Kuyucuklar yıkama çözeltisi ile yıkanarak bağlanmamış antijenler uzaklaştırıldıktan sonra ikincil antikoru içeren inkübasyon çözeltisinden her bir kuyucuğa 200 μL uygulanmıştır. 1 saat bekleme süresinin ardından kuyucuklar yeniden yıkama çözeltisi ile yıkanmış ve kuyucuklara 200 μL HRP’li bekleme çözeltisi eklenmiştir. 1 saat inkübasyon ve yıkama işlemi sonrasında kuyucuklara 200 μL okuma çözeltisi uygulaması yapılmıştır. En son örneklerin oda sıcaklığında, 600 nm dalga boyunda kinetik olarak absorbansları ölçülmüştür. Elde edilen veri, BCA deneyi yardımıyla protein miktar tayini yapıldıktan sonra normalize edilmiş ve sitokrom c salınımı kontrol ile kıyaslanmıştır.

3.2.10. Kaspaz 8 Düzeyinin İncelenmesi

DOX’un belirlenen iki meme kanseri hücresinde hangi mekanizma ile apoptozu tetiklediğinin gösterilmesi amacıyla hem kaspaz 8 hem de kaspaz 9 tayin testlerine başvurulmuştur.

Kaspaz 8 tayin kiti, izolösin-glutamat-treonin-aspartat (IETD) dizisinin tanınması temeline dayanmaktadır. Kaspaz 8 IETD dizisini tanıyarak IETD - p-nitroanilin (pNA) substratını kesmekte, serbest halde kromofor özelliğine sahip olan

pNA düzeyi ve dolayısıyla kaspaz 8 aktivitesi 400 nm dalga boyunda absorbans ölçümü ile saptanabilmektedir.

Bu deney için steril 6 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 1×10⁵ sayıda MCF-7 ya da MDA-MB-231 hücresi ekilmiş ve hücreler, doluluğa ulaşıncaya kadar uygun besiyeri ortamında inkübe edilmiştir. Belirlenen dozlarda DOX’a 6 ve ya 24 saat süresince maruz bırakılan hücreler, bu sürenin sonunda tripsinlendikten sonra 250 × g’de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Pellet kısmı PBS ile yıkadıktan sonra yeniden santrifüj edilip çöktürülmüştür. Örnekler 50 μL soğuk lize edici tampon ile muamele edilmiş ve homojen hale getirilmiştir. 20 – 30 dakika süresince buz üzerinde bekletilmelerinin ardından örnekler 4°C’de 15 dakika 10000 × g’de santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatan kısım yeni steril ependorflara aktarılmış ve bu örnekler deney sırasında buz üzerinde muhafaza edilmiştir. Örneklerden 96 kuyucuk içeren bir plakaya, plaka tasarımına uygun şekilde her bir kuyucuğa 50’şer μL eklenmiştir. Kör olarak belirlenen kuyucuklara ise 50 μL lize edici tampon konulmuştur. Örnek ve kör kuyucuklarının her birine 10 mM final derişim olacak şekilde ditiyotreitol (DTT) içeren reaksiyon tamponu ilave edilmiş ve plaka çalkalanarak deney ortamının homojen olması sağlanmıştır. En son her bir kuyucuğa son derişimi 200 μM olacak şekilde IETD-pNA substratı eklenip karıştırıldıktan sonra plaka 37°C’de 2 saat inkübe edilmiştir. 400 nm dalga boyunda örneklerin absorbansları ölçülmüş ve BCA deneyinin sonuçları ile normalizasyon hesaplamaları yapılmıştır. Normalize edilmiş sonuçların kontrol ile kıyaslanması sayesinde kaspaz 8 düzeylerinin kontrole göre değişim gösterip göstermediği; değişim varsa hangi oranda olduğu incelenmiştir.

3.2.11. Kaspaz 9 Tayin Deneyi

Kaspaz 9 miktar tayini kiti, kapsaz 9’un lösin-glutamat-histidin-aspartat (LEHD) dizisini tanıyarak LEHD-pNA substratını kesmesi sonucu serbest pNA düzeyi ile orantılı biçimde aktivitesinin incelenmesine dayanmaktadır.

