As análises dos aminoácidos e amino açucares, dos carboidratos e dos fenóis foram feitas durante estágio realizado no exterior. O estágio teve duração de 3 meses e foi feito no National Laboratory for Agriculture and the Environment da USDA (United States Department of Agriculture) sob a supervisão do pesquisador Dan Olk.
4.3.3.1 Aminoácidos
A extração e análise de aminoácidos e amino açúcares nas amostras de turfas TSA e TSI e nas amostras de substâncias húmicas TSA-SH e TSI-SH seguiram método proposto por Martens e Loeffelmann (2003) e modificado por Olk et al. (2008). Uma massa de 250,00 mg de cada amostra de turfa e 15,00 mg de cada amostra de SH foi transferida para tubos Falcon de 15 mL e adicionou-se em seguida 2 mL de ácido
metano sulfônico 4,0 mol L-1 contendo 0,2 % (m) de triptamina ([3-(2-
aminoethyl)indole]). Os tubos foram cuidadosamente agitados manualmente, cobertos com papel alumínio e autoclavados a 121 ºC por 16 horas. Após o período de autoclavagem, os tubos foram resfriados até temperatura ambiente e o pH
ajustado para a faixa de 4,0-6,0 com solução de NaOH 4,0 mol L-1 ou ácido metano
sulfônico 4,0 mol L-1 sem triptamina. Os tubos foram centrifugados a 2300 rpm por
10 minutos e filtrados utilizando filtros de seringa de 0,2 µm. As amostras foram congeladas até a análise.
As análises dos aminoácidos e amino açucares foram feitas utilizando um cromatógrafo de íons de alta eficiência (DIONEX, LC30, Thermo Scientific) equipado com coluna PA-10 AminoPac (DIONEX) e detector amperométrico tri-pulsado (DIONEX, ED40). Foram injetados 25 µL de cada amostra e solução padrão contendo 21 compostos entre aminoácidos e amino açucares (arginina, ornitina, lisina, alanina,
treonina, glicina, valina, hidroxiprolina, serina, prolina, isoleucina, leucina, metionina, histidina, fenilalanina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cistina e
tirosina). Utilizou-se como fase móvel soluções de NaOH 0,25 mol L-1, NaOAc 1,0 mol
L-1 e ácido acético 0,1 mol L-1 e fluxo de 0,25 mL min-1. O tempo de corrida foi de 42
minutos.
4.3.3.2 Carboidratos
Os monossacarídeos derivados da celulose e hemicelulose foram extraídos e analisados de acordo com Martens e Frankenberger (1990) e Martens e Loeffelmann (2002). Em tubos Falcon, transferiu-se 100,0 mg das amostras de turfas TSA e TSI e 10,0 mg das amostras de SH TSA-SH e TSI-SH e em seguida, adicionou-se 800 µL de
ácido sulfúrico 6,0 mol L-1. Os tubos foram agitados cuidadosamente e repousados
por 30 minutos em temperatura ambiente. As amostras foram diluídas com 4 mL de
água desionizada para uma concentração final de 1,0 mol L-1 de H
2SO4, cobertas com papel alumínio e levadas para autoclave por 30 minutos a 121 ºC. Após o resfriamento, as amostras foram centrifugadas a 2500 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi decantado em novos tubos Falcon e adicionou-se 1 mL de água desionizada aos resíduos precipitados e o procedimento de centrifugação foi novamente feito. Este processo de decantação, adição de água e centrifugação foi repetido por 3 vezes para garantir a limpeza do resíduo precipitado e que todos os carboidratos extraídos fossem retirados. As soluções sobrenadantes (carboidratos pouco extraídos por ácido: hemicelulose) foram ajustadas para pH 5,5-6,5 com NaOH
ou HCl 1,0 mol L-1. Procedeu-se à centrifugação novamente e, posteriormente, a
filtração com filtros de seringa de 0,2 µm. As amostras foram congeladas até a análise.
O resíduo precipitado foi seco em estufa a 60 ºC por 12 horas. Em seguida, este resíduo foi submetido à extração da celulose (carboidratos muito/fortemente
extraídos por ácido). Adicionou-se 300 µL de ácido sulfúrico 18,0 mol L-1 e
cuidadosamente os tubos foram agitados e mantidos por 30 minutos em temperatura ambiente. As amostras foram diluídas com 3,3 mL de água desionizada para uma
concentração final de 1,5 mol L-1 de H
2SO4 e levadas para autoclave por 30 minutos
a 121 ºC. Após o resfriamento, o pH das amostras foi ajustado para 5,5-6,5 com NaOH
filtradas com filtros de seringa de 0,2 µm. As amostras foram congeladas até a análise.
A análise dos carboidratos pouco extraídos por ácido foi feita utilizando um cromatógrafo de íons de alta eficiência (DIONEX, ICS-5000, Thermo Scientific) equipado com coluna PA-10 CarboPac (DIONEX) e detector amperométrico tri- pulsado (PAD). Foram injetados 25 µL de cada amostra e solução padrão contendo 6 carboidratos (fucose, ramnose, arabionse, glucose, manose e xilose). Utilizou-se
como fase móvel soluções de NaOH 15,0 mmol L-1, NaOAc 1,0 mol L-1 e NaOH 2,0 mol
L-1 e fluxo de 0,25 mL min-1. O tempo de corrida foi de 90 minutos.
