Uygulamanın Sonuçları ve Değerlendirilmesi.

A sobrevivência dos protocormos após vitrificação em gotículas foi afetada pelas concentrações de sacarose nos pré-tratamentos e também pelos crioprotetores associados com a solução desidratante. Aos 30 dias após remoção da criopreservação, nenhuma plântula desenvolveu a partir de protocormos pré- cultivados durante 24h em sacarose 0,06M (D1-D3) ou 0,9M sacarose por 24h (D10- D12). No entanto, protocormos pré-cultivados em 0,3M (D4-D6) ou 0,6M (D8-D9)

P

A

C

D

B

A

antes da desidratação por gotícula de vitrificação apresentou um efeito positivo na sobrevivência dos protocormos, com variação entre 3 a 17% (Tabela 2).

Tabela 2 – Sobrevivência de protocormos (SP%), protocormos com formação de folhas (PFF%), protocormos com formação de calos (PFC%), protocormos com formação de raízes (PFR%), número de plantas formadas (NPF) e altura da planta (AP, cm) avaliado 75 dias após criopreservaçãoa por gotículas de vitrificação de protocormos do híbrido Dendrobium Swartz. ‗Dong Yai‘.

Tratamentos Pré-lavagemb 30 dias 75 dias SP (%) PFF (%) PFC (%) PFR (%) NPF AP (cm) D1 0bc 0c 0b 0c 0c 0b D2 0b 0c 0b 0c 0c 0b D3 0b 0c 0b 0c 0c 0b

D4 16,5a 4,0ab 9,5a 6,0ab 6,0b 1,6a

D5 15,3a 8,0a 1,2b 11,0a 14,0a 1,5a

D6 17,0a 8,0a 7,0a 4,0ab 5,0b 1,2ab

D7 2,8b 0c 2,3b 0c 0c 0b D8 5,5b 1,0b 2,7b 1,0b 1,0c 1,1ab D9 3,0b 0c 3,0b 0c 0c 0b D10 0b 0c 0b 0c 0c 0c D11 0b 0c 0b 0c 0c 0c D12 0b 0c 0b 0c 0c 0c C.V.(%) 29,22 34,8 28,44 32,22 2,5 27,07

a _{Protocormos foram submetidos ao controle e tratamentos durante 15 min antes da} imersão em NL durante 60 min.

b _{D1: Controle: 0,06 M sacarose + PVS2 15 min; D2: 0,06 M sacarose + PVS2 15} min + 1% floroglucinol; D3: 0,06 M sacarose + PVS2 15 min + 1% Supercool X1000®_{; D4: 0,3 M sacarose + PVS2 15 min; D5: 0,3 M sacarose + PVS2 15 min +} 1% floroglucinol; D6: 0,3 M sacarose + PVS2 15 min + 1% Supercool X1000®; D7:

floroglucinol; D9: 0,6 M sacarose + PVS2 15 min + 1% Supercool X1000®_{; D10: 0,9} M sacarose + PVS2 15 min; D11: 0,9 M sacarose + PVS2 15 min + 1% floroglucinol; D12: 0,9 M sacarose + PVS2 15 min + 1% Supercool X1000®. Avaliação de SP e PFF foi realizada 30 dias após remoção do NL e cultivo em meio de cultura ½ MS. Avaliação para PFC, NPF e AP foram realizados 75 dias após remoção do NL e cultivo em meio de cultura ½ MS.

Protocormos pré-cultivados em sacarose 0,3M durante 24h seguido de exposição a PVS2 tanto sozinha (D4) quanto PVS2 contendo 1% floroglucinol (D5), ou PVS2 com 1% supercool X1000® (D6) apresentaram a mais alta sobrevivência (15-17%) e PFF (4-8%) aos 30 dias em meio de cultura ½ MS após criopreservação, e não diferiram significativamente (Tabela 2). Sobretudo, o maior NPF foi proveniente de protocormos pré-cultivados em sacarose 0,3M durante 24h seguido da exposição em PVS2 com 1% floroglucinol durante 15 min (D5), com 14% de formação de plantas (Tabela 2). O mesmo tratamento retornou o maior percentual de PFR (11%) e AS (1,5 cm) comparável a D4 e D6 (Tabela 2). Tratamentos D4 e D6 apresentaram intermediários NPF (5-6%) e PFR (4-6%), e AP similares (1,2-1,6 cm), comparado a D5. Tratamentos D4 e D6 formaram o mais alto PFC (7-9,5%) quando comparado a D5 (1,2%) (Tabela 2). A maioria dos calos formados tinha coloração escura e não gerou plantas (Fig 2A).

