T.C.
HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DOKSORUBİSİNİN LUMİNAL A VE ÜÇLÜ NEGATİF MEME KANSERİ HÜCRELERİNDE P53 APOPTOZ
YOLAĞI VE ÇOKLU İLAÇ DİRENCİ ÜZERİNDE FARKLI ETKİLERİNİN İNCELENMESİ
Uzm. Bio. Selin ÖNCÜL
Biyokimya Programı DOKTORA TEZİ
ANKARA 2017
T.C.
HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DOKSORUBİSİNİN LUMİNAL A VE ÜÇLÜ NEGATİF MEME KANSERİ HÜCRELERİNDE P53 APOPTOZ YOLAĞI VE ÇOKLU İLAÇ DİRENCİ ÜZERİNDE FARKLI ETKİLERİNİN
İNCELENMESİ
Uzm. Bio. Selin ÖNCÜL
Biyokimya Programı DOKTORA TEZİ
TEZ DANIŞMANI Doç. Dr. Ayşe ERCAN
ANKARA 2017
ONAY SAYFASI
YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI
ETİK BEYAN
TEŞEKKÜR
Lisansüstü eğitimim süresince bilgisinden ve tecrübelerinden faydalandığım, insani ve ahlaki değerlerini örnek aldığım, birlikte çalışmaktan onur ve gurur duyduğum, hoşgörüsü ve desteği ile her zaman yanımda olan ve arkamda duran Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı üyesi saygıdeğer tez danışmanım Doç. Dr. Ayşe ERCAN’a,
Doktora eğitimi ve tez yazım sürecinin başından sonuna kadar göstermiş olduğu ilgisi ve hoşgörüsü için Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı Başkanı sayın Prof. Dr. Gülberk UÇAR’a,
Tez çalışmalarım esnasında, her aşamada desteğini hissetmiş olduğum, bilgisini ve deneyimlerini benimle paylaşan Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı üyesi değerli hocam Doç. Dr. Z. Tuba TÜYLÜ KÜÇÜKKILINÇ’a,
Tez çalışmalarımın başından sonuna kadar beni hiç yalnız bırakmayan, sevgi ve desteklerini benden hiç esirgemeyen çalışma arkadaşlarım ve dostlarım Yrd. Doç.
Dr. Kevser BİBEROĞLU, Arş. Gör. Açelya ERİKÇİ, Arş. Gör. İpek BAYSAL, Arş.
Gör. Beyza AYAZGÖK, Arş Gör. Melike YÜKSEL, Arş. Gör. Seda ÖNDER ve Ecz. Hamide Sena ÖZBAY’a,
Bu zorlu ve stresli dönemimde beni her daim destekleyen Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı öğretim üyeleri ve çalışanlarına,
15 sene boyunca bütün sevinç ve üzüntülerimi paylaşan, her koşulda olduğu gibi bu süreçte de beni sonuna kadar destekleyen, canım arkadaşım, dostum İlkcan AKKAYA’ya,
Hayatım boyunca beni kayıtsız şartsız destekleyen, her başarımın mimarı olan, hayattaki en büyük şanslarım canım Anneme ve canım Babama,
Teşekkürlerimi bir borç bilirim.
ÖZET
Öncül, S., Doksorubisinin Luminal A ve Üçlü Negatif Meme Kanseri Hücrelerinde p53 Apoptoz Yolağı ve Çoklu İlaç Direnci Üzerinde Farklı Etkilerinin İncelenmesi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Biyokimya Programı Doktora Tezi, Ankara, 2017. Meme kanseri, kadınlar arasında en sık tanısı konulan kanser türüdür. Apoptoz, nekroz ve hücre döngüsünün düzenlenmesi gibi çeşitli hücre sinyal iletim yolaklarının meme kanseri gelişimi üzerinde etkili olduğu bilinse de detaylı mekanizma henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu tez çalışmasında, kemoterapötik bir ajan olan doksorubisinin belirli düşük dozları, MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatlarına uygulanmıştır. Her iki hücre hattında da, doz ile ilişkili olarak ölümün gözlenmesinin ardından, baskın ölüm mekanizmasının anlaşılması amacıyla canlılık ve apoptoz tayin deneylerine başvurulmuştur. Özellikle MCF-7 olmak üzere bu iki hücre hattının da düşük doz doksorubisin ile muamele edilmesi sonucunda canlı hücre yüzdesinin belirgin biçimde düştüğü ve bu etkinin başlıca nekrozdan kaynaklandığı tespit edilmiştir. Apoptotik bir belirteç olan Bax/Bcl-2 oranının 800 nM ajana yanıt olarak MCF-7 hücrelerinde 2,74 kat, MDA-MB-231 hücrelerinde ise 1,74 kat artması ancak; apoptozun sitokrom c salınımı ve kaspaz 8/9 düzeyleri üzerinden gösterilememesi, bu dozların apoptozun baskın bir biçimde gözlenebilmesi için yeterli olmadığına işaret etmektedir. Çoklu ilaç direncinin kanser tedavisinde önemli bir engel olması sebebiyle hem ilacın hücre dışına atılımı hem de çoklu ilaç direnci geni Mdr-1’in ifadelenme düzeyi araştırılmıştır. MDA-MB-231 hücrelerinde ilaç direncinin göze çarpan biçimde yüksek olmasının, apoptoz ve nekroz olaylarından daha az etkilenmesine yol açan önemli bir etmen olduğu açıktır. Sonuç olarak mutant p53’e ve güçlü bir direnç potansiyeline sahip çoklu negatif MDA-MB-231 hücreleri üzerinde doksorubisinin klinik dozun altında uygulanan derişimlerinin etkisi belirgin bir biçimde daha düşüktür.
Anahtar Kelimeler: Meme kanseri, üçlü negatif meme kanseri, apoptoz, doksorubisin, çoklu ilaç direnci.
ABSTRACT
Öncül, S., Scrutinization of Different Effects of Doxorubicin on p53 Apoptotic Pathway and Multidrug Resistance in Luminal A and Triple Negative Breast Cancer Cells, Hacettepe University Institute of Health Sciences Biochemistry Programme Doctor of Philosophy Thesis, Ankara, 2017. Breast cancer is the most common diagnosed cancer type amongst women. Although it is known that cell signaling pathways such as apoptosis, necrosis, and regulation cell cycle are known to be influental on breast cancer development, the detailed mechanism is yet to be deciphered. In the present thesis, low doses of doxorubicin, a chemotherapeutic agent, were applied to MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines.
Subsequent to observation of death of both cell lines, viability and apoptosis designation assays were handled in order to determine the dominant death mechanism. After both cell lines were treated with low doses of doxorubicin, live cell percentages were dropped especially in MCF-7 and this effect was primarly caused by necrosis. Bax/Bcl-2 ratio which is an apoptotic marker was increased by 2,74 and 1,74 fold in MCF-7 and MDA-MB-231 cells, respectively although cytochrome c release and caspase 8/9 levels were not altered indicating that these doses are not enough to effectively initiate apoptosis. As multidrug resistance is an important obstacle in cancer treatment, both drug efflux from cells and expression level of a multidrug resistance gene, Mdr-1, were investigated. It was clear that conspicuously high levels of drug resistance is an important factor for MDA-MB-231 cells to be affected less by the events of apoptosis and necrosis. In conclusion, the effect of applied sub-clinical doses of doxorubicin on triple negative MDA-MB-231 cells which possess mutant p53 and vivid resistance potential is significantly subdued.
Key Words: Breast cancer, triple negative breast cancer, apoptosis, doxorubicin, multidrug resistance.
