B. Mecelleye Göre Hâkimin Vasıfları
II. ULUSLARARASI BELGELER
A etapa de modelagem da superfície de resposta é a otimização do método cromatográfico propriamente dito. O objetivo principal identificar qual a região do espaço químico de trabalho na qual seria possível obter a melhor separação. Entre as estratégias utilizadas para a modelagem da superfície, o planejamento de composto central é o que permite que os experimentos sejam realizados em um maior número de níveis: 2 na parte cúbica, 2 axiais e 1 central (FIGURA 4.35), levando a um melhor ajuste do modelo que descreve as condições ótimas.
As resoluções entre as bandas cromatográficas foram utilizadas como variáveis dependentes, assim como foi feito na etapa anterior. Nesse trabalho, o método seria utilizado em todo o estudo de caracterização do extrato de folhas de amoreira, mas ele também poderia ser utilizado em análises de rotina para monitoramento da qualidade dos extratos e principalmente, para o monitoramento da autenticidade do material vegetal. Dessa forma, decidiu-se que o tempo de retenção para o último analito observado (trz) também deveria ser considerado como variável
dependente no planejamento, visto que em análises de rotina, um menor tempo de análise é desejável por reduzir o consumo de solventes.
FIGURA 4.35 - Representações da distribuição dos experimentos no planejamento de composto central fator 1 fator 2 fator 3
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
+
+
+
-
-
149
Devido ao número de variáveis dependentes, os valores de Rs nessa etapa também foram transformados em funções de desejabilidade individuais, de acordo com as equações 4.3 e 4.4. Para a transformação dos valores de trz, foi
utilizada a função matemática abaixo (equação 4.5), uma vez que o objetivo era minimizar o tempo total de análise, sem comprometer a seletividade e a eficiência do método. { ( )
onde Li e Ui são respectivamente o menor e o maior valor observados para trz. Os
valores de Dtotal (calculados pela equação 4.3) obtidos para planejamento estão
apresentados no ANEXO 4. As superfícies de respostas obtidas com base em um modelo matemático quadrático (r2 = 0,8355), descrito pela equação 4.6 (onde xn
representa o valor codificado para uma das 3 variáveis) estão ilustradas na FIGURA 4.36.
De acordo com os valores apresentados na análise ANOVA (TABELA 4.7), o modelo quadrático está bem ajustado ao conjunto de dados, o que também pode ser observado no gráfico de valores experimentais versus preditos (FIGURA
4.37A). O gráfico de resíduos, por sua vez, mostra que há homocedasticidade nas respostas observadas, visto que os resíduos não apresentam uma tendência (os valores flutuam em torno do zero) (FIGURA 4.37B). Além disso, o modelo explica 77,4% da variância total dos dados. Embora, à primeira vista esse valor possa parecer baixo, ele é satisfatório, uma vez que a função Dtotal resultou da combinação
matemática de muitas respostas experimentais.
eq. 4.6
150
FIGURA 4.36 - Superfícies de resposta obtida para a otimização dos parâmetros cromatográficos. A terceira variável foi fixada no valor ótimo previsto pelo modelo.
TABELA 4.7 - Tabela ANOVA para o modelo gerado pelo planejamento de composto central para a otimização dos parâmetros cromatográficos
ANOVA – otimização para cromatografia
variação SQ g.l. MQ F p
Regressão 0,1010 3 0,03366 15,98 <0,0001 Resíduo 0,02949 14 0,02107
F. ajuste 8,72E-5 11 7,93E-6 3,247 0,0662 Erro puro 7,33E-6 3 2,44E-6
total 0,1305 17
% variação máxima explicada 77,39 % variação máxima explicável 99,99
SQ: soma quadrática; g.I.: graus de liberdade; MQ: média quadrática; F: valor calculado para o teste F; p: probabilidade da
hipótese nula ser verdadeira (a = 0,05); F. ajuste: falta de ajuste
observado x previsto
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45
valor observado experimentalmente
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 v al or p re v is to p el o m o d e lo gráfico de resíduos -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 número do experimento -0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 re s íd u os
FIGURA 4.37 - A: Gráfico dos valores experimentais versus previstos pelo modelo
matemático; B: gráfico da distribuição dos resíduos para a otimização dos parâmetros cromatográficos
Nas superfícies de contorno apresentadas na FIGURA 4.36 notou-se que no espaço experimental avaliado, havia uma região na qual seria possível obter boa seletividade em um tempo reduzido de análise. Uma condição foi escolhida
151
então nessa região e, de acordo com o modelo, a desejabilidade máxima (Dmax)
seria 0,396 (TABELA 4.8). Experimentalmente o valor alcançado para Dmax foi 0,364,
próximo do valor teórico. Nessas condições, o método apresentou uma boa seletividade, eficiência e uma faixa de retenção bem distribuída no curto tempo de gradiente (FIGURA 4.38). Sendo assim, decidiu-se utilizar essas condições em todas as análises subsequentes do trabalho.
TABELA 4.8 - Parâmetros cromatográficos selecionados no espaço experimental na região ótima sugerida pelo modelo de superfície de resposta
Condições experimentais
%Bi tG (min) pH prevista Dmax obtida Dmax
18 (0,6) 10 (-2) 2.96 (+1) 0,396 0,364
Os valores entre parêntese indicam os fatores codificados no planejamento experimental
FIGURA 4.38 - Condições cromatográficas otimizadas para o método analítico.
