1
T.C.
ESKİŞEHİR OSMANGAZİ ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOMİSYONU
RATLARDA ETİLEN GLİKOL VE HİDROKSİ-L-PROLİN İLE İNDÜKLENMİŞ BÖBREK TAŞI MODELİNDE BAİCALEİNİN KORUYUCU VE TEDAVİ EDİCİ
ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI
PROJE SONUÇ RAPORU 2019
2 TC
ESKİŞEHİR OSMANGAZİ ÜNİVERSİTESİ
BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOMİSYONU BAŞKANLIĞI
Bilim alanı: Proje No:
Sağlık Bilimleri 2017-1791
PROJENİN ADI
Ratlarda Etilen Glikol ve Hidroksi - L - Prolin ile İndüklenmiş Böbrek Taşı Modelinde Baicaleinin Koruyucu ve Tedavi Edici Etkisinin Araştırılması
PROJE YÖNETİCİSİ
ADI SOYADI BİRİMİ
Doç. Dr. Mehmet Cengiz Üstüner / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyoloj A.D.
PROJE ÇALIŞANLARI
Doç. Dr. Ali Barbaros Başeskioğlu / Tıp Fakültesi / Üroloji Arş. Gör. Cihan TANRIKUT / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyoloji A.D.
Arş. Gör. Umut Kerem KOLAÇ / Tıp Fakültesi / Tıbbi Biyoloji A.D.
Arş. Gör. Dr. Emre YOLDAŞ / Tıp Fakültesi / Üroloji A.D.
Prof. Dr. Varol Şahintürk / Tıp Fakültesi / Histoloji Embriyoloji A.D.
Başlama tarihi: 31.01.2018 Proje desteği: 49659,93 Bitiş tarihi: 31.01.2019
3
İçindekiler
ÖZET ... 4
1. GİRİŞ VE AMAÇ ... 5
2. YAPILAN ÇALIŞMALAR ... 11
2.1. Gereçler ... 11
2.1.1. Deney hayvanları ... 11
2.1.2. Kimyasal maddeler ... 11
2.1.3. Aygıtlar ... 12
2.2 Yöntem ... 13
2.2.1. Deney Grupları ... 13
2.2.2. Deney planı ve uygulamalar ... 15
2.2.2.1. Homojenatların hazırlanması ... 15
2.2.2.2. Taş Belirteçlerinin Belirlenmesi ... 15
2.2.2.3. Böbrek Örneklerinden Histolojik Preparatların Hazırlanması ... 15
2.2.2.4. Geçirimli elektron mikroskop doku takibi (TEM) ... 16
2.2.2.5. İstatistiksel Analiz ... 16
3. SONUÇLAR (BULGULAR) ... 17
3.1. Böbrek dokusunda taş belirteçleri ... 17
3.1.1. IL-18 seviyeleri ... 17
3.1.2. KIM-1 seviyeleri ... 18
3.1.3. NAG seviyeleri ... 18
3.1.4. NGAL seviyeleri ... 18
3.1.5. OPN seviyeleri ... 19
3.2. Serumda taş belirteçleri ... 19
3.2.1. Serumda IL-18 seviyeleri ... 19
3.2.2. Serumda KIM-1 seviyeleri ... 19
3.2.3. Serumda NAG seviyeleri ... 20
3.2.4. Serumda NGAL seviyeleri ... 20
3.2.5. Serumda OPN seviyeleri ... 20
3.3. İdrardaki belirteçler ... 20
3.3.1. idrarda KIM-1 seviyeleri ... 20
3.3.2. İdrarda kreatinin seviyeleri ... 20
3.4 Histolojik incelemeler ... 20
3.5. Geçirimli elektron mikroskop (TEM) bulguları ... 22
4. TARTIŞMA ... 32
5. SONUÇ ... 34
KAYNAKLAR ... 35
4
ÖZET
Etilen glikol ve hidroksi – l prolin ratlarda taş modeli oluşturmak için kullanılan modellerdir.
Bu çalışmada böbrek hasarında önemli olumlu etkileri olduğu literatürdeki çalışmalarda gösterilmiş olan baicaleinin, etilen glikol ve hidroksi-l-prolin ile oluşturulmuş böbrek taşı modelleri üzerinde etkisi araştırılmıştır. Bu deneysel çalışmamızda 9 grupta 63 sıçan kullanıldı.
Kontrol Grubu, Baicalein grubu, Etilen Glikol(EG) grubu, Baicalein + EG (Koruyucu) grubu, EG+ Baicalein (Tedavi edici) grubu, DMSO Kontrol grubu, Hidroksi-L-Prolin (HP) grubu, Baicalein + HP (Koruyucu) grubu, HP+ Baicalein (tedavi edici) grubu şeklinde gruplamalar yapıldı.
Böbrek hasarının gösterilmesi ve etken maddenin tedavi edici özelliklerinin tespit edilmesi için histopatolojik olarak inceleme yapılmıştır. Hücre düzeyinde hasar ve tedavinin belirlenmesi amacıyla geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ile görüntüler alınmıştır.
Kan ve idrar örneklerinde taş oluşumunda etkili çeşitli belirteçlerin bulunabimesi amacıyla protein mikroarray yöntemi uygulandı. Bu yöntemle kanda IL-18, NAG, NGAL, KIM-1, OPN gibi belirteçler ve proteinler tarandı.
Anahtar kelimeler: Böbrek hasarı, Baicalein, Böbrek taşı
5
1. GİRİŞ VE AMAÇ
Türkiye de üriner sistem taş hastalığı oldukça sık görülen ve önemli bir sağlık sorunudur.
Ülkemizde böbrek taşı yaklaşık %11,1 oranında görülmektedir (1) . Beslenme, yaşam tarzı (fiziksel aktivite azlığı), su tüketimi, vücut kitle indeksinin yüksek olması taş oluşumuna etki eden en önemli faktörler arasındadır. Sıcak, yüksek rakımlı ve tropikal ülkelerde üriner sistem taş hastalığı daha sık görülür. Taş hastalıklarında bir metabolik ya da çevresel etiyoloji yaklaşık %97 oranındadır (2). Sıcak iklim kuşağında yer alması, beslenme alışkanlıkları ve fiziksel aktivitenin düşük olması nedeniyle ülkemiz böbrek taşlarının oldukça sık görüldüğü ülkeler arasındadır.
Üriner Sistem Taşlarının Oluşumu-Etyolojisi
Taş oluşumunda idrarın saturasyonu esas faktördür. Genetik yapı metabolizma, diyet ve diğer çevresel faktörler idrar satürasyonu üzerine etki ederek taş oluşumuna katılırlar . Sıvı çözeltilerde madde yoğunluğu arttıkça kristalizasyon başlar. Kristalizasyonun ardından nükleizasyon oluşur. Nükleizasyon ile kristallerin yüzeylerde (hücre debrisi, epitel hücreleri, diğer kristaller ve eritrositler) birikip büyümesi de agregasyon olarak adlandırılır ve taş oluşum basamakları bu şekilde meydana gelir. Kristalizasyon, nükleizasyon ve agregasyon zincirini etkileyen faktörler, ısı, pH ve
ortamdaki inhibitör kompleksler ve promotör maddelerin varlığıdır. Beden dolayısı ile idrar ısısı sabitken, diğer iki faktördeki değişimler taş oluşumunu doğruda etkiler.