İÇİNDEKİLER
ONAY SAYFASI iii
YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv
ETİK BEYAN v
TEŞEKKÜR vi
ÖZET vii
ABSTRACT viii
İÇİNDEKİLER ix
SİMGELER ve KISALTMALAR xii
ŞEKİLLER xvi
TABLOLAR xix
1. GİRİŞ 1
2. GENEL BİLGİLER 4
2.1. Meme Kanseri 4
2.2. Antrasiklinler ve Doksorubisin 7
2.3. Apoptoz 10
2.4. Reaktif Oksijen Türleri ve Kanser 13
2.5. Sitokrom c Salınımı ve Kanser 17
2.6. Kaspazların Apoptoz Gelişimindeki Rolü 18
2.7. p53 ve Apoptotik Fonksiyonları 24
2.8. MDM2 Proteini ve p53 Üzerindeki Etki Mekanizması 27
2.9. BCL-2 Ailesi ve Proteini 29
2.10. Çoklu İlaç Direnci 32
3. GEREÇ ve YÖNTEM 37
3.1. GEREÇ 37
3.1.1. Hücreler 37
3.1.2 Kimyasal Maddeler ve Kitler 37
3.1.3. Cihazlar 38
3.2. YÖNTEM 40
3.2.1. Hücre Kültürü 40
3.2.2. Hücre Canlılığının Ölçülmesi 42
3.2.3 Laktat Dehidrogenaz Aktivite Deneyi 44
3.2.4. TUNEL Apoptoz Deneyi 46
3.2.5. Apoptoz Tayin Deneyi 47
3.2.6. Hücre Döngüsü Aşamasının Belirlenmesi Deneyi 48
3.2.7. H2O2 Düzeyinin Ölçülmesi 49
3.2.8. Protein Miktar Tayini 51
3.2.9. Sitokrom c Salınım Düzeyinin İncelenmesi 51
3.2.10. Kaspaz 8 Düzeyinin İncelenmesi 52
3.2.11. Kaspaz 9 Tayin Deneyi 53
3.2.12. MDR Deneyi 54
3.2.13. Hücrelerden RNA Saflaştırılması 55
3.2.14. RNA Örneklerinin cDNA’ya Dönüştürülmesi 56
3.2.15. Genlerin Ekspresyon Düzeylerinin Belirlenmesi 57
3.2.16. İstatistiksel Analiz 59
4. BULGULAR 61
4.1. SRB Deneyi Sonuçları 61
4.2. LDH Düzeyi Ölçüm Sonuçları 64
4.3. TUNEL Apoptoz Deneyi Sonuçları 67
4.4. Apoptoz Tayin Deneyi Sonuçları 68
4.5. Hücre Döngüsü Deneyi Sonuçları 72
4.6. H2O2 Düzeyinin DOX Uygulanan Meme Kanseri Hücrelerindeki Değişimi 77 4.7. Protein Miktar Tayini Sonuçları ve Normalizasyon 78 4.8. DOX Muamelesinin Ardından Hücrelerde Gözlenen Sitokrom c Salınım
Düzeyi 81
4.8. Kaspaz 8 Aktivite Düzeyinin Ölçülmesinden Elde Edilen Sonuçlar 84 4.9. Kaspaz 9 Aktivitesinin Meme Kanseri Hücrelerinde DOX Uygulaması
Sonrası Değişimi 87
4.10. DOX’un Hücrelerden Salınım Düzeyi 89
4.11. Hücrelerden Saflaştırılan RNA Örneklerinin Miktarı ve Saflık Düzeyi 93
4.12. Elde edilen cDNA Örneklerinin Derişimi 96
4.13. Hücrelerin Gen Ekspresyon Profili 96
5. TARTIŞMA 103
6. SONUÇ VE ÖNERİLER 109
7. KAYNAKLAR 111
8. EKLER
EK-1: Tez Çalışması ile İlgili Bildiriler ve Yayınlar 9. ÖZGEÇMİŞ
SİMGELER ve KISALTMALAR
ABB Anneksin bağlama tamponu
ABC ATP-bağlayıcı kaset
AM Asetoksimetil ester
Apaf-1 Apoptotik peptidaz aktive edici faktör 1 ATCC Amerikan tip kültür koleksiyonu
ATM Ataksi telenjiektazi mutasyonlu enzim BAD BCL-2 ile ilişkili ölüm promotoru
BAK BCL-2 homolog antagonist öldürücü
BAX BCL-2 ile ilişkili X proteini
BBB Kan beyin bariyeri
BCA Bikinkoninik asit deneyi
BCL-2 B-hücre lenfoması 2
BCL-xL Büyük B-hücre lenfoması
BH BCL-2 homoloji
BID BH3 ile etkileşen bölge ölüm agonisti
BIK BCL-2 ile etkileşen öldürücü
BIM BCL-2 benzeri protein 11
BOK BCL-2 ile ilişkili yumurtalık öldürücü protein
BRCA1 Meme kanseri 1
CARD Kaspaz aktivasyon bölgesi
Cdk Siklin bağımlı kinaz
CPR Sitokrom P450 redüktaz
Ct Eşik döngüsü
CTD Karboksil uç bölgesi
Da Dalton
DAB Diaminobenzidin
DBD DNA bağlanma bölgesi
DED Ölüm etki bölgesi
DISC Ölüm-indükleyici sinyal iletim kompleksi
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DOX Doksorubisin
DTT Ditiyotreitol
ECM Hücre dışı matriks
EDTA Etilendiamin tetraasetik asit
ER Östrojen reseptörü
ETC Elektron taşıma zinciri
FADD Fas-ilişkili ölüm bölgesi
Fas-L Fas ligandı
FBS Fetal sığır serumu
FDA Amerikan gıda ve ilaç dairesi GIST Gastrointestinal stromal tümör
HCl Hidroklorik asit
HER2 İnsan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 HPV-E6 İnsan papilloma virüs E6 proteini
HRP Yabanturbu peroksidazı
ICE İnterlökin-1β dönüştürücü enzim
IETD İzolösin-glutamat-treonin-aspartat
IL-1β İnterlökin-1β
IMM İç mitokondri zarı
IMS Zarlar arası bölge
kDa Kilodalton
LD Bağlayıcı bölge
LDH Laktat dehidrogenaz
LEHD Lösin-glutamat-histidin-aspartat
MCL-1 Miyeloid lösemi hücresi farklılaşma proteini 1 MDM2 Fare çift dakika 2 homoloğu
MDR Çoklu ilaç direnci
MOMP Mitokondriyel dış zar geçirgenliği
NBD Nükleotid bağlanma bölgesi
NCBI Biyoteknoloji bilgisi için ulusal merkez NCCN Ulusal kapsamlı kanser şebekesi
NCI Amerikan ulusal kanser enstitüsü
NES Çekirdekten ayrılma sinyal bölgesi NF- κB Çekirdek faktörü κB
NLS Çekirdek lokalizasyon sinyal bölgesi
NO Nitrik oksit
NSCLC Küçük olmayan hücre akciğer kanseri
OMM Dış mitokondri zarı
PBS Fosfat tamponlu salin
P-gp Geçirgenlik glikoproteini
PI Potasyum iyodür
PI3K Fosfoinozitid 3 kinaz
PLD Fosfolipaz D
pNA p-nitroanilin
PR Progesteron reseptörü
PRD Prolince zengin bölge
PS Fosfatidilserin
PUMA p53 ile ekspresyonu arttırılan apoptoz düzenleyicisi
RING Çok ilginç yeni gen
RNS Reaktif nitrojen türleri ROS Reaktif oksijen türleri
RT-PCR Eş zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu SMAC İkinci mitokondri türevi kaspaz aktivatörü
SOD Süperoksit dismutaz
SRB Sülforodamin B
TAD Transaktivasyon bölgesi
tBID Kesilmiş BID
TCA Trikloroasetik asit
TD Tetramerizasyon bölgesi
TdT Terminal deoksinükleotidil transferaz
TE Tris-EDTA
TKI Tirozin kinaz inhibitörleri
Tm Erime sıcaklığı
TMD Transmembran bölge
TMX Tamoksifen
TNBC Üçlü negatif meme kanseri
TNF Tümör nekroz faktörü
TNFR1 Tip 1 TNF reseptörü
TRADD TNF reseptörü-ilişkili ölüm bölgesi TRAIL TNF-ilişkili apoptoz indükleyici ligand
TUNEL Uç deoksinükleotidil transferaz dUTP kırık uç işaretleme
ŞEKİLLER
Şekil Sayfa
2.1. Dünya genelinde en sık gözlenen kanser türleri. 4 2.2. Meme kanseri tedavisinde başvurulan temel yöntemler. 5 2.3. Kanser tedavisinde kullanılan ve beş alt gruba kategorize edilen
kemoterapötik ajanlar. 6
2.4. Antrasiklinlerin temel kimyasal yapısı. 8
2.5. Doksorubisin hidroklorür’ün kimyasal yapısı. 10 2.6. DOX’un hücre içinde tetiklediği, hücreyi apoptoza yönlendiren
mekanizmaların özeti. 10
2.7. Temel apoptoz yolakları. 12
2.8. Hücrelerde ROS antioksidan mekanizmaları ve hücre içi ROS düzeyinin artması sonucu etkilenen başlıca hücresel bileşenler. 15
2.9. DOX’un indirgenme-yükseltgenme döngüsü. 16
2.10. Efektör kaspazların genel yapısı ve aktivasyonu. 20 2.11. Başlatıcı kaspazların genel yapısı ve aktivasyonu. 21 2.12. İntrinsik apoptotik yolakta kaspaz 9’un aktivasyonu ve rolü. 23 2.13. Kaspaz 8’in dahil olduğu DISC kompleksinin ekstrinsik apoptotik
yolağın tetiklenmesindeki etkisi. 24
2.14. p53’ün hücresel stres uyaranlarına yanıt olarak aktive olması sonrasında
etkilediği başlıca yolak ve gen ürünleri. 26
2.15. p53 proteinin genel yapısı. 27
2.16. MDM2 proteininin genel yapısı. 29
2.17. Yapılarındaki BH bölgelerine ve fonksiyonlarına göre başlıca üç alt
gruba ayrılan BCL-2 ailesi proteinleri. 30
2.18. BCL-2 proteinlerinin katıldığı apoptotik yolak mekanizmalarının özeti. 32 2.19. ABC taşıyıcılarının ATP hidrolizi ile çeşitli bileşenleri hücre dışına
pompalaması. 35
2.20. P-gp’nin genel yapısı. 36
3.1. MCF-7 (A) ve MDA-MB-231 (B) hücrelerinin ışık mikroskobu altındaki
görüntüleri (40X). 41
3.2. Tez kapsamında gerçekleştirilmiş olan deneyler. 42
3.3. Sülforodamin B’nin kimyasal yapısı. 43
3.4. SRB’nin zayif asidik oramda, bazik bir amino asit olan histidin kalıntısı
ile yaptığı bağ. 43
3.5. Laktat dehidrogenaz enziminin katalizlediği reaksiyon. 45 3.6. TUNEL deneyi ile apoptotik hücrelerin DNA kırıkları üzerinden
saptanması. 47
3.7. Hücre döngüsü fazları. 49
3.8. Kalsein AM’nin hücre içinde endojen esterazlar tarafından kesilerek floresans özellik gösteren kalseine dönüştürülmesi. 55 4.1. 48 saat süresince artan dozlarda DOX uygulanmış MCF-7 (A) ve MDA- MB-231 (B) hücrelerinin doza karşı % canlılık grafiği. 64 4.2. DOX muamelesinden 48 saat sonra MCF-7 (A) ve MDA-MB-231 (B)
hücreleri için gerçekleştirilen LDH aktivite deneyi sonuçlarına göre
hesaplanan yüzde sitotoksisite verileri. 67
4.3. 48 saat süresince 200 ya da 800 nM DOX uygulanmış olan MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinde apoptozun TUNEL deneyi ile kalitatif
olarak gösterilmesi. 68
4.4. 48 saat süresince DOX’a maruz bırakılan MCF-7 hücrelerinin doza göre
apoptotik, nekrotik ve canlı hücre yüzdeleri. 71
4.5. 48 saat süresince DOX ile muamele edilen MDA-MB-231 hücrelerinin doza bağlı apoptotik, nekrotik ve canlı hücre yüzdeleri. 71 4.6. MCF-7 (A) ve MDA-MB-231 (B) hücrelerinin 50, 200 ve 800 nM DOX
ile 48 saat boyunca muamele edilmelerinin ardından duraksadıkları hücre
döngüsü faz yüzde dağılımları. 77
4.7. 800 nM derişimde DOX’a 48 saat süresince maruz bırakılan hücrelerin besiyeri ortamına saldıkları H2O2 derişiminin kontrole kıyasla değişimi.
