Yöntem

Deney hayvanları arasından rastgele seçimle her birinde n=7 sıçan olmak üzere toplam 9 grupta 63 adet sıçan kullanıldı.

2.2.1. Deney Grupları

Grup 1 (Kontrol Grubu): Bu grup hayvanlara deney süresi boyunca gavaj yoluyla SF verildi ve Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.

Grup 2 (Baicalein Grubu) : Bu grup deney hayvanlarına intragastrik olarak gavaj yöntemi ile

100 mg/kg Baicalein, Dimetil Sülfoksit (DMSO) içerisinde 33 mg/ml olacak şekilde çözdürülerek 7 gün boyunca uygulandı. Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.

Grup 3 (Etilen Glikol(EG) Grubu): Bu grup deney hayvanlarına Etilen glikol içme suyu içerisine hacim olarak % 1 olacak şekilde karıştırılarak 28 gün boyunca verildi. Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.

14

Grup 4 (Baicalein + EG Koruyucu grup): Bu grup deney hayvanlarına intragastrik olarak gavaj yöntemi ile 100 mg/kg Baicalein, Dimetil Sülfoksit (DMSO) içerisinde 33 mg/ml olacak şekilde çözdürülerek 7 gün boyunca uygulandı. Sonrasında bu grup deney hayvanlarına Etilen glikol içme suyu içerisine hacim olarak % 1 olacak şekilde karıştırılarak 28 gün boyunca verildi. Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.

Grup 5 (EG+ Baicalein Tedavi edici Grup): Bu grup deney hayvanlarına Etilen glikol içme suyu içerisine hacim olarak % 1 olacak şekilde karıştırılarak 28 gün boyunca verildi.

Sonrasında intragastrik

olarak gavaj yöntemi ile 100 mg/kg Baicalein Dimetil Sülfoksit (DMSO) içerisinde 33 mg/ml olacak şekilde çözdürülerek 7 gün boyunca uygulandı. Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.

Grup 6 (DMSO Kontrol Grubu) : Bu grup deney hayvanlara 7 gün boyunca intragastrik olarak gavaj yoluyla 1 ml DMSO verildi ve uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.

Grup 7 (hidroksi-L-Prolin (HP) Grubu): Bu grup deney hayvanlarına Hidroksi-L-Prolin içme suyu içerisine hacim olarak % 3 olacak şekilde karıştırılarak 28 gün boyunca verildi.

Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.

Grup 8 (Baicalein + HP Koruyucu grup): Bu grup deney hayvanlarına intragastrik olarak gavaj yöntemi ile 100 mg/kg Baicalein Dimetil Sülfoksit (DMSO) içerisinde 33 mg/ml olacak şekilde çözdürülerek 7 gün boyunca uygulandı. Sonrasında bu grup deney hayvanlarına Hidroksi-L-prolin içme suyu içerisine hacim olarak % 3 olacak şekilde karıştırılarak 28 gün boyunca verildi. Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.

Grup 9 (HP+ Baicalein Tedavi edici Grup): Bu grup deney hayvanlarına Hidroksi-L-prolin içme suyu içerisine hacim olarak % 3 olacak şekilde karıştırılarak 28 gün boyunca verildi.

Sonrasında intragastrik

olarak gavaj yöntemi ile 100 mg/kg Baicalein Dimetil Sülfoksit (DMSO) içerisinde 33 mg/ml olacak şekilde çözdürülerek 7 gün boyunca uygulandı. Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.

15

2.2.2. Deney planı ve uygulamalar

Deneylerimizde baicalein günlük olarak tek doz 1 hafta boyunca gavaj yöntemiyle verildi, Etilen glikol ve Hidroksi-L-prolin ise içme suyuna karıştırılarak verildi.

Her gruba ait sıçanlar idrar toplama kafeslerine konularak 12 saat bekletilerek idrarları toplandı.

Deneylerde kullanılan sıçanlardan cerrahi işlem sırasında kalplerinden yüksek miktarda kan alınarak yaşamları sonlandırıldı ve sonrasında böbrek dokusu ve kan örnekleri toplandı.

Böbrek dokusu tüm gruplarda diseksiyondan hemen sonra her bir hayvana ait sağ ve sol böbrekler üç kısma ayrılarak birinci kısım histolojik analizler için %10’ luk nötral buffer formalin fiksasyon sıvısına, ikinci kısım biyokimyasal analizler için polietilen tüplerde –80 C derin dondurucuya konuldu ve üçüncü kısım elektron mikroskopi görüntülenmesi için 0.1 M fosfat tampon içeren % 2.5’luk glutaraldehit içerisine konuldu.

2.2.2.1. Homojenatların hazırlanması

Böbrek doku örneklerinden 0,1 gr. tartılıp 0,3 ml PBS (pH 7,4) içerisine alındı. Buz içerisine alınan örnekler ultrasonik homojenizatör cihazında 8000 devirde 10 vuruda homojenize edildi. Daha sonra soğutmalı santrifüjde +4 oC’ de 3000 rpm’de 20 dakika santrifüj edildi.

Süpernatant kısmı ayrı bir viale alınarak ELISA ölçümleri yapılana kadar -80oC’ de saklandı.