İdrarda magnezyum, sitrat, nefrokalsin, Tamm-Horsfall proteini, uropontin, bikunin, glikozaminoglikanlar ve bifosfonaten önemli inhibitör maddelerdir.
Etyoloji için öne sürülen teoriler şunlardır;
1- Süpersaturasyon-kristalizasyon teorisi 2- İdrar inhibitörlerinin yokluğu teorisi 3- Matriks-nükleasyon teorisi
4- Epitaksi teorisi
Belirli bir Ph ve ısıdaki sıvıya kristalize olabilen bir element eklendiğinde bu element belirli bir konsantrasyona kadar eriyik halde kalır, madde miktarı arttıkça sıvı doygunlaşır, madde çökmeye başlar. Saturasyonun doygunluğa ulaştığı ve kristalizasyonun başladığı konsantrasyona solublity product (Ksp) denir (8). Eğer kalsiyum ve oksalat konsantrasyonları sudaki termodinamik çözünürlüklerini aşarsa, idrarda çökebilirler. Kalsiyum oksalat miktarı
6
daha fazla artarsa, solüsyon olarak kalamayacak bir seviyeye ulaşılmış olur. Bu konsantrasyonda idrarda kalsiyum oksalat kristalleri oluşmaya başlar. idrarın daha fazla tuz çözemediği bir konsantrasyon eşiği vardır. Bu konsantrasyona formation product (FP) denir.
Formation product evresinden itibaren artık spontan nükleasyon yoluyla taş oluşum süreci başlar. Nükleasyondan sonra kristal büyüyebilir ve bu kristal çekirdekleri birbirlerine bağlanarak agregasyon oluşturabilirler. Agregasyon sonucu oluşan kristal kitlesi etrafında yeni agregasyon oluşarak veya yüzeydekiler nükleus rolü oynayarak kristalin büyümesine ve taş oluşumuna sebep olurlar (14). Sonuçta serbestçe idrar içinde veya bir yüzeye tutunarak taş formasyonu meydana gelir (15).
İdrarda kalsiyum, oksalat, ürik asit, sistin miktarının fazla olması (hiperkalsiüri, hiperoksalüri, hiperürikozüri, sistinüri) sitrat ve magnezyum miktarının azalması (hipositratüri, hipomagnezüri) taş oluşumuna neden olan metabolik nedenler arasındadır. Bu durumlara yol açabilen metabolik hastalıklar ve beslenme şekilleri de dolaylı olarak taş oluşumunda etkili olmaktadır.
Taş oluşumunda inhibitör rol oynayan organik yapılı maddeler: Sitratlar, Üre, Peptitler, Glikoproteinler, Sülfidril grubu içeren üromukoidler, Matriks-a maddesi, Üropontin
Taş oluşumunda inhibitör rol oynayan inorganik yapılı maddeler: Pirofosfatlar, Magnezyumi Çinko
Taş oluşumundaki bazı diğer predispozan faktörler:
1. Ürostaz,
2. İdrar pH’sındaki değişimler, 3. Renal kalsifikasyonlar,
4. Yaygın üriner sistem enfeksiyonları (en sık proteus enfeksiyonu olmakla birlikte psödomonas, stafilokok, klebsiella gibi enfeksiyonlar taş hastalığı yapar)
5. Üriner sisteme ait maligniteler-nekrotik dokular, 6. Üriner sistemle bağlantılı fistüller,
7. Üriner sistemdeki yabancı cisimler, 8. Konjenital anomaliler.
Yapılarına Göre Üriner Sistem Taşları
Organik taşlar: Ürik asit taşları, Sistin taşları, Ksantin taşları
7 İnorganik taşlar: Kalsiyum oksalat, Kalsiyum fosfat
Enfeksiyon taşları: Magnezyum-amonyum-fosfat (struvite) taşları
Kalsiyum taşları
Böbrek taşlarının en sık görülen tipi öncelikle kalsiyum oksalat ya da bunun hidroksiapatit kombinasyonudur. Kalsiyum taşları böbrek taşlarının yaklaşık %75’ini oluşturur (1).
Hiperkalsiüri (>250-300 mg/gün/24 saatlik idrar), CaOx taş hastalığına en sık eşlik eden metabolik faktörlerdendir. CaOx taş hastalığına eşlik eden en sık hiperkalsiüri sebebi idiopatiktir.
Hiperkalsiüri nedenleri
1. Absorbtif hiperkalsiüri: Barsaklardan kalsiyum emiliminin artması. 3 tipi vardır a. Tip 1: Diyetle kalsiyum alımı sınırlı veya normal iken hiperkalsiüri mevcuttur b. Tip 2: Diyetle yüksek kalsiyum alımı var iken hiperkalsiüri olması
c. Renal fosfat kaçağı vardır ve buna sekonder olarak D vitamini sentezinin artışı sonrası süreç devam eder (16)
2. Renal hiperkalsiüri: böbreklerden kalsiyum reabsorbsiyonunda yetersizlik olması ve idrarla fazla kalsiyum atılmasıdır.
3. Rezorptif hiperkalsiüri: Hiperparatiroidi olgularında görülür
Kalsiyum oksalat taşlarının patofizyolojisini, oluşumunu araştırmak için kemirgenlerde çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir. Bu modeller arasında en iyi bilinenlerden biri etilen glikol ile oluşturulan modeldir. Etilen glikol; glikolat, glioksalat ve oksalata metabolize olur ve bu şekilde idrarda ve böbreklerde kalsiyum oksalat monohidrat kristalleri oluşur (3).
Enfeksiyon (struvite) taşları
Üriner sistem taslarının %15-20’sini oluşturmaktadır (17). Bu taşın yapısında magnezyum, amonyum, fosfat ve karbonat karışmış bir şekilde bulunur. Strüvitin kristalizasyonu için idrar Ph’sının 7.2 ya da üzeri olması ve idrarda amonyağın bulunması gerekmektedir (18).
Enfeksiyon taşlarının gelisimini sağlayan güç ise üreaz üreten bakterilerle idrarın enfekte olmasıdır. Enfeksiyon ve eşlik eden üreaz aktivitesi ortamın alkaliye kaymasına zemin hazırlar. Proteus türleri en fazla olmak üzere (%72), Klebsiella, Pseudomonas, H.influenza ve Stafilokoklar bu ortamda bulunurlar (19). Alkalinizasyon strüvitin çözünürlüğünü azaltır ve çökmesi için uygun ortam meydana gelir. Bakteriler kendi çevrelerinde süpersaturasyon yaparak alkali idrarda üzerlerine kristallerin çökmesini sağlarlar, kristal nükleasyon için matriks görevi görürler (20)
8 Sistin taşları
En sert taş tipidir. Protein metabolizmasının bir ürünü olan sistinin renal tübüler reabsorbsiyonunda görev alan enzim transportunda var olan konjenital bir defekte bağlı olarak sistinüri meydana gelir. sistin özellikle düşük idrar pH'ında çözünür olmadığından hızla kristalize olarak taş oluşumuna yol açabilmektedir (16) Sistin taşları; üriner sistem taşlarının
%1-3’ ünü olusturup etyolojisinden sistinüri sorumlu tutulmuştur. Sistin taşı olanlarda eşlik eden metabolik anomali olarak %44 hipositratüri, %22 hiperürikozüri, %19 hiperkalsiüri görülmektedir. Homozigot sistinüriklerde idrar sistin düzeyi 250 mg/gün seviyesinin üzerine çıkabilir. İdrarda hegzagonal kristaller oluşturur. İdrarın alkalileştirilmesi ve esansiyel aminoasitlerden kısıtlı diyet tedavide kullanılır.