Fig. 2. Protocormos recuperados do híbrido Dendrobium Swartz.‗Dong Yai‘ após criopreservação por vitrificação em gotículas. (A) Plântulas regeneradas (setas brancas) e calos (setas cinzas) após 75 dias em cultivo. Barra = 1,0 cm. (B) Plântula completamente desenvolvida após 3 meses. Barra = 1,0 cm. (C) Detalhe da plântula completamente formada. Barra = 1,0 cm. (D) Plântulas aclimatizando em casa de vegetaçao. Barra = 5,0 cm.

As plantas in vitro desenvolveram brotos saudáveis e raízes sem o uso de reguladores. Plantas bem enraizadas foram transferidas para casa de vegetação e aclimatizadas com sucesso, e apresentaram crescimento sem anormalidades.

A

B

D

4. Discussão

4.1. Vitrificação de sementes maduras

O teste de viabilidade de sementes desempenha um papel determinante na eficiência de protocolos criopreservantes para sementes de orquídeas. Portanto, os testes de viabilidade de sementes devem ser rápidos e precisos. O teste de 2,3,5- trifenil cloreto de tetrazólio (TTC) é um teste de viabilidade comumente utilizado e tem sido recomendado para acessar a viabilidade de sementes criopreservadas por Verleysen et al (2004). Este teste também tem sido usado com sucesso para a criopreservação de sementes de orquídeas (Ishikawa et al., 1997; Hirano et al., 2005; 2009; 2011; Vendrame et al. 2008). Neste estudo, o teste TTC proporcionou um resultado preciso para a viabilidade de sementes de Dendrobium Swartz. ‗Dong Yai‘ antes da criopresrvação.

Há diversos fatores que podem influenciar na recuperação pós- descongelamento de explantes criopreservados, incluindo a fase de descongelamento do material vegetal, condições de pré-cultivo e tempo de exposição da solução vitrificante (Benson, 2008). No presente estudo, não houve sobrevivência para as sementes que não foram expostas ao PVS2 . Em contraste, a exposição ao PVS2 durante 60 min forneceu desidratação e crioproteção suficiente e permitiu um percentual de germinação de 51%.

Similarmente, diferentes genótipos de Dendrobium híbridos apresentaram percentuais de germinação variando de 49 a 63% quando utilizado a vitrificação com PVS2 durante 60 min (Vendrame et al., 2007). Baixo teor de umidade dos tecidos é importante para a o sucesso na criopreservação (Benson, 2008; Engelmann, 2011). A desidratação causada pela exposição de tecidos à solução PVS2 é um passo essencial na criopreservação. Isso é crítico para a recuperação e sobrevivência do tecido porque a desidratação permite a redução do conteúdo de água nas células evitando os danos físicos causados por cristais de gelo durante o congelamento (Sakai et al., 1991).

No entanto, a germinação de sementes foi ampliada para 79% com a adição de 1% de floroglucinol na solução PVS2, comparado a germinação de 51% quando aplicado PVS2 apenas ou sem germinação na ausência de PVS2. Floroglucinol apresenta um efeito sinergístico com auxinas, promovendo a formação de raízes in vitro em algumas espécies lenhosas (Goudarzi et al., 1997; Demiralay et al., 1998; Sharifian et al., 2009). No mais, floroglucinol tem propriedades antioxidantes e reduz o estresse oxidativo nas células (Kang et al., 2006; Kim e Kim, 2010). Neste estudo, enquanto a solução vitrificante (PVS2) reduz o conteúdo de umidade e amplia a germinação, comparado com o controle, enquanto imerso em NL ou não, um potencial efeito sinergístico com floroglucinol pode ter ocorrido, como identificado pelo efeito significativo do aumento na germinação de sementes e na sobrevivência. Os mecanismos específicos de ação do floroglucinol neste estudo não foram apresentados, pois este não foi o escopo deste trabalho. Entretanto, estudos adicionais serão necessários pois poderão apresentar importantes informações para elucidar tais mecanismos.