Kaspaz 8 deneyi ile aynı şekilde hücreler 6 kuyucuklu plakalara ekilip DOX muamelesi ile apoptoz tetiklendikten 6 ve ya 24 saat sonra hücreler tripsinlenmiş ve santrifüj edilmiştir. Her bir örnekteki hücre sayısının 2 – 5×10⁶ olduğundan emin

olunduktan sonra hücreler 50 μL soğuk lize edici tampon ile muamele edilmiş ve 10 dakika buz üzerinde bekletilmiştir. Örnekler 1 dakika 10000 × g’de santrifüj edildikten sonra süpernatan yeni steril ependorflara aktarılmıştır. 96 kuyucuklu plakada belirlenen kuyucuklara 50 μL örnek ya da lize edici tampon eklendikten (kör) sonra her bir örnek ve kör kuyucuğuna 50 μL hacimde 10 mM final derişimdeki DTT içeren reaksiyon tamponu konulmuştur. Deney ortamındaki derişimi 200 μM olacak şekilde LEHD-pNA substratının eklenmesini takiben plaka 37°C’de 2 saat boyunca muhafaza edilmiş ve 400 nM dalga boyundaki absorbans ölçülmüştür. BCA protein miktar tayininden elde edilen sonuçlar ile normalizasyon gerçekleştirilmiş ve kontrol ile kıyaslama yöntemi ile örneklerde kaspaz 9 aktivitesinin hangi düzeyde olduğu araştırılmıştır.

3.2.12. MDR Deneyi

DOX’un MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinden P-gp aracılığıyla dışarı pompalanma düzeyinin ölçülmesi amacıyla MDR deneyi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla hücreler 96 kuyucuklu plakalara, her bir kuyucukta 5×10³ hücre olacak şekilde ekilmiştir. Yaklaşık %80 doluluğa ulaşmalarının ardından hücreler 50, 200, 400 ya da 800 nM derişimde DOX ile muamele edilmiştir ve 48 saat süresince inkübatörde inkübe edilmiştir. DOX uygulanmamış hücreler kontrol grubu olarak değerlendirilmiştir. Bu sürenin ardından, ajan uygulanmış belirli kuyucuklara P-gp inhibitörü olan verapamilden 15 µM eklenmiş ve 1 saat inkübe edilmiştir.

İnkübasyon süresinin sonunda hücrelere final derişim 0,25 µM olacak şekilde kalsein asetoksimetil ester (AM) uygulaması yapılmış ve 37ºC’de 30 dakika bekletilmiştir.

Kalsein AM, floresans özelliğe sahip değildir ancak; hücrenin içine girdiğinde endojen esterazlar tarafından kesilerek yüksek derecede floresans olan kalseine dönüşmektedir (Şekil 3.8.). Böylece hücrelerdeki floresans düzeyi dolaylı olarak hücrelerin hangi düzeyde ilaç direnci gösterdiğine işaret etmektedir. Direnç ne kadar kuvvetli ise, ölçülen floresans düzeyi o derecede düşük olacaktır. Örneklerin soğuk DMEM ile iki kez yıkanmalarının ardından en son 200 µL DMEM eklenmiş ve floresans düzeyi eksitasyon 485 nm, emisyon ise 520 nm olacak biçimde floresanslı plaka okuyucuda ölçülmüştür. Bu deney, her doz için 4 tekrar olacak biçimde tasarlanmıştır.

Şekil 3.8. Kalsein AM’nin hücre içinde endojen esterazlar tarafından kesilerek floresans özellik gösteren kalseine dönüştürülmesi.

3.2.13. Hücrelerden RNA Saflaştırılması

MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde apoptoz ve çoklu ilaç direnci mekanizmalarına ait belirli genlerin ekspresyonları üzerinde DOX’un tesirinin hangi yönde olduğunun saptanabilmesi amacıyla RT-PCR deneyinin gerçekleştirilmesine karar verilmiştir. Bu amaçla DOX’un farklı derişimleri ile muamele edildikten 48 saat sonra hücrelerin total RNA’ları saflaştırılmış, bu RNA’lardan cDNA sentezlenmiş ve en son cDNA örnekleri ile de RT-PCR yapılmıştır.