Ürik asit taşları
Pürin metabolizması bozukluğu sonucu oluşur. Organik taşlar arasında en sık görülendir.
Oluşumunda asit idrar ve hiperürikozüri ana sebeptir.
Ksantin Taşları
Böbrek taşlarının nadir bir sebebidir . Ksantin oksidaz eksikliği ile karakterize, otozomal resesif kalıtım gösteren doğumsal bir metabolizma hastalığında görülür.
İlaç kullanımına bağlı gelişen taşlar
Triamteren, İndinavir, Sulfonamid, D vitamini, Vitamin C kullanımına bağlı üriner sistem taşı oluşabilmektedir.
Böbrek Taşı Semptomları
Renal kolik (obstruktif olanlarda), yan ağrısı
Bulantı, kusma
Urgency, Dizüri
Mesanede kasılma hissi, sık sık idrara gitme isteği (üreterovezikal alana ve mesaneye yaklaşan taşın yarattığı sürtünme etkisi ile oluşur.)
Hematüri (mikroskobik veya makroskopik olabilir)
Kostovertebral açı hassasiyeti
Obstruksiyona yol açarsa hidronefroz, staz, pyelonefrit, piyonefroz gibi komplikasyonlara neden olabilir (21) Bu komplikasyonlar esnasında ateş yüksekliği görülür ve ürolojik aciller arasındadır. Çünkü taş bulunmasına ek olarak ateş olması bizlere taşın bir yeri obstrükte ettiği ve proksimalinde staz olduğu, idrarın yeterince drene olamadığı bir ortam çağrışımı yapmaktadır. Ateş, taşikardi, hipotansiyon ve
9
ciltte vazodilatasyonun görülmesi ise ürosepsisin klinik belirtileridir. Bu durumda retrograd üreter katateri veya antegrad olarak perkütan nefrostomi kateteri konulması ile dekompresyon sağlanmalıdır
Üriner Sistem Taşlarının Toplum ve Ülke Ekonomisi Açısından Önemi
Üriner sistem taşları önlenebilir ve tedavi edilebilir bir hastalıktır. Önlenmediği veya tedavi edilmediği takdirde daha ciddi sağlık sorunlarına ve iş gücü kaybına yol açacağından ve ülkemiz böbrek taşı açısından endemik bir ülke olduğu için böbrek taşlarının önlenmesi ve tedavisi ülkemiz ekonomisi açısından büyük önem arz etmektedir. Üriner sistem taş hastalığı tedavisinde birçok etkin tedavi yöntemi bulunmaktadır. Medikal tedaviler de bu yöntemlerden birisidir. Medikal tedaviler arasında semptomatik tedavilerle birlikte taş oluşumunu önlemeye yönelik tedaviler de mevcuttur. Medikal tedavinin taş oluşumunu önlediği kesin veriler ile ortaya konulmuş olup, hastaların detaylı olarak bilgilendirilmesini takiben taş oluşumuna yol acan metabolik anormallikler araştırılmalı ve yapılan analizler sonucunda gerekli olduğu takdirde sebebe yönelik medikal tedavi planlanmalıdır (6). Günlük sıvı alımının 3 litre (günlük idrar cıkışı en az 2500 ml) olacak şekilde tüketilmesi, diyetle alınan oksalat ve sodyum miktarının kısıtlanması, hayvansal proteinlerin kısıtlanması gibi öneriler taş oluşumunu önleyen genel yöntemler arasında en önemli olanlarıdır (7)
Böbrek taşlarının tedavisi
Böbrek taşlarında tedavi yöntemi belirlenmesinde en önemli kriterler taşın yapısı, sayısı, büyüklüğü ve bulunduğu yerdir
Medikal tedavi-Yaşam tarzı düzenlenmesi: 5mm ye kadar olan taşların düşürülmesi amacıyla yapılan tedavidir. Antispazmodik analjezik ilaçların kullanılması, bol sıvı alımı, bol fiziksel aktivite ile taş düşürülebilir. Ancak taş boyutu arttıkça taşın kendiliğinden düşme olasılığı azalır.
Çözündürücü Ajanlar: Bu tedavi taşın ve idrarın kimyasal yapısına göre değişmektedir. Oral yolla veya bir kateter aracılığıyla böbrek içerisine vermek suretiyle taşın yıkılmasını sağlamaya yönelik tedavi şeklidir. Bu amaçla Suby G solüsyonu ve hemiacidrin böbrek içerisine perkütan nefrostomi katateri aracılığıyla verilmektedir (9). Ürik asid taşlarında Allopurinol ve idrarın alkalinizasyonuna yönelik potasyum sitrat veya potasyum bikarbonat;
sistin taşlarında D-penicillamine, tiopronin ve captopril tedavi amaçlı olarak kullanılırlar (10- 11). Enfeksiyon nedeniyle oluşan struvit (magnezyum amonyum fosfat) taşlarında uygun antibiyoterapi verilir ve taşın çözündürülmesi için idrarın asidifiye edilmesi gerekir (12)
10
Kalsiyum oksalat ve kalsiyum fosfat taşlarında thiazid diüretikler kullanılabilir.
ESWL: Vücut dışarısından şok dalgaları verilerek taşın kırılıp daha küçük boyutlara parçalanması ve bu parçaların idrarla atılması esasına dayanan tedavidir. 5mm den büyük taşlar için tercih edilir.
PerkutanNefrolithotomy (PNL):2 cm den büyük veya ESWL ile kırılamayan taşlar için kullanılan kapalı endoskopik ameliyat yöntemidir. Bel bölgesine yapılan 1 cm likkesiden böbrek içerisine ve taşlara ulaşılarak taşların lazer veya pnömatik gibi cihazlarla kırılması veya dışarı alınması esasına dayanır.
Ureterorenoskopi (URS): Kapalı (endoskopik) bir yöntemdir. Üretradan mesaneye oradan da üretere ulaşılıp üreterdeki ve/veya böbrekteki taşlar lazer veya pnömatik ile parçalanır. Rigid URS ile alt ve orta üreterdeki taşlar kırılabilir. Fleksibl yani kıvrılabilen üreteroskoplar ise uçları çeşitli yönlerde ve açılarda döndürülebildiğinden hem üst üreterdeki, hem de böbrek içinde havuzcuk ve kalis adı verilen ceplerdeki taşların tedavisinde kullanılırlar. Üretereroskopik taş tedavisi sonrası hastalar aynı gün veya bir gün sonra evlerine taburcu edilirler.
Baicalein, Çin' de bazı hastalıkların tedavisinde kullanılan bir bitki olan Scutellaria baicalensis Georgi' de bulunan bir fitokimyasal olup çeşitli farmakolojik etkilerinin olduğu bilinen bir etken maddedir. Küçük hücreli akciğer kanserinde, prostat kanserinde, meme kanserinde ve diğer bazı kanser türlerinde baskılayıcı bir etkisinin olduğu gösterilmiştir. Bazı çalışmalar baicalein'in hücre döngüsünü durdurduğunu ve apoptozu uyardığını göstermiştir (4). Ayrıca baicalein in renal hasarı önlemede de rolü olduğu birçok çalışmada gösterilmiştir (5) Ancak sıçanlarda baicalein in böbrek taşı oluşumuna etkisi ve böbrek taşı olan sıçanlarda taşa bağlı böbrek hasarına etkisine yönelik çalışma bulunmamaktadır.