78
4.8. BCA deneyinde standart değerlerinden elde edilen standart eğri grafiği
ve denklemi. 79
4.9. 24 saat süresince DOX’a maruz bırakılan MCF-7 ve MDA-MB-231
hücrelerinde kontrole kıyasla sitokrom c salınım oranı. 84 4.10. DOX uygulanan MCF-7 ve MDA-MB-231 hücreleri için 6. ve 24.
saatlerde elde edilen kaspaz 8 aktivite oranları. 86 4.11. 6 ve ya 24 saat süre ile DOX ile inkübe edilen MCF-7 ve MDA-MB-231
hücrelerinde kaspaz 9 aktivitelerinin kontrol ile kıyaslanması. 88 4.12. 48 saat boyunca DOX ve/ve ya Verapamil ile muamele edilmiş MCF-7
hücrelerinde 485 nm eksitasyon ve 520 nm emisyonda ölçülen floresans
düzeyleri. 92
4.13. 48 saat boyunca DOX ve/ve ya Verapamil uygulaması yapılmış olan MDA-MB-231 hücrelerinde 485 nm eksitasyon ve 520 nm emisyonda
ölçülen floresans düzeyleri 92
4.14. 48 saat süresince düşük dozlarda DOX’a maruz bırakılmış MCF-7
hücrelerinde TP53 (A), Mdm2 (B), Bax (C), Bcl-2 (D), Bax/Bcl-2 (E) ve Mdr-1 (F) ekspresyon düzeylerinde saptanan değişiklikler. 99 4.15. 48 saat boyunca DOX uygulanan MDA-MB-231 hücrelerinde TP53 (A),
Mdm2 (B), Bax (C), Bcl-2 (D), Bax/Bcl-2 (E) ve Mdr-1 (F) ekspresyon
düzeylerinde saptanan değişiklikler. 102
5.1. DNA hasarına yanıt olarak p53 proteini ile hücre döngüsünün
düzenlenmesi. 106
TABLOLAR
Tablo Sayfa
2.1. Meme kanserinin gen ekspresyon profiline göre sınıflandırılması. 6
2.2. Bazı ABC taşıyıcıları ve fonksiyonları. 34
3.1. MCF-7 ve MDA-MB-231 hücre hatlarının başlıca özellikleri. 40 3.2. cDNA sentezi için hazırlanan 20 μL final hacimdeki reaksiyon ortamı. 57 3.3. RT-PCR reaksiyonu için tasarlanmış ve satın alınmış ileri ve geri primer
dizileri ve bu dizilerin Tm ve %GC verileri. 58
3.4. RT-PCR deneyi için hazırlanan reaksiyon ortamı. 59 4.1. Farklı dozlarda DOX’a 48 saat süresince maruz bırakılan MCF-7
hücrelerinin doza bağlı canlılık yüzdeleri, ortalama ve standart sapma
değerleri. 62
4.2. 48 saat boyunca farklı dozlarda DOX ile muamele edilen MDA-MB-231 hücrelerinin doza bağlı canlılık yüzdeleri, ortalama ve standart sapma
değerleri. 63
4.3. LDH aktivite deneyi sonucunda 340 nm dalga boyunda ölçülen absorbans
değerleri. 65
4.4. LDH aktivite deneyi sonrasındaki hesaplamalara göre yüzde sitotoksisite
değerleri. 66
4.5. DOX uygulanmış olan MCF-7 hücrelerinin apoptotik, nekrotik ve canlı hücre yüzde, ortalama ve standart sapma değerleri. 69 4.6. 48 saat süresince farklı dozlarda DOX’a maruz bırakılan MDA-MB-231
hücrelerinin apoptotik, nekrotik ve canlı hücre yüzde, ortalama ve
standart sapma değerleri. 70
4.7. 48 saat süresince artan dozlarda DOX’a maruz bırakılan MCF-7
hücrelerinin durakladıkları hücre döngüsü faz dağılımlarının yüzdesi. 73 4.8. 48 saat süresince artan dozlarda DOX’a maruz bırakılan MCF-7
hücrelerinin durakladıkları hücre döngüsü faz dağılımları. 74 4.9. 48 saat boyunca 50, 200 ya da 800 nM DOX’a maruz bırakılan
MDA-MB-231 hücrelerinin durakladıkları hücre döngüsü faz
dağılımlarının yüzdesi. 75
4.10. 48 saat süresince artan dozlarda DOX’a maruz bırakılan MDA-MB-231 hücrelerinin durakladıkları hücre döngüsü faz dağılımları. 76 4.11. 800 nM DOX ile inkübe edilen MCF-7 ve MDA-MB-231 hücrelerinin 48
saat sonunda besiyeri ortamına saldıkları H2O2 derişimi. 78
4.12. 2000 μg/mL’ye kadar artan derişimlerde 8 adet protein standartının 562 nm dalga boyunda ölçülen absorbans değerleri. 79 4.13. MCF-7 hücrelerinin 6 saat süresince 800 nM DOX’a maruz
bırakılmalarının ardından BCA deneyi ile ölçülen total protein
düzeyleri. 80
4.14. 6 saat boyunca 800 nM DOX uygulamasına maruz kalmış MCF-7
hücrelerinin kaspaz 8 aktivite düzeyi. 81
4.15. Hiç ajan uygulaması yapılmamış ya da 24 saat boyunca 800 nM
derişimdeki DOX ile birlikte inkübe edilmiş MCF-7 hücrelerinde sitokrom c salınım düzeyinin ölçüm deneyine ait ∆A600 ve ∆A600 /21
dakika değerleri. 82
4.16. 24 saat boyunca 800 nM DOX ile muamele edilmiş MCF-7 hücrelerinde sitokrom salınım düzeyine ait normalize değerler ve bu değerlerin örnek
değerlerine oranı. 82
4.17. Hiç ajan uygulanmamış ya da 24 saat boyunca 800 nM DOX uygulaması yapılmış MDA-MB-231 hücrelerinde sitokrom c salınım düzeyinin ölçüm deneyine ait ∆A600 ve ∆A600 /21 dakika değerleri. 83 4.18. 24 saat süre ile 800 nM DOX ile muamele edilmiş MDA-MB-231
hücrelerinde sitokrom c salınım düzeyine ait normalize değerler ve bu
değerlerin örnek değerlerine oranı. 83
4.19. 6 ve ya 24 saat süresince 800 nM derişimdeki DOX’a maruz bırakılan MCF-7 hücrelerinde kaspaz 8 aktivite tayini sonuçları. 85 4.20. 800 nM derişimdeki DOX’a maruz bırakılan MDA-MB-231
hücrelerinde 6. ve 24. saatlerde kontrole kıyasla ölçülen kaspaz 8
aktivite oranları. 86
4.21. 800 nM DOX ile muamele edilen MCF-7 hücrelerinde 6. ve 24. saat
kaspaz 9 aktivite oranları. 87
4.22. 6 ve ya 24 saat boyunca DOX’a maruz bırakılan MDA-MB-231
hücrelerinde kontrole kıyasla ölçülen kaspaz 9 aktivite oranları. 88 4.23. Sadece DOX ve hem DOX hem de Verapamil uygulaması yapılmış
MCF-7 hücrelerinde ölçülen 485 nm eksitasyon ve 520 nm emisyonda
ölçülen floresans düzeyi. 90
4.24. Sadece DOX ve hem DOX hem de Verapamil ile muamele edilmiş MDA-MB-231 hücrelerinde ölçülen 485 nm eksitasyon ve 520 nm
emisyonda ölçülen floresans düzeyi. 91
4.25. 48 saat süresince farklı derişimlerde DOX’a maruz bırakılan MCF-7 hücrelerinden elde edilen total RNA örneklerine ait 260 ve 280 nM dalga boyunda ölçülen absorbans, saflık ve miktar verileri. 94 4.26. Artan dozlarda DOX uygulaması yapılmış olan MDA-MB-231
hücrelerinden uygulamanın 48. saatinde saflaştırılan RNA örneklerine ait absorbans, saflık ve miktar tayin sonuçları. 95
4.27. MCF-7 hücrelerinin RNA’larından sentezlenen cDNA örneklerinin
miktarı. 96
4.28. MDA-MB-231 hücrelerinden izole edilen RNA’lardan elde edilen
cDNA örneklerinin miktar tayin sonuçları. 96
4.29. 48 saat boyunca faklı dozlarda DOX ile muamele edilen MCF-7 hücreleri için kontrole kıyasla gen ekspresyon düzeylerine ait ortalama
ve standart sapma değerleri. 98
4.30. 48 saat boyunca artan artan derişimlerde DOX’a maruz bırakılmış MDA-MB-231 hücrelerinin ajan uygulanmamış kontrol grubuna kıyasla gen ekspresyon düzeylerine ait ortalama ve standart sapma değerleri. 101
1. GİRİŞ
Meme kanseri, dünya genelinde kadınlarda en sık tanısı konulan hastalıklardan biridir (1). Gen ekspresyon profillerine, sahip oldukları reseptörlere, tedaviye cevap ve direnç özelliklerine göre belirli alt gruplara ayrılmış olan meme kanserine en uygun yaklaşımın tespit edilmesi, bu yaklaşım üzerinden hastanın tedavi sürecinin başlatılması ve ilerletilmesi son derece önem arzetmektedir. Bu süreç, ameliyat ve radyasyon uygulamasının yanı sıra sistemik kemoterapi, hormon uygulanması ve hedeflenmiş özgün tedaviler gibi hücre döngüsünün durmasına sebep olan ve apoptoz olarak da isimlendirilen programlı hücre ölümünü tetikleyen yöntemleri kapsamaktadır. Özellikle kemoterapi uygulamasında aktive edilen apoptoz mekanizmasının anlaşılması, kemoterapötik ajanın hücreler üzerinde nasıl ve hangi düzeyde etki gösterdiğinin belirlenmesi, tümör hedeflenmesinde en uygun ajanın saptanması açısından elzemdir.