Como forma de estocagem de germoplasma, sementes têm sido relatadas como a maneira mais conveniente (Kaviani, 2011). No presente estudo, a criopreservação por vitrificação de sementes está confirmada como método efetivo para sementes de Dendrobium híbrido.

4.2. Vitrificação em gotículas de protocormos

A criopreservação utilizando vitrificação pode ser danosa devido tanto ao estresse osmótico quanto a toxicidade causada pela exposição direta à solução vitrificante (Matsumoto et al., 1994). Assim, o pré-cultivo de tecidos de plantas é um passo importante para promover a sobrevivência de células criopreservadas como isso pode ampliar a tolerância ao congelamento (Yin e Hong, 2009). O pré-cultivo de tecidos em sacarose tem sido relatado para a promoção de sobrevivência de tecidos de orquídeas criopreservados (Ishikawa et al., 1997; Hirano et al., 2005; Gonzalez- Arnao et al., 2008). No presente estudo, o pré-tratamento de protocormos do Dendrobium híbrido com altas concentrações de sacarose parece ter melhorado a

tolerância deles a exposição à PVS2 e ampliou a recuperação após a criopreservação.

O acúmulo de açúcares solúveis e álcoois de açúcar no citoplasma dos tecidos auxilia a proteção de proteínas e membranas no estabelecimento do estado vitrificado durante a criopreservação dos efeitos nocivos da desidratação e congelamento em NL (Miao et al., 2005; Sakai e Engelmann, 2007; Yin e Hong, 2009). Além disso, as interações entre açúcares e proteínas resistentes ao aquecimento podem desempenharr um papel importante na melhoria da tolerância à desidratação de células vegetais (Bian et al., 2002). A alta osmolaridade criada pela sacarose pode induzir a síntese endógena de ácido abscísico, a qual, consequentemente, reduz o conteúdo de água endógeno (Bian et al., 2002; Rowntree et al., 2007). Neste estudo, o melhor tratamento (D5) apresentou baixa recuperação (14%); embora este resultado seja comparável com o percentual obtido para ápices de brotos do híbrido Dendrobium ‗Walter Oumae‘ criopreservado por encapsulaçao-desidratação após pré-cultivo em sacarose 0,3M durante 48h com sobrevivência de 13,3% (Lurswijidjarus e Thammasiri, 2004).

Diferentes tecidos de orquídeas exibem níveis variados de tolerância a açúcar (Yin e Hong, 2009), levando em consideração as diferenças observadas nos tempos de pré-cultivo em sacarose. Baixa tolerância à sacarose é bem demonstrada para protocormos de Dendrobium nobile, que embora tenham sido criopreservados com sucesso usando vitrificação e floroglucinol sem sacarose, o pré-tratamento com sacarose reduziu a sobrevivência em 90% (Vendrame e Faria, 2011).

A criopreservação impõe uma série de estresses ao explante, tornando-o suscetível a modificações em culturas criopreservadas e plantas regeneradas (Engelmann, 2011). No presente estudo, os tratamentos D4 e D6 induziram ampla formação de colus (7,0-9,5%) se comparado a D5 (1,2%). Alterações na organização estrutural de células como resultado de injúrias por congelamento pode alterar consequentemente as respostas no crescimento com indução de reações de crescimento muito lento ou errático (Towill, 2002), tais como a formação de calos observados neste estudo.

Enquanto a adição de floroglucinol ampliou a recuperação de protocormos do Dendrobium híbrido neste estudo, Supercool X1000® aplicado a 1% na solução

PVS2 foi ineficiente. Tem sido relatado que a aplicação de baixas concentrações (0,1-1,0%) de Supercool X1000® pode resultar em altos índices de sobrevivência para a criopreservação de tecidos humanos e de plantas (Wowk et al., 2000). Em batata, concentrações de 0,1 e 1% resultaram na melhor eficiência para a sobrevivência de ápices caulinares, mas eles foram dependentes do genótipo utilizado (Zhao et al., 2005). Novos estudos envolvendo os efeitos do genótipo bem como de diferentes concentrações de Supercool X1000® serão necessários para avaliações futuras da efetividade do produto como agente crioprotetor para protocormos.