Bu bilgiler doğrultusunda çalışmamızda hidroksi-l prolin ve etilen glikol ile üriner sistem taşı oluşturulmuş ratlarda Baicalein in üriner sistem taşlarını önleyici, tedavi edici ve böbrek hasarına yönelik etkisini araştırılmıştır.
11
2. YAPILAN ÇALIŞMALAR 2.1. Gereçler
Bu çalışma Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim nDalında gerçekleştirilmiştir. Çalışma Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurulunda onay alınarak yapılmış olup tüm aşamalarında hayvan hakları evrensel bildirgesi kurallarına uyulmuştur.
2.1.1. Deney hayvanları
Deneysel çalışmamızda 300-350 gram ağırlıkta sağlıklı, 4-5 aylık, Wistar albino ırkı, erkek sıçanlar kullanıldı. Deney hayvanları deney süresince 12:12 aydınlık:karanlık ışıklandırması olan, ortalama 22±2oC sıcaklık ve %45-50 nem koşullarında yaşatıldı. Deney sürecinde tüm sıçanlar kafeslerde, standart sıçan pellet yemi ile beslendi ve sıçanlara çeşme suyu verildi.
Deney hayvanları arasından rastgele seçimle her birinde n=7 sıçan olmak üzere toplam 9 grupta 63 adet sıçan kullanıldı.
2.1.2. Kimyasal maddeler
Deney süresince kullanılan kimyasal maddeler aşağıda maddeler halinde verilmiştir:
Baicalein Etilen Glikol Hidroksi Prolin IL-18
KIM-1 (kidney injury molecule-1) NAG (N-Asetil Glukozamin)
NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin) OPN (osteopontin)
DMSO (dimetil sulfoksit) Serum fizyolojik
Eter
Formaldehit Etanol Parafin Ksilol
12
2.1.3. Aygıtlar
Deney süresince kullanılan aygıtlar aşağıda maddeler halinde verilmiştir:
- Buz makinesi
- Buzdolabı (+4)
- Derin dondurucu (-20)
- Derin dondurucu (-80)
- Elisa reader (BioLab)
- Enjektör (5 ml, 10 ml)
- Etüv (Nüve NT 715)
- Hassas terazi (Precisa-125A)
- Hayvan kafesi
- Homojenizatör (IKA-Ultra -Turrax T25)
- Laboratuvar saati
- Manyetik karıştırıcı (Nüve)
- Operasyon takımı
- Otomatik pipetler
- Parafilm
- Santrifüj tüpleri
- Soğutmalı santrifüj (Heraeus Megafuge 1.0. R)
13 - Su banyosu (Nüve)
- Vorteks mikser (Restch)
- Mikropipet ucu (1-200 mikrolitre, 100-1000 mikrolitre AXIGEN)
- EDTA’ lı tüp (5 ml)
- Jelli Tüp (5 ml)
- Gavaj iğnesi
- Ultramikrotom (Leica Ultracut R)
- TEM (JEOL JEM 1220) - Binoküler mikroskop
2.2 Yöntem
Deney hayvanları arasından rastgele seçimle her birinde n=7 sıçan olmak üzere toplam 9 grupta 63 adet sıçan kullanıldı.
2.2.1. Deney Grupları
Grup 1 (Kontrol Grubu): Bu grup hayvanlara deney süresi boyunca gavaj yoluyla SF verildi ve Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.
Grup 2 (Baicalein Grubu) : Bu grup deney hayvanlarına intragastrik olarak gavaj yöntemi ile
100 mg/kg Baicalein, Dimetil Sülfoksit (DMSO) içerisinde 33 mg/ml olacak şekilde çözdürülerek 7 gün boyunca uygulandı. Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.
Grup 3 (Etilen Glikol(EG) Grubu): Bu grup deney hayvanlarına Etilen glikol içme suyu içerisine hacim olarak % 1 olacak şekilde karıştırılarak 28 gün boyunca verildi. Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.
14
Grup 4 (Baicalein + EG Koruyucu grup): Bu grup deney hayvanlarına intragastrik olarak gavaj yöntemi ile 100 mg/kg Baicalein, Dimetil Sülfoksit (DMSO) içerisinde 33 mg/ml olacak şekilde çözdürülerek 7 gün boyunca uygulandı. Sonrasında bu grup deney hayvanlarına Etilen glikol içme suyu içerisine hacim olarak % 1 olacak şekilde karıştırılarak 28 gün boyunca verildi. Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.
Grup 5 (EG+ Baicalein Tedavi edici Grup): Bu grup deney hayvanlarına Etilen glikol içme suyu içerisine hacim olarak % 1 olacak şekilde karıştırılarak 28 gün boyunca verildi.
Sonrasında intragastrik
olarak gavaj yöntemi ile 100 mg/kg Baicalein Dimetil Sülfoksit (DMSO) içerisinde 33 mg/ml olacak şekilde çözdürülerek 7 gün boyunca uygulandı. Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.
Grup 6 (DMSO Kontrol Grubu) : Bu grup deney hayvanlara 7 gün boyunca intragastrik olarak gavaj yoluyla 1 ml DMSO verildi ve uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.
Grup 7 (hidroksi-L-Prolin (HP) Grubu): Bu grup deney hayvanlarına Hidroksi-L-Prolin içme suyu içerisine hacim olarak % 3 olacak şekilde karıştırılarak 28 gün boyunca verildi.
Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.
Grup 8 (Baicalein + HP Koruyucu grup): Bu grup deney hayvanlarına intragastrik olarak gavaj yöntemi ile 100 mg/kg Baicalein Dimetil Sülfoksit (DMSO) içerisinde 33 mg/ml olacak şekilde çözdürülerek 7 gün boyunca uygulandı. Sonrasında bu grup deney hayvanlarına Hidroksi-L-prolin içme suyu içerisine hacim olarak % 3 olacak şekilde karıştırılarak 28 gün boyunca verildi. Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.
Grup 9 (HP+ Baicalein Tedavi edici Grup): Bu grup deney hayvanlarına Hidroksi-L-prolin içme suyu içerisine hacim olarak % 3 olacak şekilde karıştırılarak 28 gün boyunca verildi.
Sonrasında intragastrik
olarak gavaj yöntemi ile 100 mg/kg Baicalein Dimetil Sülfoksit (DMSO) içerisinde 33 mg/ml olacak şekilde çözdürülerek 7 gün boyunca uygulandı. Uygulama sonunda Eter ile anestezi uygulanarak diseksiyon gerçekleştirildi.
15
2.2.2. Deney planı ve uygulamalar
Deneylerimizde baicalein günlük olarak tek doz 1 hafta boyunca gavaj yöntemiyle verildi, Etilen glikol ve Hidroksi-L-prolin ise içme suyuna karıştırılarak verildi.
Her gruba ait sıçanlar idrar toplama kafeslerine konularak 12 saat bekletilerek idrarları toplandı.
Deneylerde kullanılan sıçanlardan cerrahi işlem sırasında kalplerinden yüksek miktarda kan alınarak yaşamları sonlandırıldı ve sonrasında böbrek dokusu ve kan örnekleri toplandı.