Fase A: H2O/HCOOH 0,025%; Fase B: ACN/HCOOH 0,025%; Gradiente: 18 -40%, 10min, 40% em 5
min; Detecção: DAD 200-800 nm; Vazão: 600 L.min-1. Vol. injeção: 5 L; Temperatura: 40o
C
b) otimização dos parâmetros espectrométricos
Uma análise por espectrometria de massas é baseada em medidas de quantidades de íons. Portanto, para que os analitos separados na cromatografia sejam detectados em um espectrômetro é fundamental que os mesmos estejam ionizados. Uma vez carregados, os analitos ionizados são “conduzidos” desde o cone de Taylor (na fonte ESI) até o fotomultiplicador (detector do espectrômetro) por diferenças de potencial aplicadas nas diversas partes que constituem o espectrômetro. O ajuste correto dessas diferenças de potencial -ou energias- aplicadas, somado ao controle da pressão dos gases que ajudam na dessolvatação e eliminação de interferentes, foi de grande importância tanto para a identificação dos analitos quanto para a sensibilidade analítica de um método quantitativo. Caso os potenciais não estivessem bem ajustados, poucos íons atingiriam o detector,
152 comprometendo a análise.
A intensidade observada para as bandas cromatográficas principais foi escolhida como variável dependente. O espectrômetro utilizado (API 2000), todavia, possuía uma limitação técnica no tempo necessário para aquisição dos dados referentes a uma varredura completa da faixa de m/z de 200 a 800 u.m.a. Por isso, a faixa total de massas foi subdividida em intervalos de 100 u.m.a. e as análises foram realizadas simultaneamente nos modos de ionização positivo e negativo.
As intensidades observadas para cada subdivisão e, em cada polaridade, foram transformadas em funções de desejabilidade (equação 4.7), com o objetivo de maximizar a resposta do detector. As funções individuais foram então combinadas na Dtotal conforme a equação 4.4 com valores apresentados no ANEXO
5.
{
( )
onde intn é a intensidade observada no cromatograma de íons totais (TIC) para uma
banda cromatográfica, Li e Ui são respectivamente o menor e o maior valor
observados para intn.
As superfícies de respostas obtidas (FIGURA 4.39) foram baseadas em no modelo quadrático descrito pela equação 4.8 (onde xn representa o valor
codificado para uma das 7 variáveis).
De acordo com os valores apresentados na ANOVA (TABELA 4.9), o modelo quadrático está bem ajustado ao conjunto de dados, o que também pode ser observado no gráfico de valores experimentais versus preditos (FIGURA 4.40A). O
gráfico de resíduos, por sua vez, mostra que há homocedasticidade nas respostas observadas, visto que os resíduos não apresentam uma tendência, flutuando os valores em torno do zero (4.40B).
eq. 4.8
153
FIGURA 4.39 - Superfícies de resposta obtida para a otimização dos parâmetros espectrométricos. A terceira variável foi fixada no valor ótimo previsto pelo modelo.
154
TABELA 4.9 - Tabela ANOVA para o modelo gerado pelo planejamento de composto central para otimização dos parâmetros espectrométricos
ANOVA – otimização para espectrometria variação SQ g.l. MQ F p
Regressão 0,3679 12 0,03066 64,85 <0,0001 Resíduo 0,009457 20 4,73E-4
F. ajuste 8,33E-10 18 4,63E-11 1,389 0,2401 Erro puro 6,67E-11 2 3,33E-11
total 0,3774 32
% variação máxima explicada 97,49 % variação máxima explicável 100,00
SQ: soma quadrática; g.I.: graus de liberdade; MQ: média quadrática; F: valor calculado para o teste F; p: probabilidade da hipótese nula
ser verdadeira (a = 0,05); F. ajuste: falta de ajuste
real x previsto
-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
valor real observado -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 va lo r p re visto p e lo m o d e lo gráfico de resíduos -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 número do experimento -0.05 -0.04 -0.03 -0.02 -0.01 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 re sí d u o s
FIGURA 4.40 - A: gráfico de valores experimentais versus valores
preditos pelo modelo quadrático. B: gráfico de resíduos para a otimização dos parâmetros espectrométricos
Nas superfícies de contorno apresentadas foi possível observar que, no espaço experimental avaliado, havia uma região onde seria possível obter as intensidades mais altas para as bandas cromatográficas no TIC do extrato. Nessa região, foram escolhidas as condições apresentadas na TABELA 4.10. De acordo com o modelo, a Dtotal obtida nessas condições seria 0,3996. Experimentalmente o
valor alcançado para a variável dependente foi 0,3947 e o cromatograma de íons totais obtido apresentou boa intensidade para todas as faixas de m/z avaliadas (200- 700 u.m.a) tanto no modo positivo, quanto no modo negativo de análise (FIGURA 4.38). Sendo assim, decidiu-se utilizar essas condições nas análises LC-MS subsequentes.
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TABELA 4.10 - Parâmetros espectrométricos selecionados no espaço experimental na região ótima sugerida pelo modelo de superfície de resposta
Condições experimentais
CUR IS GAS 1 GAS 2 DP FP EP prevista Dmax obtida Dmax
45 (1) 4.000 (1) 50 (-1) 13,3 (-1) 50 (-1) 312 (1) 10,2 (+1) 0,3996 0,3947
Os valores entre parêntese indicam os fatores codificados no planejamento experimental
FIGURA 4.41 - Análise cromatográfica do pool de extratos com detecção em DAD
(A) e nas condições otimizadas para os parâmetros espectrométricos nos modos negativo (B) e positivo (C). Fase A: H2O/HCOOH 0,025%; Fase B: ACN/HCOOH 0,025%;
Gradiente: 18 - 40%, 10min, 40% em 5 min; Detecção: DAD 200-800 nm; Vazão: 600 L.min-1
. Vol.
injeção: 5 L; Temperatura: 40o
C.CUR: 45 psi; IS: 4keV; TEMP: 400; GAS 1: 50 psi; GAS 2: 13,3 psi; DP: 50 eV; FP: 312 eV; EP: 10,2 eV.