5. Conclusões

Neste estudo foi demonstrado que a criopreservação de sementes de Dendrobium Swartz. híbrido ‗Dong Yai‘ é melhorada pelo floroglucinol, com alta viabilidade de sementes e germinação. A adição de Supercool X1000® não melhorou a germinação de sementes. A criopreservação de protocormos usando a vitrificação em gotículas apresentou sucesso limitado, embora floroglucinol tenha ampliado a sobrevivência e o número de plântulas formadas após a criopreservação. De maneira similar às sementes, Supercool X1000® _{não ampliou a sobrevivência de} protocormos. A utilização da criopreservação para a estocagem a longo prazo de sementes da orquídea Dendrobium tanto para conservação de germoplasma ou melhoramento para propósitos comerciais pode ser melhor desenvolvida utilizando PVS2 e floroglucinol como crioprotetores. A criopreservação de protocormos apresentou-se mais trabalhosa e com sucesso limitado usando os mesmos crioprotetores usados para sementes. Não obstante, um efeito do genótipo pode ter ocorrido para a baixa resposta de protocormos do Dendrobium Swartz. híbrido ‗Dong Yai‘ por criopreservação por vitrificação. Estudos adicionais utilizando genótipos de diferentes Dendrobium e concentrações adicionais de Supercool X1000® e floroglucinol serão requeridos para melhorar a recuperação e sobrevivência de protocormos após a criopreservação.

Agradecimentos

Os autores agradecem o Conselho Nacional para o Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Ministério de Ciência e Tecnologia, Brasil) e a Universidade da Flórida por fornecer fundos e apoio para esta pesquisa. Agradecem também à senhora Alba Myers e à senhorita Ania Pinares pelo auxílio técnico.

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Criopreservação, desenvolvimento inicial de plântula e estabilidade genética de Oncidium flexuosum Sims (*)

CAPÍTULO 4

* Artigo publicado na revista científica Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v.114, n.1, p.139-148, 2013.

Resumo:

Um protocolo de criopreservação eficiente foi desenvolvido para sementes maduras de Oncidium flexuosum Sims. A morfologia de sementes, formação de protocormos, e desenvolvimento inicial de plântulas foram observados. O efeito de floroglucinol e Supercool X1000® como aditivos crioprotetores na solução vitrificante foram investigados. Desidratação utilizando a solução vitrificante 2 (PVS2) durante 60 e 120 min antes da imersão em nitrogênio líquido promoveu a mais alta germinação in vitro seis semanas após o cultivo em meio nutritivo MS com metade da concentração de sais (½ MS). A germinação sementes maduras submetidas a vitrificação durante 120 min na PVS2 com 1% floroglucinol a 0 °C estendeu a germinação em 68%, enquanto em PVS2 com 1% Supercool X1000® a germinação foi ampliada moderadamente (26%). Plântulas germinadas in vitro desenvolveram raízes e brotos sem a utilização de reguladores vegetais. Aos seis meses de cultivo, não houve diferenças entre plântulas crescidas in vitro e ex vitro para várias características fenotípicas, incluindo comprimento de brotos, número de folhas, número e comprimento de raízes, massa fresca e massa seca. As plântulas foram transferidas para condições de casa de vegetação e aclimatizadas com sucesso e posteriormente desenvolveram plantas normais com mais de 90% de sobrevivência. Análise comparativa de plântulas do controle e sementes vitrificadas usando citometria de fluxo indicou que nenhuma alteração nos níveis de ploidia ocorreu como resultado da criopreservação, portanto, a estabilidade genética foi mantida. Neste estudo, a vitrificação com PVS2 durante 120 min e adição de 1% floroglucinol ofereceu um protocolo simples, seguro e factível para a criopreservação de sementes maduras de O. flexuosum.