Böbrek dokusu tüm gruplarda diseksiyondan hemen sonra her bir hayvana ait sağ ve sol böbrekler üç kısma ayrılarak birinci kısım histolojik analizler için %10’ luk nötral buffer formalin fiksasyon sıvısına, ikinci kısım biyokimyasal analizler için polietilen tüplerde –80 C derin dondurucuya konuldu ve üçüncü kısım elektron mikroskopi görüntülenmesi için 0.1 M fosfat tampon içeren % 2.5’luk glutaraldehit içerisine konuldu.
2.2.2.1. Homojenatların hazırlanması
Böbrek doku örneklerinden 0,1 gr. tartılıp 0,3 ml PBS (pH 7,4) içerisine alındı. Buz içerisine alınan örnekler ultrasonik homojenizatör cihazında 8000 devirde 10 vuruda homojenize edildi. Daha sonra soğutmalı santrifüjde +4 oC’ de 3000 rpm’de 20 dakika santrifüj edildi.
Süpernatant kısmı ayrı bir viale alınarak ELISA ölçümleri yapılana kadar -80oC’ de saklandı.
2.2.2.2. Taş Belirteçlerinin Belirlenmesi
Böbrek dokusu, kan ve idrar örneklerinde taş oluşumunda etkili çeşitli belirteçlerin bulunabilmesi amacıyla protein mikroarray yöntemi uygulanarak, taşa özgün belirteçler belirlenmeye çalışıldı. Protein mikroarray yönteminde böbrek dokusu ve kanda Kim-1, NAG, NGAL, IL-18, Osteopontin gibi belirteçler ve proteinler tarandı. İdrarda ise KIM-1 ve kreatinin çalışıldı.
2.2.2.3. Böbrek Örneklerinden Histolojik Preparatların Hazırlanması
Ratlardan elde edilen sağ böbrekler boyuna ortadan ikiye bölünerek % 10’luk nötral tamponlu formaldehit içerisine alınarak 24 saat süreyle fikse edildi. Yıkamayı takiben sırasıyla artan etanol serisi (% 70, % 80, % 90 ve % 96) ve ksilolden geçirildikten sonra parafin içerisinde bloklandı. Alınan 4-5 mm kalınlığındaki kesitler genel histolojik inceleme için hematoksilin- eozin boyama tekniği ile boyandı. Kalsiyum çökeltilerini görebilmek amacıyla Von Kossa hazır boyama kiti kullanıldı. Elde edilen boyalı preparatlar binoküler ışık mikroskobu altında iki histolog tarafından değerlendirildi.
16
2.2.2.4. Geçirimli elektron mikroskop doku takibi (TEM)
Alınan örnekler zaman kaybetmeden 0.1 M fosfat tampon içeren % 2.5’luk glutaraldehit içinde 24 saat 4˚C’de primer fiksasyona alındı, sonra fosfat tamponuyla 3 kez 15’er dakika yıkandılar. Daha sonra 0.1 M fosfat tampon içeren %1’lik osmiyum tetroksit içinde, oda sıcaklığında ve rotatorda 2 saat sekonder fiksasyonları sağlanıp, devamında dokular tamponla tekrar 3 kez yıkandı. Dokudaki fazla suyun alınması (dehidrasyon) için örnekler giderek artan derecelerde ve 4˚C’de ikişer kez belirli sürelerde etil alkol serilerinden geçirildi (%30, %50,
%70, %90, %96, %100 (son yıkama ve sonraki işlemler oda ısısında) ve propilen oksitte 30 dk boyunca (iki kez) şeffaflaştırma işlemine alındı. 1/1 oranında propilen oksit- araldite karışımında 2 saat rotatorda bekletildikten sonra saf araldite alınan dokular bir gece boyunca rotatorda tutuldular ve ertesi gün araldite gömülerek 60˚C’de 48 saat polimerize edildiler.
Elde edilen bloklardan ultramikrotomda (Leica Ultracut R) 60 nm kalınlığında tam ince kesitler alındı. 300 meshlik bakır gridlere alınan bu kesitler uranil asetat-kurşun sitrat ile boyandıktan sonra JEOL JEM 1220 marka ve modeldeki TEM de incelenmeye alındılar.
2.2.2.5. İstatistiksel Analiz
Verilerin analizi IBM SPSS 21 Paket programı kullanılarak gerçekleştirildi. Verilere ait özet değerler ortalama±standart sapma olarak sunuldu. Değişkenlerin gruplar bazında normal dağılıma uygunluğu Shapiro-Wilk testi ile değerlendirildi. Değişkenlere ait gruplar normal dağılım gösterdiği için karşılaştırmaları Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA) ile gerçekleştirildi. İleri aşama (Post Hoc) olarak anlamlı fark bulunan değişkenlerde gruplar arası ikili karşılaştırmalar Bonferroni testi ile incelendi.
P değeri 0,01 ile 0,05 aralığında; İstatistiksel olarak anlamlı fark olduğu, P değeri 0,001 ile 0,01 aralığında; Yüksek düzeyde olarak anlamlı fark olduğu,
P değeri 0,001 den daha küçük ise; Çok yüksek düzeyde istatistiksel olarak anlamlı fark olduğu kabul edildi.
17
3. SONUÇLAR (BULGULAR)
Gruplar ve aciklamalari
K KONTROL GRUBU
B BAİCALEİN VERİLEN GRUP EG ETİLEN GLİKOL GRUBU
BE ÖNCE BAİCALEİN SONRA ETİLEN GLİKOL VERİLEN KORUYUCU GRUP EB ÖNCE ETİLEN GLİKOL VERİLİP SONRA BAİCALEİNLE TEDAVİ EDİLEN
GRUP
D DMSO KONTROL GRUBU
HP HİDROKSİ PROLİN GRUBU
BH ÖNCE BAİCALEİN SONRA HİDROKSİPROLİN VERİLEN KORUYUCU GRUP HB ÖNCE HİDROKSİPROLİN VERİLİP SONRA BAİCALEİN İLE TEDAVİ EDİLEN
GRUP
3.1. Böbrek dokusunda taş belirteçleri 3.1.1. IL-18 seviyeleri
Kontrol grubunda IL-18 seviyelerinde HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. Baicalein verilen grupta HP ve BH grubuna göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. EG verilen grupta HP verilen gruba göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı, BH grubuna göre anlamlı farklı bulunmuştur. BE verilen grupta HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı olarak bulunmuştur. EB verilen grupta IL-18 seviyeleri HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı olarak bulunmuştur. DMSO kontrol grubunda IL-18 seviyeleri HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı olarak bulunmuştur. HP ve BH verilen gruplarda IL-18 seviyeleri diğer tüm gruplara göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı olarak bulunmuştur. HB verilen grupta IL-18 seviyeleri HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı olarak bulunmuştur
18
3.1.2. KIM-1 seviyeleri
Kontrol grubunda KIM-1 seviyelerinde HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. B grubunda HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. EG grubunda KIM-1 seviyeleri D grubuna göre anlamlı farklı, HP, BH, HB gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı olarak bulunmuştur. BE grubunda KIM-1 seviyelerinde EG, BH ve HP gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. DMSO kontrol grubunda EG grubuna göre anlamlı farklı, HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. HP grubunda KIM-1 seviyelerinde BH grubu hariç diğer tüm gruplarda, BH grubunda da HP grubu hariç tüm gruplarda çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. HB grubunda EG, HP, BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır.