Öncelikle MCF-7 ve MDA-MB-231 hücreleri 6 kuyucuklu plakalara, her bir kuyucukta 1×10⁵ hücre olacak biçimde ekilmiş ve besiyeri ortamında çoğalmaları sağlanmıştır. İstenen hücre sayısına ulaşıldıktan sonra hücreler 50, 200, 400 ve 800 nM derişimde DOX ile muamele edilmiştir. 48 saat sürenin sonunda, satın alınmış olan kit ile RNA saflaştırması yapılmıştır. Öncelikle hücreler tripsin ile muamele edildikten sonra toplanıp 250 × g’de 10 dakika santrifüj edilmiştir. Pellet kısmına 1:100 oranında β-merkaptoetanol ve hücreleri lize edici tampon içeren çözeltiden 350 μL eklenmiş ve homojen hale gelmesi sağlanmıştır. Lizat filtreli toplama tüpüne aktarılmış ve 1 dakika süresince 11000 × g’de santrifüj edilmiştir. Filtrenin uzaklaştırılmasının ardından lizata 350 μL hacimde %70’lik alkol eklenmiştir.

Örnekler yine bir filtre kolonuna sahip toplama tüpüne uygulanmış ve 30 saniye boyunca 11000 × g’de santrifüj edilmiştir. Nükleik asitlerin tutunmuş olduğu silika zar yapısındaki filtreye sahip kolon kısmı yeni bir toplama tüpüne aktarılmış ve üzerine zarı tuzdan arındıracak tampondan 350 μL eklenmiştir. 1 dakika süresince 11000 × g’de santrifüj edilen örneklere 1/10 oranında seyreltilmiş olan stok DNaz uygulanmış ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek örnek içindeki DNA’ların sindirilmesi sağlanmıştır. Bu sürenin sonunda DNaz’ın aktivitesini inhibe etmek için örneklere 200 μL hacimdeki 2. tampondan eklenmiş ve 30 saniye, 11000

× g’de santrifüj edilmiştir. Örneklerin bulunduğu kolon yeni toplama tüpüne aktarıldıktan sonra örneklere saf etanol içeren 600 μL hacimdeki 3. tampon uygulanmış ve 2 dakika süresince 11000 × g’de santrifüj işleminin ardından kolon yeni bir toplama tüpüne aktarılmıştır. Bu işlemin bir kez daha gerçekleşmesini takiben kolon yeni bir toplama tüpüne oturtulmuş ve 60 μL RNaz içermeyen dH2O uygulaması yapılan örneklerin 1 dakika, 11000 × g’de santrifüj edilmeleri sağlanmıştır. En son toplama tüpü içinde saf total RNA örneği elde edilmiştir. Elde edilen RNA örneklerinin miktar ve saflık tayinleri nanospektrofotometre ile gerçekleştirilmiştir. Örnekler, cDNA sentezi yapılıncaya kadar - 86°C’de derin dondurucuda saklanmıştır.

3.2.14. RNA Örneklerinin cDNA’ya Dönüştürülmesi

Hücrelerden izole edilen RNA örneklerinin cDNA’ya dönüştürülmesi amacıyla cDNA Sentez kiti tercih edilmiştir. Bu doğrultuda, her bir örnek için Tablo 3.2.’de belirtilen 20 μL final hacimdeki deney ortamı hazırlanmış ve 42°C’de 1 saat ve 80°C’de 5 dakika olmak üzere örnekler inkübasyona bırakılmıştır. Bu inkübasyon aşamaları 96 kuyucuklu termal döngü cihazı yardımıyla gerçekleştirilmiştir. Elde edilen cDNA örnekleri - 20°C’de muhafaza edilmiştir. cDNA miktarları nanospektrofotometre yardımı ile ölçülmüştür.

Tablo 3.2. cDNA sentezi için hazırlanan 20 μL final hacimdeki reaksiyon ortamı.

Materyal Hacim (μL)

Total RNA 1-6 (200 ng)

D(T)23VN (50 μM) 2

M-MulV Reaksiyon Karışımı 10

M-MulV Enzim Karışımı 2

dH2O RNA miktarına göre değişken

Toplam 20

3.2.15. Genlerin Ekspresyon Düzeylerinin Belirlenmesi

MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinden saflaştırılmış olan total RNA’lardan elde edilmiş olan cDNA örnekleri, belirli apoptotik yolak ve çoklu ilaç direnci genlerinin ekspresyon düzeylerinin araştırılması için kullanılmıştır. Apopotik yolağın incelenmesi için TP53, Mdm2, Bax ve Bcl-2; çoklu ilaç direncinin tespiti maksadıyla ise Mdr-1 geni seçilmiştir. Referans gen olarak Gapdh tercih edilmiş ve Gapdh’ın ekspresyon düzeyi ile bu genlerinki normalize edilerek, DOX uygulamasının ardından ifadelenmelerinde bir farklılık olup olmadığının incelenmesi amaçlanmıştır.