Kemoterapinin yeterince başarılı olamamasındaki en büyük etkenlerden biri ilaç direncinin gelişmesi ve hücrenin çeşitli mekanizmalarla, birbirine yapı ya da hedef bakımından benzeyen ya da farklı olan ajanları hücreden dışarı pompalamasıdır (2, 3). Çoklu ilaç direnci (multiple drug resistance, MDR) olarak tanımlanan bu olgu, hücrelerin sitoplazmasında ilaç birikimini ve dolayısıyla ilacın hücre üzerindeki etkisini azaltmaktadır. MDR’nin önüne geçilmesi için, MDR’ye sebep olan genlerin baskılanmasının yanı sıra ajanların nanopartikül temelli sistemlerle uygulanması gibi birçok klinik ve farmakolojik çalışma yapılmaktadır (4).
Bu tezde, farklı gen profillerine sahip MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre hatları, güçlü bir kemoterapötik ajan olan ve meme kanseri dahil olmak üzere birçok kanser türünün tedavisinde hastaya uygulanan doksorubisin (DOX) ile muamele edilmiştir. Her iki hücre hattına da, tüm hücreleri öldürmek için gerekli dozun yarısı olan IC50 değerlerinin altında dozların uygulanmasına karar verilmiş ve bu düşük dozların, hücrelerin üzerindeki morfolojik, patolojik ve biyokimyasal etkileri araştırılmıştır.
Her iki hücre hattı da hücre kültürü ortamında çoğaltılmış ve daha sonra belirlenen sürelerde DOX ile muamele edilmiştir. 11 farklı derişimin ayrı ayrı uygulandığı hücrelerde ilk olarak canlılık düzeyi saptanmış ve IC50 değerleri hesaplanmıştır. Hücrelere uygulanacak DOX derişimleri seçilirken, bu derişimlerin her iki hücre hattı için de IC50 değerlerinin altında olmasına özen gösterilmiştir.
Hücrelerde bu ajanın sebebiyet verdiği ölümün tabiatının saptanabilmesi amacıyla apoptoz ve nekroz düzeyini belirlemeye yardımcı deneyler yapılmıştır. Öncelikle normalde hücrelerde total laktat dehidrogenaz (LDH) enziminin besiyeri ortamındaki aktivitesi ölçülerek, hücrelerin nekroz sonucu parçalanmaları ile içeriklerini besiyeri ortamına salma düzeyleri ölçülmüştür. Daha sonra kalitatif ve kantitatif tayin yöntemlerinden yararlanılarak apoptoz gözlenip gözlenmediği; eğer gözleniyorsa hangi düzeyde olduğu araştırılmıştır. Hücre döngüsünün DOX’a maruziyet sonrasında hangi safhada durdurulduğunun anlaşılması amacıyla gerçekleştirilen deneylerin ardından apoptotik yolağın belirlenmesi için sitokrom c düzeyinin yanı sıra kaspaz 8 ve 9’un aktiviteleri ölçülmüştür. Mitokondriden salınan sitokrom c düzeyinin ve dolayısıyla kaspaz 9 aktivitesinin artması, intrinsik apoptotik yolağın indüklendiğinin önemli bir göstergesi iken; kaspaz 8 aktivitesindeki tırmanış ise ekstrinsik apoptotik yolağın aktif hale geldiğine işaret etmektedir (5).
Apoptotik yolak mekanizmalarının gen düzeyinde de incelenebilmesi amacıyla TP53, fare çift dakika 2 homolog (mouse double minute 2 homolog, Mdm2), B-hücre lenfoması 2 (Bcl-2) ve Bcl-2 ile ilişkili X proteini (Bcl-2-associated X protein, Bax) genleri seçilmiş, 48 saat DOX uygulaması sonrasında ekspresyon düzeylerinin kontrole kıyasla değişip değişmediği üzerinde durulmuştur. Son olarak ilaç direncinin bu düşük dozlarda bile gelişip gelişmediğinin anlaşılması için ajanın uygulanmasından 48 saat sonra hücrelerden salınım düzeyleri ölçülmüş ve çoklu ilaç direnci çalışmalarında en çok üzerinde durulan P-glikoprotein (P-gp)’i kodlayan Mdr-1 geninin ifade düzeyi yine kontrol ile kıyaslanmıştır. Yapılan analizler, metastatik meme kanseri hastalarının %90’ından fazlasının kemoterapiye dirençli olduğunu ve 1 seneden daha kısa bir süre içinde kanserin yeniden nüksettiğini göstermektedir (6, 7). Daha önce gerçekleştirilen çalışmalar MDA-MB-231 hücrelerinde DOX’un klinik yönden anlamlı dozlarını, ilaç direnci ile ilişkilendirilmiştir (8, 9). Dolayısıyla düşük doz uygulamalarda bile MDA-MB-231
hücrelerinin, MCF-7 hücrelerine göre DOX’a daha fazla hücresel direnç göstermesi beklenmektedir.
Bu tez sonucunda elde edilen veriler ışığında, Luminal A meme kanseri alt grubuna ait, östrojen reseptörü (estrogen receptor, ER) ve progesteron reseptörü (progesterone receptor, PR)’ne sahip MCF-7 hücreleri ile ER ya da PR taşımamasının yanı sıra insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (human epidermal growth factor receptor 2, HER2)’yi de barındırmayan MDA-MB-231 hücrelerinin DOX’a verdiği yanıt değerlendirilmiştir. MDA-MB-231 hücreleri, bu 3 reseptöre de sahip olmaması sebebiyle çoklu negatif meme kanseri (triple negative breast cancer, TNBC) alt grubuna dahil edilmektedir. Bu hücreler aynı zamanda apoptotik yolağın başlıca elemanlarından olan TP53 genindeki mutasyon ile karakterizedir.
Elde edilen veriler ile düşük dozlarda DOX maruziyetine MCF-7 ve MDA- MB-231 hücrelerinin verdiği apoptotik yanıt ve ilaç direnci düzeyi aydınlatılmıştır.
Böylece DOX’a dayalı kemoterapinin, epitelyal adenokarsinoma olma özelliği taşıyan ancak; farklı gen ekspresyon karakteristiklerine sahip bu iki hücre hattı üzerindeki yıkıcı etkisi kıyaslanabilmiştir.
2. GENEL BİLGİLER 2.1. Meme Kanseri
Meme kanseri, gelişmekte olan ve gelişmiş ülkelerde akciğer kanserinden sonra en sık görülen ikinci; kadınlar arasında ise en sık tanısı konulan kanser türüdür (Şekil 2.1.) (10, 11). Meme kanseri görülme olasılığı ve prognozu erken tanıya ve risk faktörlerinin varlığına bağlıdır. Aile geçmişinde meme kanserinin görülmüş olması, obezite, sınırlı fiziksel aktivite, alkol kullanımı, uzun adet dönemleri, doğum kontrol haplarının kullanılması ve hiç çocuk sahibi olunmaması başlıca risk faktörleridir (12).
Şekil 2.1. Dünya genelinde en sık gözlenen kanser türleri (10).
Çok sık karşılaşılması ve göreceli olarak yüksek ölüm oranına sahip olmasından dolayı, meme kanserinin tedavisi üzerine birçok çalışma yapılmaktadır.
Diğer birçok kanser türü gibi, meme kanserinde de hücrelerin sahip olduğu özelliklere göre cerrahi yöntemler ile tümörün çıkartılmasının yanı sıra ameliyat öncesi (neo-adjuvan) ve sonrası (adjuvan) farklı tedavi süreçlerine başvurulmaktadır.
Bu süreçler Şekil 2.2.’de başlıklar halinde belirtilmiştir.
Şekil 2.2. Meme kanseri tedavisinde başvurulan temel yöntemler (13).
Meme kanseri, gen ekspresyon profiline göre luminal A, luminal B, bazal benzeri, düşük klaudinli ve HER2 olmak üzere başlıca 5 alt gruba ayrılmaktadır (14).
Alt gruplar, ER, PR ve/ve ya HER2’ye sahip olmaları ve kemoterapiye cevap verme düzeyleri gibi özelliklerine göre sınıflandırılmıştır ve bu alt gruplar Tablo 2.1.’de özetlenmiştir. Bazal benzeri ve düşük klaudinli meme kanseri alt grupları ER, PR ve HER’den yoksun oldukları için TNBC olarak tanımlanmaktadır. Bu alt gruplar özellikle hızlı çoğalma ve metastaz yeteneklerinden dolayı prognozun düşük olması ile karakterizedir (15, 16). Hormon reseptörlerinden bir ya da daha fazlasına sahip meme kanseri alt gruplarının tedavisinde kemoterapinin yanı sıra tamoksifen (TMX) gibi ajanlar ile hormon tedavisi ve HER2 içeren meme kanseri alt gruplarının tedavisinde trastuzumab gibi HER2’ye bağlanarak bloke eden ajanlar etkili olurken;
TNBC tedavisinde sadece kemoterapi faal biçimde ele alınabilmektedir (17).
Bu sınıflandırma sisteminin dışında 21 genin ekspresyon düzeyinin araştırıldığı Oncotype DX® ve 70 farklı genin ifadelenme düzeyinin incelendiği Mammaprint® gibi DNA mikroarray profillemesine dayanan genomik testler de
Kanser Tedavisi Neo-adjuvan
tedavi
Kemoterapi
Radyoterapi
Ameliyat Adjuvan
tedavi
Kemoterapi
Hormon tedavisi
Radyoterapi
İmmünoterapi
Hedeflenmiş tedavi
meme kanserinin erken evrelerde saptanması ve tedavi yönteminin belirlenmesi açısından önem taşımaktadır (18).
Tablo 2.1. Meme kanserinin gen ekspresyon profiline göre sınıflandırılması (14).