3.1.3. NAG seviyeleri
Kontrol grubunda NAG seviyelerinde HB grubuna göre anlamlı, BE grubuna göre yüksek düzeyde anlamlı, EB ve HP gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. B grubunda HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. EG grubunda BH grubuna göre anlamlı, HP grubuna göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. BE grubunda kontrol grubuna göre yüksek düzeyde, HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. EB grubunda HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. DMSO kontrol grubunda BH grubuna göre anlamlı farklılık, HP grubuna göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık olduğu saptandı. HP grubunda diğer tüm gruplara göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık olduğu saptandı. BH grubunda NAG seviyelerinde EG ve D gruplarına göre anlamlı, HB grubuna göre yüksek düzeyde anlamlı, B, BE, EB ve HP gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. HB grubunda BH grubuna göre yüksek düzeyde anlamlı, HP grubuna göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır.
3.1.4. NGAL seviyeleri
Kontrol grubunda NGAL seviyeleri BH grubuna göre yüksek düzeyde anlamlı, HP grubuna göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklı bulunmuştur. EG grubunda BE grubuna göre yüksek düzeyde anlamlı, HP grubuna göre çok yüksek düzeyde anlamlı saptanmıştır. BE grubunda EG grubuna göre yüksek düzeyde anlamlı, HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. EB grubunda HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde
19
anlamlı farklılık saptanmıştır. DMSO kontrol grubunda HP ve BH gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. HP grubunda BH grubuna göre anlamlı, diğer gruplara göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. BH grubunda B grubuna göre anlamlı, kontrol grubu ve HP grubuna göre yüksek düzeyde anlamlı, HB grubuna göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. HB grubunda HP ve BH gruplarına göre göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır.
3.1.5. OPN seviyeleri
Kontrol grubunda OPN seviyelerinde diğer tüm gruplara göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. HB grubu haricindeki diğer tüm gruplarda kontrol grubuna göre çok yüksek anlamlı farklılık saptanırken HB grubunda diğer gruplara göre anlamlı farklılık saptanmamıştır.
3.2. Serumda taş belirteçleri 3.2.1. Serumda IL-18 seviyeleri
Kontrol grubunda serumdaki IL-18 seviyelerinde BH grubuna göre çok yüksek düzeyde anlamlı, HB grubuna göre yüksek düzeyde anlamlı farklılık bulunmuştur. B grubunda HB grubuna göre anlamlı, EB ve BH gruplarına göre yüksek düzeyde anlamlı farklılık bulunmuştur. EG grubunda EB, BH, HB gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. BE grubunda HB grubu ile anlamlı, EB grubu ile yüksek düzeyde anlamlı, BH grubu ile çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık bulunmuştur. EB grubunda B ve BE gruplarına göre yüksek düzeyde, HP, EG ve kontrol grubuna göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. DMSO kontrol grubunda BH grubuna göre yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. HP grubunda EB, BH ve HB gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. BH grubunda EG, BE, HP gruplarına göre çok yüksek düzeyde, kontrol grubu ve DMSO kontrol grubuna göre yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır. HB grubunda EG ve HP gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı, kontrol grubuna göre yüksek düzeyde anlamlı, B ve BE gruplarına göre çok yüksek düzeyde anlamlı farklılık saptanmıştır.
3.2.2. Serumda KIM-1 seviyeleri
Kontrol grubunda serumda KIM-1 seviyelerinde diğer gruplarla karşılaştırıldığında anlamlı farklılık gözlenmemiştir. EG grubunda EB ve HB gruplarına göre, EB grubunda EG ve HP gruplarına göre, HP grubunda EB ve HP grubuna göre, HB grubunda EG ve HP gurplarına göre anlamlı farklılık saptanmıştır.
20
3.2.3. Serumda NAG seviyeleri
Kontrol grubunda serumda NAG seviyelerinde diğer gruplarla karşılaştırıldığında anlamlı farklılık gözlenmemiştir. B grubunda HP ve HB gruplarına göre, HP grubunda B gurubuna göre, HB grubunda B grubuna göre anlamlı farklılık saptanmıştır.
3.2.4. Serumda NGAL seviyeleri
Kontrol grubunda serumda NAG seviyelerinde diğer gruplarla karşılaştırıldığında anlamlı farklılık gözlenmemiştir. B grubunda EB ve HP grubuna göre, EG grubunda B grubuna göre, BE grubunda B grubuna göre, HP grubunda B grubuna göre anlamlı farklılık saptanmıştır.
3.2.5. Serumda OPN seviyeleri
Kontrol grubunda serumda OPN seviyelerinde diğer gruplarla karşılaştırıldığında anlamlı farklılık gözlenmemiştir. EG grubunda EB grubuna göre, EB grubunda EG ve HP, HP grubunda EB grubuna göre anlamlı farklılık görülmüştür.
3.3. İdrardaki belirteçler
3.3.1. idrarda KIM-1 seviyeleri
Kontrol grubunda idrarda KIM-1 seviyelerinde HP grubuna göre anlamlı farklılık saptanmıştır. B grubunda HP ve HB gruplarına göre, BE grubunda HP gurubuna göre, EB grubunda HP grubuna göre, HP grubunda B, EB, D, BH gruplarına göre, BH grubunda HP grubuna göre, HB grubunda B ve EB gruplarına göre anlamlı farklılık saptanmıştır.
3.3.2. İdrarda kreatinin seviyeleri
Kontrol grubunda diğer gruplarla karşılaştırıldığında idrar kreatinin seviyelerinde HB grubu ile arasında anlamlı farklılık saptanmıştır. DMSO kontrol grubu ile HB grubu arasında, HB grubu ile kontrol grubu ve DMSO kontrol grubu arasında anlamlı farklılık saptanmıştır.
3.4 Histolojik incelemeler
Yapılan histolojik değerlendirmede mevcut deney süresi ve şartlarına göre gruplar arasında belirgin bir histolojik fark saptanamadı. Gerek kontrol, DMSO, Baikalein, ve gerekse EG, HP, Baikalein+EG, Baikalein+HP, EG+Baikalein ve HP+Baikalein gruplarında kortikal ve medüller böbrek bölümleri iltihabi hücre artışı, hiyalen kast oluşumu, tübüler dejenerasyon gibi histopatolojik bir değişim göstermedi (Şekil-1). Von Kossa boyamada hiçbir grupta
21
kalsiyum çökeltilerine rastlanmadı. Gruplara ait temsili mikroskobik görüntüler Şekil 2’de yer almaktadır.
Şekil-1. Rat gruplarına ait böbrek kesitlerinin mikroskobik görüntüleri. A: Kontrol, B:
DMSO, C:Baikalein, D: EG, E: HP, F: Baikalein + EG, G: Baikalein + HP, H: EG + Baikalein ve I: HP + Baikalein gruplarında böbreklerin belirgin bir histopatolojik değişim göstermediklerine ve birbirine benzer görüntülere sahip oldukları görülmektedir.
Hematoksilin-Eozin boyama, barların hepsi 50 µm’dir.
