Nessa etapa foram estudados alguns parâmetros envolvidos no preparo do material vegetal que poderiam alterar o perfil de flavonoides com a melhor atividade biológica: (i) tratamento de secagem das folhas; (ii) tempo mínimo de maceração; (iii) proporção de massa de material vegetal em relação ao volume de solvente extrator; e (iv) número de extrações sequenciais.. Para isso, extratos foram preparados em diferentes condições, mantendo-se a composição do solvente extrator em 30% de etanol. Todos os extratos foram preparados com agitação em vórtex por 30 s, turbólise por 1 min em 18.500 x g e maceração à temperatura ambiente e ao abrigo de luz. Após o preparo, foram centrifugados por 20 min, a 12000 rpm, 4oC, filtrados em membrana PVDF 0,22 m e secos à pressão reduzida. Cada extrato foi ressolubilizado na mesma composição do solvente extrator na concentração de 5,00 mg.mL-1 e analisados por LC-DAD nas condições mesmas condições utilizadas na etapa de validação do método analítico, apresentadas na TABELA 3.10.
Em relação à secagem do material vegetal foram considerados 3 procedimentos: secagem à sombra e temperatura ambiente, secagem em estufa e utilização da folha fresca, recém colhida. O material utilizado foi coletado no mês de setembro de 2012 e o procedimento de limpeza das folhas foi realizado conforme descrito na seção 3.1.1. Para cada tratamento foram preparadas triplicatas constituídas de 15 folhas de amoreira selecionadas aleatoriamente. A secagem à temperatura ambiente foi realizada à sombra durante 10 dias. A secagem em estufa foi realizada a 40oC durante 72 h (estufa de secagem Q317M, Quimis, São Paulo, Brasil). Os materiais secos foram moídos e peneirados em peneira granulométrica 500 mesh. Para o terceiro procedimento, após a higienização inicial, o excesso de água foi retirado em toalha absorvente e as folhas foram trituradas. Os extratos foram preparados mantendo-se a proporção de 150,0 mg de material vegetal moído/triturado para 6,00 mL de solvente extrator e o tempo de extração em 1h.
Para verificar se o tempo mínimo de maceração poderia ser reduzido sem comprometer a extração, foram preparados extratos com o material vegetal coletado em março de 2012, mantendo-se a proporção de 150,0 mg de material
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vegetal moído para 6,00 mL de solvente extrator. Foram avaliados os tempos de 0,0; 5,0; 10; 30 ou 60 min para maceração à temperatura ambiente.
A proporção de massa de material vegetal para volume de solvente extrator também foi avaliada em relação a possíveis alterações no perfil ativo com as folhas coletadas em março de 2012. Foram preparados extratos em triplicata nas condições 1:40 (150,0 mg / 6,00 mL); 1:20 (300,0 mg / 6,00 mL), 1:10 (600,0 mg / 6,00 mL). O tempo de maceração foi de 60 min.
O próximo parâmetro avaliado foi o número de extrações sequenciais necessárias. Com o material coletado em março de 2012, foram preparados 5 sistemas, em cada qual foram utilizados 150,0 mg de folhas secas moídas para 6,00 mL de solvente extrator. O tempo de maceração foi de 60 min.
Para o primeiro sistema, após a centrifugação, o sobrenadante foi seco sob pressão reduzida e ressuspendido na concentração de 5,00 mg.mL-1 na mesma composição do solvente extrator. Para o segundo, o sobrenadante foi reservado para secagem e um novo processo de extração foi realizado com o resíduo do material vegetal. O novo sobrenadante foi misturado ao primeiro, seco sob pressão reduzida e ressuspendido na concentração de 5,00 mg.mL-1 na mesma composição do solvente extrator. Para os sistemas 3, 4 e 5, o processo se extração foram repetidos por 2, 3 e 4 vezes respectivamente. Cada sobrenadante foi acumulado, seco sob pressão reduzida e ressolubilizado nas mesmas condições dos sistemas anteriores. Para cada sistema foram preparadas 3 replicatas.
Para finalizar os experimentos relacionados à manipulação do material vegetal e o preparo dos extratos, foi realizada uma comparação dos extratos obtidos pelo método de maceração à temperatura ambiente utilizado nesse trabalho com aqueles obtidos por métodos de referência estabelecidos pelas farmacopeias brasileira145,153 e americana190Erro! Indicador não definido. e pelo método mais utilizado na edicina popular para o tratamento dos sintomas do climatério (TABELA 3.12).
Em todas as extrações foram utilizadas as mesmas folhas secas e moídas, coletadas em março de 2012. A solução etanólica 30% (v/v) foi utilizada nos métodos de maceração e extração soxhlet. Na infusão foi utilizado somente água. A proporção de massa de folhas / volume de solvente também foi mantida em 1:40. Todos os extratos foram centrifugados e preparados para as análises conforme o procedimento geral descrito no início da seção.
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folhas secas moídas para 40,00 mL do solvente extrator, sendo em seguida agitado em vórtex por 30 s e submetido à turbólise por 1 min em rotação máxima. O tempo de maceração a frio foi de 60 min, seguidos de centrifugação por 20 min, a 18.500 xg, 4oC. Após a separação do sobrenadante, uma nova extração foi realizada nas mesmas condições com o resíduo do material vegetal. Os dois sobrenadantes foram combinados, filtrados e uma amostra (2,00 mL) foi seca sob pressão reduzida.
TABELA 3.12 - Procedimentos utilizados nos métodos de referência para extração
Método de folhas Massa Volume de solvente procedimento
Maceração
a frio 1,00 g 40,0 mL
Ao material seco e moído foi adicionado o solvente extrator; o tempo de maceração a frio foi 7 h com agitação frequente e 17 h sem agitação.
Maceração
a quente 2,50 g 100 mL
Ao material seco e moído foi adicionado o solvente extrator; O sistema foi agitado, ficando pela próxima 1 h em repouso; um condensador de refluxo foi acoplado ao frasco e manteve-se o sistema em fervura por 1 h. Após o resfriamento do sistema, reajustou-se o volume para o valor original (100 mL).
Soxhlet* 2,50 g 100 mL
O material seco e moído foi depositado em um cartucho feito de papel de filtro que foi colocado no extrator soxhlet; após 6 h de extração, o volume foi reajustado para o volume original e uma amostra desse material (1,00 mL) foi retirada para análise, a qual foi seca e ressolubilizada no solvente extrator na concentração de 5 mg.mL-1. A extração prosseguiu por outras 6 h. O volume final foi reajustado para o inicial novamente.
Infusão# 2,50 g 100 mL
A massa de folhas moídas pesadas foram transferidas para um cartucho ao qual foi adicionada a água após entrar em ebulição. O sistema ficou em infusão por 5 min.
* - recomendado apenas pela farmacopeia brasileira; # - medicina popular.