Meme Kanseri
Alt Grubu ER PR HER2 Örnek Hücre
Hattı
Luminal A + +/- - MCF-7
Luminal B + +/- + BT474
Bazal Benzeri - - - MDA-MB-
468
Düşük Klaudinli - - - MDA-MB-
231
HER2 - - + SKBR3
Kemoterapötik ajanlar, farklı karakteristik özelliklere sahip kanser hücrelerine etki edebilmeleri dolayısıyla kanser tedavisinde vazgeçilmez bir yer tutmaktadır. Köken ve etki mekanizmalarına göre başlıca 5 grup altında kategorize edilebilen bu ajanlar Şekil 2.3.’de özet halinde sunulmuştur.
Şekil 2.3. Kanser tedavisinde kullanılan ve beş alt gruba kategorize edilen kemoterapötik ajanlar (19).
İlk grup olan alkilleyici ajanlar hem çekirdek hem de mitokondri DNA’sına alkil grupları takarak hasara yol açmaktadır. Bu alkil grupları, DNA zincirlerinde
Kemoterapi
Alkilleyici ajanlar
Siklofosfamid, Dakarbazin
vb.
Topoizomeraz inhibitörleri
Kamptotesin, Doksorubisin
vb.
Antrasiklinler
Doksorubisin, Mitoksantron
vb.
Bitki alkaloidleri
Vinblastin, Paklitaksel vb.
Anti- metabolitler
5-Florourasil, Merkaptopürin
vb.
kırıklara ya da nokta mutasyonlara yol açabilmekte ve sonunda programlanmış hücre ölümünü tetiklemektedir (20). Topoizomeraz inhibitörleri ya topoizomeraz I ya da II’yi hedef almaktadır. Her iki tür de DNA replikasyonunu ve transkripsiyonu engellemekte ve DNA’nın süpersarmal yapısı oluşturmasının önüne geçmektedir.
Kampotesin, irinotekan ve topotekan gibi tip I inhibitörler DNA ile kompleks oluşturarak topoizomeraz aktivitesini bloke etmektedir (21-23). Tip II inhibitörler ise hücre döngüsünde S fazından G2 fazına geçişi engellemektedir. Etoposit ve teniposit tip II inhibitörler arasındadır (24, 25). Üçüncü grubu oluşturan antrasiklinler, daunozamin ve tetrahidronaftasenedion temelli, tüm hücre döngüsü fazlarına etki eden kemoterapötik ajanlardır. Genellikle lösemi, lenfoma, yumurtalık, akciğer ve meme kanserlerinin tedavisinde kullanılmaktadır (26, 27). Bitki alkaloidleri ise hücre döngüsünün özgün fazlarını hedefleyen, bitkilerden elde edilen alkaloidlerdir. Hangi hücre döngüsü fazına etki edeceği ise hangi bileşenin kullanıldığına göre değişmektedir. Bu ajanlar hücre bölünmesini baskılamakta ve dolayısıyla kanser gelişimi ve ilerlemesinin önüne geçmektedir (28). Vinblastin ve vinkristin cezayir menekşesi (Vinca)’nden elde edilmekte olup hücre döngüsünü M fazında bloke ederek tubulinlerin mikrotübül yapısını oluşturmasını engellemektedir (29). Son grup olan anti-metabolitler ise nükleik asit öncüleri olup, pürin ve pirimidinleri taklit etmek suretiyle DNA yapısına girerek hasara yol açmakta ve böylelikle DNA replikasyonu ve hücre bölünmesinin önüne geçmektedir (30). 5-florourasil’in örnek olarak verilebileceği bu ajanlar hızlı çoğalan hücrelerde etkili olup; özellikle akut ve kronik lösemi gibi hematolojik kanser türlerinin tedavisinde tercih edilmekte olsa da meme kanseri, gastrointestinal tümörler gibi türlerde de tedavi yöntemi olarak ele alınmaktadır (31, 32).
2.2. Antrasiklinler ve Doksorubisin
Antrasiklinler 1950’li yılların başlarından itibaren Streptomyces cinsine ait farklı bakterilerden aerobik fermentasyon yolu ile elde edilen doğal bileşenlerdir (33). Temel olarak tetrasiklik aglikon yapısına sahip ve bir ya da daha fazla aminoşeker (daunosamin) kalıntısı ile glikozillenmiş olan güçlü kemoterapötik ajanlardır (34).
Antrasiklinlerin kanser tedavisinde geniş çaplı olarak ele alınması, topoizomeraz II enzimini inhibe etme, serbest radikal oluşumuna sebep olma, DNA’yı alkilleme ve DNA’ya interkale olabilme özelliklerine dayanmaktadır (35).
Bu aktiviteleri büyük ölçüde, hücresel hedeflerin moleküler düzeyde tanınmasında görev gören şeker bileşenlerine dayanmaktadır (36). Antrasiklinlerin temel kimyasal yapısı Şekil 2.4.’de sunulmuştur.
Şekil 2.4. Antrasiklinlerin temel kimyasal yapısı (37).
Kemoterapötik ajan olarak kullanılan ilk antrasiklin, Streptomyces peucetius kolonilerinden izole edilen daunorubisin’dir (38). Yapılan çalışmalarda, daunorubisin’in yüksek düzeyde sitotoksik olması nedeniyle ve gösterdiği anti- kanser aktivitesinin arttırılması hedeflenerek, Streptomyces peucetius bakterileri N- nitrözo-N-metil üretan isimli mutajene maruz bırakılmış ve antibiyotik üreten yeni mutant bakteriler elde edilmiştir. Bu elde edilen mutant bakteri türü olan S. peucetius var. caesius kültüre edilmiş ve daunorubisin’in aglikon kromoforunun 14.
pozisyonuna hidroksil grubu takılmış olan ve ticari ismi Adriamycin™ olan DOX elde edilmiştir (Şekil 2.5.) (39).
Topoizomeraz II inhibitörü karakterine sahip olmasından dolayı DOX, Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (U.S. Food and Drug Administration, FDA) tarafından 1974 yılında onaylanmıştır ve o tarihten bu yana en güçlü anti-kanser ajanlarından biri olarak gösterilmektedir (40). Günümüzde akut lösemi, malin lenfoma ve meme kanseri gibi birçok kanser türünün tedavisi amacıyla klinikte
kullanılmaktadır (41, 42). DOX’u kapsayan adjuvan sitotoksik kemoterapi, Ulusal Kapsamlı Kanser Şebekesi (National Comprehensive Cancer Network, NCCN)’nin 2016 kılavuzunda belirtildiği üzere meme kanserine karşı standart bir tedavi yöntemi olarak kabul edilmektedir (43).
DOX etkisini, DNA sentezinin önüne geçerek, DNA hasarına yol açarak, reaktif oksijen türleri (reactive oxygen species, ROS)’nin oluşumunu indükleyerek ve hücrelerin zar yapısını bozarak göstermektedir (44-47).
Yapılan çalışmalarda DOX’un, hücrenin hayatta kalması için elzem olan ubikitin-proteozom sistemi ile düzenlenen proteomik değişiklikleri etkilediği gösterilmiştir (48, 49). Proteozomlar, siklinler, kaspazlar ve çekirdek faktörü κB (nuclear factor κB, NF- κB) gibi hücre döngüsünü ve apoptozu düzenleyen birçok hücre içi proteinin aktivitesi ve yıkımından sorumludur (50-53).
DOX, dokulara hızlı ve etkili bir şekilde nüfuz etmekte ve hücrelerin içine diğer birçok ilaç gibi pasif difüzyon ile girmektedir. DOX’un çekirdekli hücrelerin içinde kalabilmesi lipofilik özelliğe sahip olmasına ve DNA’ya interkale olabilmesine dayanmaktadır. Yüksek derecede nüfuz yeteneğine karşın bu ilaç, kan beyin bariyeri (blood-brain-barrier, BBB)’ni geçememektedir (45).
DOX’un 40 seneyi aşkın süredir etkin biçimde kanser tedavisinde kullanılması, kardiyotoksik özellik göstermesinden ötürü gölgelenmektedir. DOX’un kalp kası üzerindeki etkisi genellikle geri dönüşümsüz ve kümülatiftir. Bu nedenle hastalara uygulanan kümülatif DOX dozu genellikle 500 mg/m2’yi geçmemektedir (54). Maksimum dozun daha önceden uygulanmış olduğu hastalar, kanser tedavisine farklı bir anti-kanser ilacı ile devam etmektedir (55). DOX’un hücrede apoptoz gelişimine yol açtığı mekanizmaların özeti Şekil 2.6.’da şematize edilmiştir.
Şekil 2.5. Doksorubisin hidroklorür’ün kimyasal yapısı (37).
Şekil 2.6. DOX’un hücre içinde tetiklediği, hücreyi apoptoza yönlendiren mekanizmaların özeti (56).
2.3. Apoptoz
Birden çok hücreye sahip olan organizmalar, gerekli olmayan ya da hasarlı hücrelerin programlı olarak ölümünü kapsayan ve apoptoz olarak bilinen bir mekanizma ile öz dengelerini korumaktadır (57). Apoptoz, hücre ölümünün yüksek derecede korunmuş olan ve kontrol edilen bir türü olup; apoptotik hücre ölümü
mekanizmalarındaki düzenlemenin bozulması, kanser başta olmak üzere diyabet, otoimmün ve nörodejeneratif hastalıklar gibi çok çeşitli hastalıkların gelişmesine sebep olabilmektedir (58-60).
Her bir apoptoz yolağı, hücrelerin kendilerini çevreleyen hücre dışı matriks (extracellular matrix, ECM)’den ayrılması ile karakterize anoikis, mitokondriyel sinyaller (intrinsik yolak) ve ya hücre dışından gelen ölüm sinyalleri (ekstrinsik yolak) gibi farklı tetikleyiciler ile aktive edilmektedir (61).