Palavras-chave

Vitrificação, Orquídea nativa, Germianação In vitro, Características fenotípicas, Análise de citometria de fluxo

Abreviações

DMSO – Dimetil sulfóxido FCM – Citometria de fluxo

NL – Nitrogênio líquido SL – Solução de lavagem

½ MS – Meio nutritivo Murashige e Skoog (1962) com metade da força dos sais PVA – Polivinil álcool

PVS2 – Solução vitrificante de plantas 2 TTC – Teste 2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio

Introdução

Orquídeas são apreciadas pelo seu apelo ornamental e valores medicinais e etnobotânicos, sendo uma das plantas ornamentais mais populares no mundo inteiro (Arditti, 1992; Kong et al. 2003; Chugh et al. 2009). As populações de espécies de orquídeas estão experimentando um amplo declínio em países tropicais devido a destruição de seu hábitat natural e contínua coleta ilegal para comércio. Consequentemente, elas estão na linha de frente das extinções e é essencial o desenvolvimento de meios para a conservação e propagação de seus recursos genéticos. Como uma apólice de seguro contra as extinções, a conservação ex sito de sementes é adequada e estimada a uma fração do custo da conservação in situ (Li e Pritchard 2009).

Entre os milhares de gêneros de orquídeas, Oncidium Sw. é um grande gênero que inclui mais de 400 espécies distribuídas pela América tropical (Chase et al. 2009). Espécies naturais e híbridos cultivados são explorados como flores de corte ou de pote (Chen e Chang, 2000). Uma espécie particular, Oncidium flexuosum Sims. é nativa do Brasil, Paraguai, Argentina e altamente adequada para usos ornamentais e medicinais. A inflorescência é produzida na base do pseudobulbo e pode chegar a 1 metro de comprimento com pequenas ramificações de 10-15 flores por ramo, com cerca de 2,5 cm cada. As pétalas e sépalas são amarelas, com faixas marrons e transversais, sendo o labelo realçado com pintas vermelhas (Pridgeon e Morrison 2006). Recentemente, esta espécie foi relatada por ter propriedades medicinais. O composto ativo de suas folhas é empregado para a elaboração de um extrato hidroalcoólico o qual acelera a cicatrização e é efetivo para o tratamento de feridas (Gaspi et al. 2011).

O emprego da conservação de germoplasma está aumentando e se tornando uma atividade essencial pelo mundo todo devido à alta taxa de desaparecimento de espécies de plantas e necessidade de estocagem segura do patrimônio florístico de muitas nações (Kaviani, 2011). Criopreservação proporciona a estocagem de material biológico em temperaturas ultra-baixas ( -196 °C), e é reconhecida como única técnica atualmente disponível para garantir um método de estocagem de

germoplasma a longo prazo de maneira eficiente e com custo baixo (Sakai e Engelmann 2007; Reed 2008). Criopreservação de Oncidium tem sido focada principalmente em híbridos (Miao et al. 2005; Yin et al. 2011) e apenas um único estudo para a espécie Oncidium bifolium (Flashsland et al. 2006).

Entre os métodos de criopreservação descritos para diferentes explantes, a vitrificação é uma técnica simples que não requer equipamentos caros ou passos trabalhosos (Engelmann 2004). Além disso, a criopreservação por vitrificação tem provado ser uma eficiente técnica para a eliminação de patógenos de plantas (Ding et al 2008; Wang e Valkonen 2009). Para orquídeas, a criopreservação de sementes representa o método mais efetivo e econômico para estocagem de germoplasma e tem sido reportado para espécies raras (Hirano et al. 2005; 2009; 2011; Nikishina et al. 2007; Thammasiri 2007; Thammasiri e Soamkul 2007) e híbridos comerciais (Popova et al. 2003; Popov et al. 2004; Vendrame et al. 2007; Galdiano et al. 2012).

A seleção apropriada de crioprotetores e o tempo de exposição à solução vitrificante são fatores-chave para o desenvolvimento de protocolos vitrificantes. Estes procedimentos reduzem a potencial toxicidade destas substâncias às células de plantas e aumentam a recuperação do material vegetal após a criopreservação. Floroglucinol, um benzenotriol extraído da alga marrom Ecklonia cava (Kim e Kim, 2010) e Supercool X1000®_{, um potencial agente bloqueador da formação de gelo} que é um polímero parcialmente hidrolisado de polivinil álcool (PVA) foram utilizados em estudos anteriores como aditivos crioprotetores para a vitrificação de brotos vegetais (Zhao et al. 2005; Vendrame e Faria 2011; Galdiano et al 2012).

A manutenção da integridade genética do material vegetal é um aspecto importante quando utilizado em protocolos de criopreservação (Harding 2004). Citometria de fluxo (FCM) oferece a técnica reprodutível de análise de conteúdo de