22
Şekil-2. Ratların A: EG ve B: HP gruplarına ait böbrek kesitlerinde kalsiyum çökeltilerinin bulunmadığı görülmektedir. C: Kontrol amaçlı kullanılan plasenta kesitinde koyu renkli kalsiyum çökeltilerinin (ok) varlığına dikkat ediniz. Von Kossa kalsiyum boyama, barların hepsi 50 µm’dir.
3.5. Geçirimli elektron mikroskop (TEM) bulguları
Kontrol Grubu (K) : TEM mikrograflarında normal tubüler epitelyal hücre tabakası gözlemlenmiştir. Bazı örneklerde kırmızı kan hücrelerini içeren kapiller tufut gözlenmlenmiştir. Çekirdek sağlıklı, ökromatik yapıdadır. Mitokondriler düzenli ve normal görünümlüdür.
23
Baicalein Grubu (B): Lümende kırmızı kan hücrelerinde artış, bazı çekirdeklerde piknotik görünüm, bazal membran nispeten kalın ve bazal membrana yakın organller arasında geniş seyrelmiş boşluklar gözlemlenmiştir. Mitokondilerde düzensiz bir yapı izlenmiştir.
24
Etilen Glikol Grubu (EG): Çekirdek heterokromatin görünümlü olup, periferde kromatin yoğunlukları gözlemlenmiştir. Çekirdek dış zarında şişmeler gözlemlenmiş ve özellikle çekirdeğe yakın bölgelerde ve mitokondrilerin aralarında geniş seyrelmiş aralıkları boşluklar tespit edilmiştir. Vezikül yapılar çok fazladır. Lizozomlar izlenmiştir. Mitokondrilerde krista kayıpları gözlemlenmiştir. Kum olma potansiyeline sahip yapılar gözlemlenmiştir. Özellikle çekirdek dış zarı yakınlarında ileri derecede koful oluşumuna benzer yapılar gözlemlenmiştir.
25
Baicalein + Etilen Glikol Grubu (BE): Mitokondriler sağlıklı krista yapısına sahip ve normal görünümdedir. Bazal kalıntılar arasındaki mitokondriler normal uzun görünümlü, bazal membran ince ve katlantıları düzgün fakat iç kısımlarda sitoplazmada seyrelmiş alanlar ve bazı çekirdeklerde piknotik yapılar görülmüştür. Bazal membran ve mitokondriler normaldir. Lümende eritrosit gözlemlenmiştir.
26
Etilen Glikol + Baicalein Grubu (EB): Mitokondriler normal, çekirdek dış zarında şişme ve çekirdek kromatin yapısı normal yapıdadır. Bazal membran ve katlantıları nispeten etilen glikol grubuna göre daha düzgündür.
27
DMSO grubu (D): Bazal membran kalın, çekirdek heterokromatik yapıda, hücreler elektronca yoğun, çekirdek dış zarında şişme, bazal membranda kıvrımlar düzensiz, katlantılar anormal ve çok düzensiz yapıda gözlemlenmiştir.
28
Hidroksiprolin Grubu (HP): Hücreler genel olarak elektronca yoğun görünümlü olup, miktokondrilerde anormal yapılar izlenmiştir. Bazal membranda ileri derecede kalınlaşma görülmüş ve yer yer lizozomlar izlenmiştir. Glomerular kapillerin endotelyal hücre duvarları da kalındır. Padosit yapılarda düzensizlikler vardır. Distal kıvrımda bazı anormal mitokondri görünümleri vardır. Kofullar görülmüştür. Çekirdekde kromatin yoğunlaşması gözlemlenmiştir. Bazal membranda lizozom artışı ve bazal membrana dik yerleşimli bazal katlantılar arasında mitokondrilerin çoğu normal görünümünü kaybetmiş ve hatta bazılarında mitokondriler apikalinde ileri derecede şişme gözlemlenmiştir. Aşağıdaki şekilde olası böbrek taşı oluşumuna benzer yapılar gözlemlenmiştir.
29
30
Bacialein + Hidroksiprolin Grubu (BH): Proksimal tübülün mikrovillüsleri normal görünmektedir. Lümen düzenli yapı arz etmektedir. Bazal membran düzgündür. Çekirdek sağlıklı ve ökromatik yapıdadır. Mitokondrilerde yer yer atipik görünüm ve mitokondri yakınlarında yer yer membranöz veziküller izlenmiştir.
Hidroksiprolin + Baicalein Grubu (HB): Bazal mitokondriler hidroksiprolin grubuna göre daha sağlıklı, bazal kısma yakın yerde organeller arasında boşluklar görülmekle birlikte, sitoplazma kısmında düzelmiştir. Bazal kısımda katlantılar çok düzensizdir. Çekirdek heterokromatik yapıda gözlemlenmiştir. Yer yer kofullar bulunmaktadır. Bazal membranda mitokondri sayısında azalmayla birlikte çoğu bazal membranlar eliptik yapıdan yuvarlak yapıya dönme eğilimi görülmüştür.
31
32
4. TARTIŞMA
Üriner sistem taş hastalığı ülkemizde oldukça sık rastlanan ve böbreklerde hasara yol açan bir durumdur. Taş tanısı radyolojik görüntüleme yöntemleriyle konmakta olup üriner sistem taşı için kullanılabilecek marker bulunmamaktadır. Taş tedavisinde cerrahi yöntemler ön planda olmakla birlikte taş oluşumunun önlenmesi için yaşam tarzı değişiklikleri ve varsa altta yatan metabolik bozuklukların düzeltilmesi gerekmektedir.
Taş tedavisinde medikal tedavinin yeri sınırlı olmakla birlikte taş oluşumunun önlenmesi ve böbrek hasarının giderilmesi, böbrek hasarının önlenmesi için yeni ajanlara ihtiyaç vardır.
Hidroksiprolin, oksalata metabolize olup üriner oksalat atılımını arttırarak kalsiyum oksalat taşı oluşumuna neden olan bir aminoasittir (22). Bu özelliğiyle ratlarda böbrek taşı modeli oluşturmak amacıyla kullanılır. Ratlarda taş oluşturmak için kullanılan bir diğer madde de etilen glikol dür. Etilen glikol de idrarda oksalat konsantrasyonunu arttırıp, hiperoksalüriye neden olarak kalsiyum oksalat taşlarının oluşumuna neden olur (23).
Üriner sistem taş hastalarında obstrüksiyona bağlı olarak GFR düşer ve buna bağlı olarak kanda üre, ürik asit, kreatinin gibi artık azotlu maddelerin düzeyleri yükselir. Aynı zamanda taş oluşturucu diyet ile beslenen ratlarda lipid peroksidasyonunun arttığı, antioksidan potansiyelin azaldığı çalışmalarda gösterilmiştir (23). Çalışmamızın histolojik incelemelerinde ratların böbreklerinde kalsiyum depozitleri izlenmemiş olsa da daha önce yapılan çalışmalarla uyumlu olarak geçirimli elektron mikroskopi (TEM) bulgularında taş oluşturucu diyet ile beslenen ratlarda böbrek hasarı (çekirdek zarında şişme, kromatin yoğunlaşması, lizozomal artış, bazal membranda kalınlaşma, mitokondri yapısında bozulma, mitokondriyel şişme) bulguları görülmüştür.
Baicalein, in vitro ve in vivo ortamlarda anti inflamatuar özellikler gösteren potent bir antioksidandır (24). Çalışmamızda taş oluşturucu diyetle birlikte baicalein alan ratlarda böbrek hasar bulgularının daha az olduğu, bazal membran, çekirdek ve mitokondri yapılarının daha düzgün olduğu görülmüştür.