Ekstrinsik apoptotik yolak, gelişim sırasında gerekli olmayan hücrelerin ortadan kaldırılması, bağışıklık sisteminin olgunlaşması ve ya bağışıklık sistemi tarafından düzenlenen tümör eliminasyonundan sorumludur (62). Bu yolak, tümör nekroz faktörü (TNF), Fas ligandı (Fas-L) ve TNF-ilişkili apoptoz indükleyici ligand (TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL) gibi hücre dışı ölüm ligandlarının, tip 1 TNF reseptörü (TNFR1), Fas ya da TRAIL reseptörleri gibi transmembran reseptörlere tutunması ile başlamaktadır (63). Ligandların reseptörlerine bağlanması, Fas-ilişkili ölüm bölgesi (Fas-associated death domain, FADD) ve TNF reseptörü- ilişkili ölüm bölgesi (TNF receptor-associated death domain, TRADD) gibi adaptör proteinlerin bağlanmasını tetiklemektedir. Pro-kaspaz 8’in de bağlanması ile ölüm- indükleyici sinyal iletim kompleksi (death inducing signaling complex, DISC) oluşmakta ve pro-kaspaz 8, aktif formu olan kaspaz 8’e dönüşmektedir. Kaspaz 8 ya BCL-2 homoloji (BCL-2 homology, BH) bölgesi 3 (BH3) ile etkileşen bölge ölüm agonisti (BID)’ni indükleyerek intrinsik apoptotik yolağı devreye sokmakta; ya da pro-kaspaz 3’ü aktifleştirerek kaspaz şelalesini başlatmakta ve hücreyi apoptoza götürmektedir (64). Temel apoptoz yolakları Şekil 2.7.’de gösterilmiştir.
Şekil 2.7. Temel apoptoz yolakları (65).
İntrinsik apoptotik yolak, reseptör sinyal iletiminden bağımsız olarak mitokondriyel uyaranlar ile gerçekleşen hücre içi sinyal iletimi sonucu devreye giren ve hücreyi ölüme götüren apoptotik yolaktır. Toksik maddeler, viral enfeksiyonlar ya da radyasyon gibi uyaranlar doğrudan intrinsik apoptotik yolağı tetiklerken; büyüme faktörlerinin kaybı, belirli sitokinler ve ya hormonlar hücre içinde apoptozu engelleyen faktörleri baskılayarak apoptozun aktivasyonuna neden olmaktadır (66).
İntrinsik yolak, apoptozu tetikleyen pro-apoptotik proteinler ve apoptozun önüne geçen anti-apoptotik proteinler olmak üzere başlıca iki gruba ayrılan proteinler tarafından sıkı bir biçimde kontrol edilmektedir. p53, BCL-2 ailesi üyeleri olan BCL- 2, BAX, BCL-2 ile ilişkili ölüm promotoru (BCL-2-associated death promoter,
BAD), BID ve ikinci mitokondri türevi kaspaz aktivatörü (second mitochondria- derived activator of caspase, SMAC) gibi proteinlerin düzenlenmesi sonucu apoptoz gelişebilmektedir. Apoptoza yönelecek hücrelerde, bu proteinlerin düzenlenmesi ile mitokondriyel dış zar geçirgenliği (mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP) artmaktadır (67). Sitokrom c proteini mitokondriden salınmakta ve ATP hidrolizi sonucu apoptotik peptidaz aktive edici faktör 1 (apoptotic protease activating factor 1, Apaf-1) ile bağ oluşturmaktadır. Apaf-1 ile inaktif kaspaz 9’un etkileşimi apoptozom yapısını oluştururken, kaspaz 9 aktive edilmekte ve daha sonra da kaspaz 3’ün aktivasyonu ile apoptoz tetiklenmektedir.
Apoptozu tetikleyen pro-apoptotik proteinler ve apoptozun önüne geçen anti- apoptotik proteinler arasındaki denge, hücrenin kaderini tayin eden ana unsurdur.
Örneğin pro-apoptotik bir protein olan p53 apoptozu tetiklerken; MDM2, p53’ün transkripsiyonel aktivitesini inhibe ederek anti-apoptotik bir karakter sergilemektedir (68). Benzer biçimde BAX pro-apoptotik bir özellik sergilerken; BCL-2 ailesinin bir diğer üyesi olan BCL-2, apoptozu inhibe etmektedir. Bax/Bcl-2 oranının değişmesi, hücrenin apoptoza yönelip yönelmeyeceğini belirlemektedir (69).
2.4. Reaktif Oksijen Türleri ve Kanser
ROS, genellikle ömürleri kısa olan, son derece aktif küçük moleküllerdir.
Süperoksit anyonu (O2•−) ve hidroksil radikali (OH•) gibi serbest radikallerin yanı sıra; hidrojen peroksit (H2O2) gibi radikal olmayan moleküller de ROS olma özelliği taşımaktadır. ROS, birçok aerobik metabolik süreçte üretilmekte ve bu üretilen ROS da lipid ve proteinlerin yanı sıra DNA ile etkileşime girmektedir (70). ROS, normal metabolizma kapsamında üretilse de hedefleri üzerindeki etkileri, hücre içindeki derişimlerine bağlıdır. Düşük düzeylerdeki ROS, hücre çoğalması/farklılaşması, apoptoz ve bazı sinyal iletim yolakları gibi belirli fizyolojik mekanizmaların düzenlenmesi için önemli iken; yüksek derişimleri ise sitotoksiktir (71-74). Hücre içinde ROS derişiminin artması, antioksidan savunma sistemleri ile önlenmektedir.
Bu sistemler arasında süperoksit dismutaz (SOD), katalaz, glutatyon peroksidaz gibi enzim reaksiyonlarının yanında C ve E vitaminleri, glutatyon, lipoik asit ve demir şelatlayıcılar yer almaktadır (75-78).
Oksidatif stres, hücrelerde antioksidan mekanizmaların etkisini gösterebileceğinden çok daha fazla düzeyde ROS ve nitrik oksit (NO) gibi reaktif nitrojen türevleri (reactive nitrogen species, RNS)’nin birikimi sonucu gelişmektedir.
Bu türler, aşırı miktarda birikim sonucu protein, lipit ve nükleik asitlerle etkileşime geçerek negatif etki gösterebilmektedir (79-82). Hücrelerde ROS’u hedef alan antioksidan mekanizmalar ve hücre içi ROS düzeyinin artması sonucu etkilenen başlıca hücresel bileşenler Şekil 2.8.’de özetlenmiştir.
ROS ve RNS, nükleik asitler ile direkt olarak etkileşerek mitokondri ve çekirdekte genomik stabiliteyi bozmakta ve kanser gelişebilmektedir (83, 84). Artan oksidatif stres, aynı zamanda hücrelerin hayatta kalması, çoğalması, anjiyojenez, apoptozun baskılanması ve ilaç/radyasyon direnci gibi çeşitli sinyal iletim yolakları tarafından düzenlenen mekanizmaların da aksamasına sebep olmaktadır (85-88).
Şekil 2.8. Hücrelerde ROS antioksidan mekanizmaları ve hücre içi ROS düzeyinin artması sonucu etkilenen başlıca hücresel bileşenler (89).
Yapılan çalışmalarda, DOX uygulaması sonrasında, moleküler oksijen varlığında, DOX’un semikinon süperoksit anyonu üretmek üzere yükseltgendiği rapor edilmiştir. Bu yolak, redoks döngüsünü tetiklemekte ve süperoksit anyonlarının birikimine yol açmaktadır. ROS düzeyleri aynı zamanda serbest hücresel demir miktarına göre artmakta ve demirin yükseltgenmesi ile artabilmektedir. Doksorubisin
– demir kompleksleri de toksik radikallerin oluşumuna yol açmakta ve mitokondriyel fonksiyonun bozulmasına neden olmaktadır (90). DOX ile indüklenen hücre içi oksidatif stresin antioksidan enzimler ile bertaraf edilmesi, kanser hücrelerinde apoptozu önlemekte; bu endojen antioksidanların baskılanması ise hücreleri DOX’a daha duyarlı hale getirmektedir ve hücreyi ölüme götürmektedir (91).
DOX’un indirgenme-yükseltgenme döngüsünde, DOX bir elektron alarak semikinon formuna dönüşmekte; semikinon radikali de moleküler oksijen ile etkileşerek süperoksit oluşumuna neden olmak suretiyle yeniden kinon formuna dönerek döngüyü tamamlamaktadır (92). Mitokondriyel elektron taşıma zinciri (electron transport chain, ETC)’nin ilk enzimi olan NADH dehidrogenaz ve sitokrom P450 redüktaz (CPR) gibi flavoprotein enzimler bu döngüde elektron taşıyıcısı olarak görev görmektedir (93-95). DOX gibi antrasiklinlerin bu döngüsü DNA hasarına yol açmakta ve kanser hücrelerinde p53 ile indüklenen apoptozu aktive etmektedir. Sonuç olarak bu döngü, antrasiklin temelli kemoterapinin etkili olabilmesi için önemli bir süreçtir (96). DOX’un redoks döngüsü Şekil 2.9.’da şematize edilmiştir.
Şekil 2.9. DOX’un indirgenme-yükseltgenme döngüsü (54).
2.5. Sitokrom c Salınımı ve Kanser
Sitokrom c, mitokondrinin iç zar boşluğunda bulunan, yaklaşık 12500 dalton (Da) ağırlığında, 104 amino asit kalıntısı içeren, yükseltgenme-indirgenmeye duyarlı ve suda çözünebilen küçük bir moleküldür (97). Üç boyutlu yapısı yüksek derecede korunmuş olan bu molekül, polipeptit zincirine kovalent bağlı bir hem prostetik grubu içermektedir. Sitokrom c esas olarak, mitokondri iç zarı (inner mitochondrial membrane, IMM)’ndaki ETC’de görev görmektedir (98). Elektronlar ubikinon:sitokrom c oksidoredüktaz (kompleks III)’dan sitokrom c oksidaz (kompleks IV)’a transfer edilirken sitokrom c geri dönüşümlü olarak indirgenip yükseltgenmektedir (99).
Sitokrom c, mitokondride ETC sistemindeki görevinin yanı sıra ROS üretiminde de rol oynamaktadır. Apoptozun erken safhalarında, mitokondriyel protein, lipid ve zarlarda yapısal ve fonksiyonel değişiklikler meydana gelmektedir.