İfadelenme düzeyi ölçülecek her bir gen için ileri ve geri primer tasarımında, Biyoteknoloji Bilgisi için Ulusal Merkez (National Center for Biotechnology Information, NCBI) veri tabanından yararlanılmıştır. Primer dizileri ile bu dizilerin erime sıcaklığı (melting temperature, Tm) ve guanin-sitozin yüzdesi Tablo 3.3.’de verilmiştir.

Tablo 3.3. RT-PCR reaksiyonu için tasarlanmış ve satın alınmış ileri ve geri primer dizileri ve bu dizilerin Tm ve %GC verileri.

Primer Primer Dizisi (5' → 3')

Erime Sıcaklığı (Tm, °C)

Guanin-Sitozin Yüzdesi

(%GC)

TP53 ileri CACCATGAGCGCTGCCTCAGATAG

C 67,60 60

TP53 geri ACAGGCACAAACACGCACCTCAAA 65,97 50

Mdm2

ileri AGGTCACTCCGATGAAAGGT 58,35 50

Mdm2

geri GTTGTCTAGTACCATTAACC 50,61 40

Bax ileri TTTCATCCAGGATCGAGCAG 57,39 50

Bax geri AAAGTAGAAAAGGGCGACAA 55,19 40

Bcl-2 ileri GTGTGTGGAGAGCGTCAACCGG 65,78 63,64

Bcl-2 geri TCAAACAGAGGCCGCATGCTGG 65,90 59,09

Mdr-1

ileri TTCAACTATCCCACCCGACCGGAC 66,03 58,33

Mdr-1

geri ATGCTGCAGTCAAACAGGATGGGC 66,01 54,17

Gapdh

ileri GTCGTATTGGGCGCCTGGTCAC 65,93 63,64

Gapdh

geri GCCAGCATCGCCCCACTTGATT 66,00 59,09

Her bir örnek ve gen için plaka tasarımına uygun biçimde Tablo 3.4.’de belirtilen reaksiyon ortamı hazırlanmıştır.

Tablo 3.4. RT-PCR deneyi için hazırlanan reaksiyon ortamı.

Materyal Final

SYBR Green Karışımı (2X) 1X

İleri Primer (10 μM) 1 μM

Geri Primer (10 μM) 1 μM

cDNA 100 ng

dH2O Değişken

Toplam 25 μL

Hazırlanan reaksiyon ortamları, RT-PCR deneyi için özgün olan 96 kuyucuklu reaksiyon plakasına yüklenmiştir. Plakanın RT-PCR cihazında 95°C’de 10 dakika inkübe edilmesinin ardından örnekler, 40’ar döngü olmak üzere 95°C’de 15 saniye ve 60°C’de 1 dakika bekletilmiştir. Sonuçlar kaydedildikten sonra gen ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi amacıyla, ilgili genlerin eşik döngüsü (treshold cycle, Ct) değerlerinden referans Gapdh geninin Ct değeri çıkartılarak ΔCt hesaplanmış ve ekspresyon düzeylerindeki değişim kat cinsinden ΔΔCt verileri kullanılarak elde edilmiştir. Bu deney her bir gen için en az n=3 tekrar olacak şekilde tasarlanmış ve gerçekleştirilmiştir.

3.2.16. İstatistiksel Analiz

Bütün istatistiksel analizlerde Microsoft Office Excel ve Graphpad Prism 5.0 yazılım programlarından yararlanılmıştır. DOX’un hücreler için IC50 değerleri non-lineer regresyon ile hesaplanmıştır. Canlılık yüzdelerinin kontrole kıyasla anlamlılığı tek-yönlü ANOVA testi ile araştırılmıştır. Geri kalan deneyler için kontrole kıyasla elde edilen değerlerde gözlenen farklılığın anlamlı olup olmadığı Mann Whitney-U testi ile incelenmiştir. Deney grupları arasında saptanan değişikliklerin anlamlı olup olmadığının değerlendirilmesi için ise iki-yönlü ANOVA testine başvurulmuştur. p değerinin 0,05’den daha küçük olması durumunda, gözlenen farkın istatistiksel