2.2.2.2. Taş Belirteçlerinin Belirlenmesi

Böbrek dokusu, kan ve idrar örneklerinde taş oluşumunda etkili çeşitli belirteçlerin bulunabilmesi amacıyla protein mikroarray yöntemi uygulanarak, taşa özgün belirteçler belirlenmeye çalışıldı. Protein mikroarray yönteminde böbrek dokusu ve kanda Kim-1, NAG, NGAL, IL-18, Osteopontin gibi belirteçler ve proteinler tarandı. İdrarda ise KIM-1 ve kreatinin çalışıldı.

2.2.2.3. Böbrek Örneklerinden Histolojik Preparatların Hazırlanması

Ratlardan elde edilen sağ böbrekler boyuna ortadan ikiye bölünerek % 10’luk nötral tamponlu formaldehit içerisine alınarak 24 saat süreyle fikse edildi. Yıkamayı takiben sırasıyla artan etanol serisi (% 70, % 80, % 90 ve % 96) ve ksilolden geçirildikten sonra parafin içerisinde bloklandı. Alınan 4-5 mm kalınlığındaki kesitler genel histolojik inceleme için hematoksilin-eozin boyama tekniği ile boyandı. Kalsiyum çökeltilerini görebilmek amacıyla Von Kossa hazır boyama kiti kullanıldı. Elde edilen boyalı preparatlar binoküler ışık mikroskobu altında iki histolog tarafından değerlendirildi.

16

2.2.2.4. Geçirimli elektron mikroskop doku takibi (TEM)

Alınan örnekler zaman kaybetmeden 0.1 M fosfat tampon içeren % 2.5’luk glutaraldehit içinde 24 saat 4˚C’de primer fiksasyona alındı, sonra fosfat tamponuyla 3 kez 15’er dakika yıkandılar. Daha sonra 0.1 M fosfat tampon içeren %1’lik osmiyum tetroksit içinde, oda sıcaklığında ve rotatorda 2 saat sekonder fiksasyonları sağlanıp, devamında dokular tamponla tekrar 3 kez yıkandı. Dokudaki fazla suyun alınması (dehidrasyon) için örnekler giderek artan derecelerde ve 4˚C’de ikişer kez belirli sürelerde etil alkol serilerinden geçirildi (%30, %50,

%70, %90, %96, %100 (son yıkama ve sonraki işlemler oda ısısında) ve propilen oksitte 30 dk boyunca (iki kez) şeffaflaştırma işlemine alındı. 1/1 oranında propilen oksit- araldite karışımında 2 saat rotatorda bekletildikten sonra saf araldite alınan dokular bir gece boyunca rotatorda tutuldular ve ertesi gün araldite gömülerek 60˚C’de 48 saat polimerize edildiler.

Elde edilen bloklardan ultramikrotomda (Leica Ultracut R) 60 nm kalınlığında tam ince kesitler alındı. 300 meshlik bakır gridlere alınan bu kesitler uranil asetat-kurşun sitrat ile boyandıktan sonra JEOL JEM 1220 marka ve modeldeki TEM de incelenmeye alındılar.

2.2.2.5. İstatistiksel Analiz

Verilerin analizi IBM SPSS 21 Paket programı kullanılarak gerçekleştirildi. Verilere ait özet değerler ortalama±standart sapma olarak sunuldu. Değişkenlerin gruplar bazında normal dağılıma uygunluğu Shapiro-Wilk testi ile değerlendirildi. Değişkenlere ait gruplar normal dağılım gösterdiği için karşılaştırmaları Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA) ile gerçekleştirildi. İleri aşama (Post Hoc) olarak anlamlı fark bulunan değişkenlerde gruplar arası ikili karşılaştırmalar Bonferroni testi ile incelendi.

P değeri 0,01 ile 0,05 aralığında; İstatistiksel olarak anlamlı fark olduğu, P değeri 0,001 ile 0,01 aralığında; Yüksek düzeyde olarak anlamlı fark olduğu,

P değeri 0,001 den daha küçük ise; Çok yüksek düzeyde istatistiksel olarak anlamlı fark olduğu kabul edildi.

17

BE ÖNCE BAİCALEİN SONRA ETİLEN GLİKOL VERİLEN KORUYUCU GRUP EB ÖNCE ETİLEN GLİKOL VERİLİP SONRA BAİCALEİNLE TEDAVİ EDİLEN

GRUP

D DMSO KONTROL GRUBU

HP HİDROKSİ PROLİN GRUBU

BH ÖNCE BAİCALEİN SONRA HİDROKSİPROLİN VERİLEN KORUYUCU GRUP HB ÖNCE HİDROKSİPROLİN VERİLİP SONRA BAİCALEİN İLE TEDAVİ EDİLEN düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. EG verilen grupta HP verilen gruba göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı, BH grubuna göre anlamlı farklı bulunmuştur. BE verilen grupta HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı olarak bulunmuştur. EB verilen grupta IL-18 seviyeleri HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı olarak bulunmuştur. DMSO kontrol grubunda IL-18 seviyeleri HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı olarak bulunmuştur. HP ve BH verilen gruplarda IL-18 seviyeleri diğer tüm gruplara göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı olarak bulunmuştur. HB verilen grupta IL-18 seviyeleri HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı olarak bulunmuştur