Bunların en önemlilerinden biri, normal koşullarda IMM’nin matrikse bakan iç kısmında bulunan kardiyolipindir (100). Apoptoz öncesinde, IMM’nin iç yaprağına sıkıca bağlı olan bu lipid zarlar arası bölge (intermembrane space, IMS) ve dış mitokondri zarı (outer mitochondrial membrane, OMM)’na geçmektedir (101). Daha sonra kardiyolipin bu iki bölgede de farklı proteinler tarafından tanınmakta ve lipid peroksidasyonu aktive olmakta ve OMM’nin geçirgenliğinin artması ile pro- apoptotik faktörler salınmaktadır (102). Bu pro-apoptotik peroksidasyon reaksiyonu ROS’un yanı sıra sitokrom c ile de düzenlenmektedir. IMS’de normalde çok düşük düzeyde bulunan kardiyolipinin derişiminin artmasıyla, güçlü bir lipid peroksidaz olan sitokrom c’nin kardiyolipine olan yüksek ilgisi nedeniyle, kardiyolipin-sitokrom c kompleksi meydana gelmektedir (103). Oluşan kardiyolipin hidroperoksitleri sitokrom c’ye kardiyolipinden daha az affinite göstermektedir. Böylece kompleks ayrılmakta, serbest kalan sitokrom c orjinal konformasyonunu geri kazanmaktadır.
Kardiyolipin peroksidasyonu OMM’nin geçirgenliğini arttırmakta ve sitokrom c ve diğer pro-apoptotik faktörlerin zarlar arası boşluktan sitoplazmaya salınmasına yol açmaktadır. Apoptozun son safhalarında sitozolik sitokrom c, plazma zarında diğer bir anyonik fosfolipid olan fosfatidilserin (PS)’in peroksidasyonunu da
katalizlemekte ve böylece PS’nin iç zardan dış zara geçmesini tetikleyerek apoptotik hücrelerin makrofajlar tarafından tanınmasını kolaylaştırmaktadır (104-106).
2.6. Kaspazların Apoptoz Gelişimindeki Rolü
Geçmiş yıllarda, Caenorhabditis elegans nematodu ile yapılan çalışmalar CED-3 ve CED-4 genlerinin programlı hücre ölümü üzerinde ya başlatıcı ya da efektör etki gösterdiğini ortaya koymuştur. Daha sonra, CED-3’ün sistein proteaz etkisine sahip olduğu ve CED-3 proteininin insanlardaki interlökin-1β (IL-1β) dönüştürücü enzim (IL-1β converting enzyme, ICE) geni ile benzerlik gösterdiği tespit edilmiştir. Bugünkü ismi kaspaz 1 olan ICE’nin aşırı ekspresyonunun memeli hücrelerinde programlı hücre ölümünü tetiklemek için yeterli olması, bu gen ailesinin omurgalılarda apoptozun düzenlenmesinde görevli olduğuna işaret etmektedir (107- 110).
Kaspaz terimi, 1996 yılında Alnemri ve ark. (111) tarafından ilk kez kullanılmıştır. Bu terimin ‘C’ kısmı kaspazların sistein proteaz olmalarından; ‘aspaz’
kısmı ise aspartik asit kalıntılarından kesme özelliği göstermelerinden ileri gelmektedir. Şimdiye kadar memeli hücrelerinde 14 adet kaspaz tanımlanmıştır.
Özgün bölgelerden kesilmelerinin ardından aktifleşen bu enzimler, biyolojik fonksiyonlarına göre inflamatuvar kaspazlar (1, 4, 5, 11, 12) başlatıcı kaspazlar (2, 8, 9, 10) ve efektör kaspazlar (3, 6, 7) olmak üzere başlıca üç sınıfa ayrılmaktadır (112, 113).
Apoptoz sözcüğü ilk olarak Kerr ve ark. (114) tarafından iskemik karaciğer hasarında klasik nekrozdan farklı yapıların gözlenmesi ve incelenmesi sonucu ortaya atılmıştır. O tarihten bu yana apoptoz derin bir biçimde araştırılmış ve farklı apoptoz yolakları tespit edilmiştir. Hem intrinsik hem de ekstrinsik apoptotik yolaklar, kaspaz ailesi üyelerinin aktivasyonuna dayanmaktadır. Apoptoz aktivasyonu sonucunda da zarda kabarcıkların oluşması, DNA fragmentasyonu, PS’in zarın dış kısmına taşınması ve apoptotik cisimciklerin oluşması gibi fizyolojik ve biyokimyasal değişiklikler gözlenmektedir. Birçok kaspaz türü, ya proteolitik sinyal dönüştürücü olarak (başlatıcı) ya da hücresel öz dengenin korunması için gerekli substratlara etki ederek (efektör) apoptotik hücre ölümüne sebep olmaktadır (114-116).
Yapılan çalışmalarda, kaspazların birbirine çok benzer, yüksek derece korunmuş bir yapıya sahip olduğu kanıtlanmıştır. Kaspaz zimojenleri, N-uç pro- bölge ve katalitik bölge içeren, monomer ya da dimer halinde bulunabilen tek zincirli proteinlerdir. Aktivasyon ve/ve ya olgunlaşma sırasında katalitik bölge, büyük (α) ve küçük alt ünite (β) oluşturmak üzere kesilmektedir. Aktif formda kaspazlar, αββ'α' formunda dimerler oluşturmaktadır. Büyük alt ünite katalitik sistein ve histidin tekrar bölgeleri içerirken; küçük alt ünite substrat bağlanma oyuğu oluşturan belirli kalıntıları bünyesinde barındırmaktadır. Pro-bölge ve alt üniteleri birbirine bağlayan bağlanma bölgeleri ise genellikle olgunlaşma sırasında kesime uğrayan bölgelerdir (117, 118).
Efektör kaspazlar, protein etkileşim bölgelerinden yoksun inaktif dimerler halinde sentezlenmektedir. Büyük ve küçük alt üniteleri oluşturacak proteolitik kesim sonucu bu enzimler aktif hale gelmekte ve dimer arayüzüne doğru yeni oluşan uçların katlanması sonucu konformasyonel değişiklikler meydana gelmektedir.
Böylece olgun enzimde 17-20 kilodalton (kDa)’luk büyük ve 10-12 kDa’luk küçük ikişer adet aktif bölge oluşmaktadır (119). Efektör kaspazların genel yapısı Şekil 2.10.’da şematize edilmiştir.
Şekil 2.10. Efektör kaspazların genel yapısı ve aktivasyonu (120).
Başlatıcı ve inflamatuvar kaspazlar, 100’den fazla amino asit kalıntısı içeren pro-bölgelere sahipken; efektör kaspazlarda bu sayı genellikle 30’dan azdır. Başlatıcı kaspazların sahip olduğu uzun pro-bölgeler, ölüm etki bölgesi (death effector domain, DED), ve kaspaz aktivasyon bölgesi (caspase recruitment domain, CARD) gibi özgün motifler içermektedir. Pro-kaspaz 8 ve 10, ard arda dizili iki adet DED motifi içerirken; kaspaz 1, 2, 4, 5 ve 9 CARD bölgesine sahiptir. Bu bölgeler pro- kaspazlar ve düzenleyicileri arasındaki homofilik etkileşimlerde ve pro-kaspaz aktivasyonunda önemli görev görmektedir. Efektör kaspazların pro-bölgeleri ise protein-protein etkileşimlerinden ziyade kaspaz aktivasyonunu baskılamaktadır (118, 121, 122). Başlatıcı kaspazların genel yapısı ve aktivasyonu Şekil 2.11.’de sunulmuştur.
Şekil 2.11. Başlatıcı kaspazların genel yapısı ve aktivasyonu (116).
Kaspaz 9, intrinsik apoptotik yolakta başlatıcı kaspaz olarak görev gören önemli bir enzimdir. Pro-kaspaz 9 olarak sentezlenen bu enzim monomer halinde bulunmaktadır ve CARD motifi içeren uzun bir pro-bölgeye sahiptir (118). Kaspaz 9’un aktivasyonu için alt üniteler arasından proteolitik kesim yeterli değildir. Ancak otokatalitik kesime uğradıktan ve apoptozom yapısına bağlandıktan sonra aktive olabilmektedir. Apoptotik uyarılar sonucu mitokondriden sitokrom c’nin salınmasıyla Apaf-1 oligomerizasyonu tetiklenmektedir. Pro-kaspaz 9’un CARD motifinden Apaf-1’e bağlanması sonrasında dimerizasyona uğramasını takip eden otokatalitik reaksiyon ile aktivite olması sonucu apoptozom yapısı oluşmaktadır.
Kaspaz 9 aktive olduktan sonra efektör kaspazlar olan 3 ve 7’yi aktive etmekte; bu kaspazlar da hücre ölümünde anahtar roller oynayan belirli düzenleyici ve yapısal proteinleri yıkmaktadır (Şekil 2.12.) (123).
Kaspaz 8 ise ekstrinsik apoptotik yolakta, DISC yapısında FADD ile birlikte bulunmaktadır. FADD, C-ucunda ölüm bölgesi; N-ucunda ise DED motifi içeren adaptör bir proteindir. Pro-kaspaz 8, N-ucunda birbirini takip eden iki adet DED içeren bir zimojen olarak sentezlenmektedir. Pro-kaspaz 8, FADD’ın DED bölgesine bağlanmakta ve DISC yapısını oluşturmaktadır. Bir başka pro-kaspaz 8 de diğer bir DED bölgesine bağlanmakta ve böylece oligomerizasyon gerçekleşmektedir.
Sitokiyometri çalışmaları, bir FADD proteinine ortalama 6 adet pro-kaspaz 8’in bağlanabildiğini göstermiştir. Pro-kaspaz 8 moleküllerinin homodimerize olmasının ardından aktifleşmesi sonucunda olgun enzim meydana gelmektedir ve bu yolak belirli hücre tiplerinde (tip I) hücre ölümünün tetiklenmesi için yeterlidir (124, 125).