İnflamasyon ve böbrek hasarı durumlarında yükseldiği çalışmalarda gösterilmiş olan IL-18, KIM-1, NAG, NGAL belirteçlerinin çalışmamızda böbrek dokusunda özellikle hidroksiprolin ile oluşturulan modelde daha yüksek olduğu saptanmıştır. Ayrıca baicalein taş oluşturucu diyetle birlikte baicalein verilen ratlarda bu belirteç değerlerinin daha düşük olduğu görülmüştür. OPN değerinin ise tüm gruplarda artmış olması nedeniyle böbrek taşı ve böbrek hasarı ile ilgili net bir bilgi sağlamamıştır. Serum ve idrarda da benzer sonuçlar olmakla birlikte hidroksiprolin ve etilen glikol ile beslenen ratlarda böbrek hasar ve
33
inflamasyon belirteçlerinin daha yüksek olduğu, baicalein verilen gruplarda bu belirteç düzeylerinin daha düşük olduğu görülmüştür.
34
5. SONUÇ
Üriner sistem taşları böbrekte böbrek hasarı ve inflamasyon oluşturur. Mikroskobik bulgular ve IL-18, KIM-1, NAG, NGAL ve OPN gibi belirteçler bu inflamasyonun göstergesi olabilir.
Üriner oksalat atılımının artması üriner sistemde kalsiyum oksalat taşı oluşumuna neden olarak taşa bağlı hasar ve inflamasyon yaratır. Bu hasarın önlenmesi ve tedavi edilmesi antioksidan mekanizmalar tarafından gerçekleştirilebilir. Araştırmamızda antioksidan özelliği olan baicalein maddesinin hasarlanmaya maruz kalan böbreklerde inflamasyonu ve böbrek hasarını azalttığı gösterilmiştir.
35
KAYNAKLAR
1) Muslumanoglu AY, Binbay M, Yuruk E, Akman T, Tepeler A, Esen T, Tefekli AH.
Updated epidemiologic study of urolithiasis in Turkey. I: Changing characteristics of urolithiasis. Urol Res. 2011;39(4):309-14.
2) Özçelik R, Satar N, Doran Ş, Arıdoğan İ, Bayazıt Y, Zeren S, Anafarta K, Yaman Ö, Üriner Sistem Taş Hastalığı İn: Anafarta K, Gögüş O, Arıkan N, Bedük Y, Temel Üroloji, Ankara: 1998:561–603
3) McMartin K. Are calcium oxalate crystals involved in the mechanism of acute renal failure in ethylene glycol poisoning? Clin Toxicol (Phila) 2009; 47: 859-869 [PMID: 19852621 DOI:
10.3109/15563650903344793]
4) White E, Karp C, Strohecker AM, Guo Y & Mathew R (2010) Role of autophagy in suppression of inflammation and cancer. Curr Opin Cell Biol 22, 212–217.
5) Lai CC, Huang PH, Yang AH, Chiang SC, Tang CY, Tseng KW, Huang CH. Baicalein, a Component of Scutellaria baicalensis, Attenuates Kidney Injury Induced by Myocardial Ischemia and Reperfusion. Baicalein, a Component of Scutellaria baicalensis, Attenuates Kidney Injury Induced by Myocardial Ischemia and Reperfusion.
6) Pak CY, Peterson R, Sakhaee K, Fuller C, Preminger GM, Reisch J. Correction of hypocitraturia and prevention of Stone formation by combined thiazide and potassium citrate therapy in thiazide unresponsive hypercalciuric nephrolithiasis. Am J Med 1985: 284 – 288.
7) Taylor EN, Stamfer MJ, Curhan GC. Obesity, weightgain, and the risk of kidney Stones.
JAMA 2005; 293(4): 455 – 462.
8) Meyer JL. Nucleation kinetics in the calcium oxalate-sodium urate mono-hydrate system.
Invest Urol 1981;19:197-201.
9) Stoller LM, Bolton DM, Üriner Taş Hastalığı: Tanagho EA, McAninch JW, Smith Genel Üroloji, İstanbul:1999;15: 277-04.
10) Pak CYC, Sakhaee K, Fuller C. Successful management of uric acid nephrolithiasis with potassium citrate. Kidney Int 1986;30:422-8.
11) Cohen TD, Streem SB, Hall P. Clinical effect of captopril on the formation and growth of cystine calculi. J Urol 1995;154:164-6.
12) Segura JW, Preminger GM, Assimos DG, Dretler SP, Kahn RI, Lingeman JE, et al.
Nephrolithiasis Clinical Guidelines Panel summary report on the management of staghorn calculi. J Urol 1994;151:1648-51.
36
13) Laerum E, Larsen S. Thiazide prophylaxis of urolithiasis. Acta Med Scand 1984;215:
383–9.
14) Menon M, Resnick MI. Urinary lithiasis: etiology, diagnosis and medical management.
In: Walsh RC, Retik AB, Vaughan AB, Kavoussi LR, Novick AC, Partin AW, Peters CA, Wein AJ.(eds): Campbell’s Urology 8th edition. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 2002:3229-304.
15) Welshman SG, McGeown MG. The relationship of the urinary cations, calcium, magnesium, sodium and potassium, in patients with renal calculi. Br J Urol 1975;47:237- 242.
16) Anafarta K, Arıkan N, Bedük Y Temel Üroloji: Bölüm 14, üriner sistem taş hastalığı, 2011, pp 661-667
17) Rutchik SD, Spirnak JP, Resnick MI. Calculous disease of the urinary tract. In:Pollack HM, Mclennan BL (eds), Clinical urography (2nd ed), W.B.Saunders Company, USA 2000, pp, 2137-2145
18) Hautmann R. Primary hyperoxaluria familial oxalosis. In:Kaufman JJ (eds), Current urologic therapy W.B.Saunders Company, USA 1980, pp,123-147
19) Ruiz Morcellan FJ, Ibraz Servio L, Salinas Duffo D. Infective lithiasis.treatment and complications. Arch Esp Urol.2001; 54(9):937-50
20) Lerner PS. Infection stones J Urol. 1989; 141: 753-8
21) Anafarta K, Arıkan N, Bedük Y Temel Üroloji: Bölüm 14, üriner sistem taş hastalığı, 2011, pp 667,668
22) Davıd A. Bushınsky, John R. Asplın, Marc D. Grynpas, Andrew P. Evan, Walter R.
Parker, Krısten M. Alexander, And Fredrıc L. Coe Calcium oxalate stone formation in genetic hypercalciuric stone-forming rats Kidney International, Vol. 61 (2002), pp. 976
23) Ravindra V. Karadi, Navneet B. Gadge, K.R. Alagawadi, Rudraprabhu V. Savadi Effect of Moringa oleifera Lam. root-wood on ethylene glycol induced urolithiasis in rats Journal of Ethnopharmacology 105 (2006) 306–311
24) Tsai CL, Lin YC, Wang HM, Chou TC. Baicalein, an active component of Scutellaria baicalensis, protects against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats. J Ethnopharmacol. 2014; 153: 197–206. pmid:24534526
37 EK-1
PROJE TOPLAM BÜTÇESİ: 49659.93 TL HARCANAN MİKTAR: 49236,77 TL EK DESTEK: - 2874 TL