Kaspaz 8, direkt olarak kaspaz 3’ü aktive ederek ya da indirekt olarak BID’i keserek apoptoza yol açmaktadır (Şekil 2.13.) (126). Diğer tip (tip II) hücrelerde ise kaspaz 8 intrinsik yolak üzerinden mitokondri ile etkileşime geçmektedir. Fas-L-Fas reseptörü gibi diğer reseptörler, ekstrinsik apoptotik yolakta TNF-ligand-TNF-R1 ya da DR4/5-Apo2 L/TRAIL ligand komplekslerine katılmaktadır. İntrinsik yolak mitokondride devam etmekte ve sitokrom c’nin sitoplazmaya salınmasını tetiklemektedir. Sitokrom c, Apaf-1 ile etkileşmekte ve apoptozom yapısı üzerinden kaspaz-9’u dimerizasyon ile aktive etmektedir (127).
Şekil 2.12. İntrinsik apoptotik yolakta kaspaz 9’un aktivasyonu ve rolü (128).
Şekil 2.13. Kaspaz 8’in dahil olduğu DISC kompleksinin ekstrinsik apoptotik yolağın tetiklenmesindeki etkisi (128).
2.7. p53 ve Apoptotik Fonksiyonları
p53, 1979 yılında SV40 DNA tümör virüsü büyük T antijeni ile ilişkili bir protein olarak tanımlanmış olup birçok kanser türünde aşırı ekspresyona uğramasından kaynaklı olarak p53’ün öncelikle proto-onkojen olduğu düşünülmüştür (129-132). Yaklaşık 10 sene sonra p53’ün onkojenik özelliklerinin proteindeki
mutasyonlardan kaynaklandığı; p53’ün aslında tümör baskılayıcı özellik gösterdiği kanıtlanmıştır (133).
TP53 tarafından kodlanan p53 proteini, hücre döngüsünün düzenlenmesi, apoptoz ve DNA tamiri gibi birçok hücresel süreci kontrol etmektedir. TP53 geninin ekspresyonu, DNA hasarı, onkojen aktivasyonu, telomer kısalması, hipoksi, ribozom/endoplazmik retikulum stresi ve viral enfeksiyon gibi durumlarda indüklenmektedir (134-140) p53’ün hücresel stres uyaranlarına yanıt olarak aktive olması sonrasında etkilediği başlıca yolak ve gen ürünleri Şekil 2.14.’de özetlenmiştir.
Sağlıklı hücrelerde normal şartlar altında p53, MDM2 gibi p53’ün hücresel inhibitörleri ile düşük düzeylerde tutulmaktadır. MDM2, p53 proteininin ubikitinlenmesi ve bunu takiben proteozomal yıkıma uğramasını katalizleyen bir E3 ubikitin kinazdır. Hücresel stres durumlarında, p53 asetillenme ya da fosforillenme gibi post-translasyonel modifikasyonlara uğramakta ve p53-MDM2 etkileşimi bozularak p53 stabil ve aktif hale gelmektedir (141). Aktif p53, DNA’ya özgün dizilerden bağlanarak hücre döngüsü kontrol noktalarını düzenlemekte ya da senesens, apoptoz ve ya otofajiyi tetiklemektedir (142-146).
Kanser vakalarının %50’sinden fazlasında somatik p53 mutasyonu görülmektedir (147). p53 mutasyon oranı düşük olan kanser vakalarında ise p53 genellikle alternatif bir mekanizma ile baskılanmaktadır. Örneğin, serviks kanserinde p53, insan papilloma virüs E6 proteini (human papillomavirus E6 protein, HPV-E6) ile degredasyona uğratılabilmektedir (148). İnsanlardaki eşey hücrelerindeki p53 mutasyonları ise birçok kanser türünün gelişiminde önemli rol oynayan Li-Fraumeni sendromu gibi kalıtsal sendromlara yol açabilmektedir (149).
Şekil 2.14. p53’ün hücresel stres uyaranlarına yanıt olarak aktive olması sonrasında etkilediği başlıca yolak ve gen ürünleri (150).
Aktif halde homotetramer yapısında bulunan insan p53 proteini, N-uç transaktivasyon bölgesi (transactivation domain, TAD), prolince zengin bölge (proline-rich domain, PRD), DNA bağlanma bölgesi (DNA-binding domain, DBD), bağlayıcı bölge (linker domain, LD), tetramerizasyon bölgesi (tetramerization domain, TD) ve karboksil uç bölgesi (carboxyl terminal domain, CTD) bölgelerini içeren 393 amino asitlik bir proteindir (151). p53 tetramerleri, dimer-dimer topolojisine sahiptir. Her bir p53 tetramerizasyon bölgesi (325-355 kalıntıları arasında) kısa bir β- yapısı ile α heliksin sağladığı bir dönüşe sahiptir. Primer dimerler moleküller arası paralel olmayan β-tabaka ve α heliks yapılarıyla stabil halde korunmaktadır. Böyle iki dimer hidrofobik heliks-heliks ara bölge ile bir araya gelerek aktif tetramer yapısını oluşturmaktadır (152). Oligomerizasyon sonucu tetramerizasyon bölgesi içindeki lösince zengin çekirdekten ayrılma sinyalinin baskılanması ile p53’ün lokalizasyonu düzenlenmektedir (153). p53 proteininin monomer yapısı dahilindeki bölgeler Şekil 2.15.’de şematize edilmiştir.
Şekil 2.15. p53 proteinin genel yapısı (154).
2.8. MDM2 Proteini ve p53 Üzerindeki Etki Mekanizması
Mdm2 geni, ilk olarak transformasyona uğramış fare BALB/c hücre hattı olan 3T3-DM’de aşırı ekspresyona uğradığı zaman tanımlanmıştır (155, 156). MDM genleri, çift dakika olarak isimlendirilen küçük kromozom dışı çekirdek cisimciklerinde bulunmaktadır. Mdm2 geninin ürünü olan proteinin aşırı ifadelenmesinin daha sonra hücrelerin başkalaşmasında rolü olduğu saptanmıştır. Bu potansiyel, MDM2’nin tümör baskılayıcı p53’e bağlanması ve inhibe etmesinden kaynaklanmaktadır (157).
MDM2 proteini, başlıca p53 bağlanma bölgesi, ribozomal proteinlere bağlanma için önemli olan C4 çinko parmak yapısı içeren merkezi asidik bölge ve E3 ligaz aktivitesi gösteren çok ilginç yeni gen (really interesting new gene, RING) bölgesi olmak üzere yüksek derecede korunmuş üç kısım içermektedir (158).
MDM2, E3 ubikitin ligaz olarak fonksiyon göstermektedir ve p53’ün ubikitinlenmesi ve bozunmasından sorumludur. Ubikitinlenme, E1, E2 ve E3 enzimleri tarafından gerçekleştirilmektedir. E1, 76 amino asit kalıntısına sahip ubikitin proteinine bağlanmakta ve ubikitini aktive etmektedir. E2 ise aktif ubikitini, substrata kovalent olarak bağlanacak olan E3 ligaz enzimine transfer etmektedir.
MDM2 de p53’ü belirli lizin kalıntılarından ubikitinleyen bir E3 ligazdır (159). Bu enzim aynı zamanda kendini de ubikitinleyip yıkma kapasitesine sahiptir (160).
RING motifi, E3 ligazlarda sıkça görülmektedir ve MDM2’nin de E3 ligaz etkisinden sorumludur. RING motifi E2 enzimlerine bağlanarak hedef proteinlerin direkt olarak ubikitinlenmesini tetiklemektedir (161). Ubikitin, genel olarak proteinlere polimer formunda bağlanmaktadır. Önceden bağlanmış olan bir ubikitin molekülüne diğer ubikitinler tutunmakta ve bu sürece çoklu ubikitinlenme denilmektedir (162). Çoklu ubikitinlenme proteozomal yıkım için sinyal oluşturmaktadır. Bu durum, hedef proteine tek bir ubikitin bağlanması olarak tanımlanan tekli ubikitinlenmeden farklıdır. Tekli ubikitinlenmenin protein-protein etkileşimi, DNA tamiri ve transkripsiyonel düzenleme gibi çeşitli hücresel süreçlere katıldığı bilinmektedir. Böylece MDM2, p53’ün sadece ubikitinlenmesi değil aynı zamanda hücre içindeki yerinin belirlenmesi ve aktivasyonu üzerinde de etki göstermektedir. p53’ün sitoplazma ve çekirdek arasındaki hareketi MDM2’nin çekirdekten ayrılma sinyal (nuclear export signal, NES) ve çekirdek lokalizasyon sinyal (nuclear localization signal, NLS) bölgeleri tarafından kontrol edilmektedir.
MDM2’nin düşük düzeyleri, p53’ün tekli ubikitinlenmesine yol açmakta; bu durum p53’ün çekirdekten sitoplazmaya çıkartılmasını tetiklemekte ve p53’ün çeşitli transkripsiyon faktörleri ile etkileşmesinin önüne geçmektedir (163).
MDM2 proteininin, p53’ü başlıca yıkımını tetikleme ve transkripsiyonel aktivasyonunu bloke etme olarak iki mekanizma üzerinden baskıladığına inanılmaktadır. Yapılan çalışmalar, MDM2’nin E3 ligaz aktivitesi olmaksızın p53’e bağlanmasının p53’ü inhibe etmek için yeterli olmadığını göstermiştir. MDM-2’nin N-uç bölgesi p53 etkileşim bölgesine sahip olmakla beraber; ortada bulunan asidik bölgenin de p53 için ikinci bir bağlanma bölgesi sağladığı saptanmıştır. p53’ün, MDM2’nin N-uç bölgedeki p53 bağlanma bölgesine tutunması MDM2’nin konformasyonel değişikliğe uğraması ile sonuçlanmakta ve asidik bölgenin, p53’ün DNA bağlanma bölgesindeki ubikitinlenme sinyal bölgesine bağlanmasına yol açmaktadır (164). MDM2 proteininin genel yapısı Şekil 2.16.’da sunulmuştur.