A análise dos carboidratos muito/fortemente extraídos por ácido foi feita utilizando um cromatógrafo de íons de alta eficiência (DIONEX, ICS-5000, Thermo Scientific) equipado com coluna PA-10 CarboPac (DIONEX) e detector amperométrico tri-pulsado (PAD). Foram injetados 25 µL de cada amostra e solução padrão contendo
1 composto (glucose). Utilizou-se como fase móvel soluções de NaOH 60,0 mmol L-1
e NaOH 2,0 mol L-1 e fluxo de 0,25 mL min-1. O tempo de corrida foi de 60 minutos.
4.3.3.3 Fenóis
A concentração dos fenóis derivados de lignina foram determinados pelo método de oxidação alcalina de CuO modificado por Hedges e Mann (1979). Este método é feito 5 dias, em que cada dia é feita uma etapa diferente. A primeira etapa do método foi garantir a limpeza dos materiais que foram utilizados ao longo do método. Para isso, as bombas de pressão, tampas, o-rings (anéis de vedação) e as pequenas bolas de agitação foram colocadas em um béquer de teflon com 500 mL de
NaOH metanóico 2,0 mol L-1 por 30 minutos em chapa aquecedora a 100 ºC e cobertos
com papel alumínio. Estes materiais foram fabricados especialmente para este método sob medidas específicas e com materiais adequados. Na Figura 9, algumas fotos das bombas de pressão, tampas e bolas de agitação estão apresentadas, bem como o béquer de teflon coberto com papel alumínio. Em seguida, todos estes itens foram lavados exaustivamente com metanol em um frasco de aço inox até nenhum resíduo de NaOH ser observado e posteriormente secos em forno por 30 minutos a 100 ºC dentro de papel alumínio. Todas as demais vidrarias usadas foram envolvidas em papel alumínio e levadas em forno mufla por 4 horas (ou overnight) a 500 ºC e mantidas em local fechado até o uso. Uma massa de 10,0 mg das amostras de turfas
TSA e TSI e das amostras de SH TSA-SH e TSI-SH foram transferidas para as bombas de pressão, às quais em seguida foi adicionado 330 ± 1 mg de CuO. Foram adicionadas às bombas as bolas de agitação e em seguida as bombas foram seladas com as tampas, colocadas em um suporte tipo carrossel e mantidas sob atmosfera de argônio por 12 horas dentro de um saco já previamente preenchido e saturado com argônio. No segundo dia do procedimento, as bombas foram abertas e adicionou-se 4,0 mL de
NaOH 2,0 mol L-1 e esperou-se a mistura por mais 45 minutos dentro do saco com
argônio. As bombas foram fechadas e agitadas de maneira que as bolas de agitação ficassem soltadas dentro das bombas. Em seguida, as bombas de pressão foram mantidas em um forno sob rotação. Este forno utilizado é um forno de cromatógrafo gasoso adaptado com uma base giratória fixada dentro da porta onde as bombas de
pressão são fixadas. Foi utilizada uma rampa de aquecimento começando em 27 oC
com uma taxa de 4,2 oC por minutos por 30 minutos e as bombas mantidas a 150 oC
por 3 horas. Após o resfriamento das amostras, as bombas foram abertas e o padrão
interno etil-vanilina (EV) foi adicionado (100 µL de EV 240 ng µL-1) e misturado. As
bombas foram centrifugadas a 3500 rpm por 5 minutos e posteriormente, os sobrenadantes foram decantados em tubos identificados. Em seguida, foi adicionado
às bombas 4 mL de NaOH 1,0 mol L-1. As bombas foram fechadas novamente e
agitadas. Uma nova centrifugação foi feita a 3500 rpm por 5 minutos e o sobrenadante decantado nos tubos já identificados e com o primeiro sobrenadante. Esta etapa de limpeza das bombas foi feita por mais duas vezes. Em seguida, foi
adicionado 3 mL de HCl 6,0 mol L-1 em cada tubos contendo os sobrenadantes para
neutralizar o pH. Foi adicionado aos tubos 2,5 g de NaCl e a mistura foi agitada. Posteriormente, adicionou-se 3 mL de éter em cada tubo e agitou-se os tubos por 2 minutos. Os tubos foram abertos para saída dos gases e em seguida, centrifugadas a 2000 rpm por 2 minutos. Duas fases foram formadas nos tubos e o sobrenadante foi então transferido para novos tubos com nova identificação. Repetiu-se a adição de éter, mistura, saída de gases, centrifugação e transferência do sobrenadante por mais duas vezes. Ao final, os tubos continham uma total de 9 mL de éter. Este procedimento é feito para a extração dos fenóis das amostras. Foi adicionado aos
tubos 2,5 g de Na2SO4. Os tubos foram fechado e mantidos no refrigerador até o dia
seguinte do procedimento. No terceiro dia, foi feita a filtração e concentração das amostras e também a derivatização das amostra e dos padrões. Os tubos contendo
as amostras e os sais de Na2SO4 foram retirados da geladeira e mantidos até temperatura ambiente. Em seguida, o líquido (amostras) foi filtrado utilizando pipetas de pasteur preenchidas com lã de vidro e já previamente calcinadas na mufla no primeiro dia. Um volume de 3 mL de éter foi adicionado os tubos e estes agitados. O líquido foi novamente filtrado nas mesmas pipetas de pasteur. Esse procedimento foi feito mais duas vezes para garantir que toda a amostra foi filtrada e corretamente transferida. Os filtrados foram coletados em frascos de vidro adaptados para serem encaixados no rotaevaporador. As amostras foram então concentradas em rotaevaporador até volume final de aproximadamente 1 mL, tomando-se o cuidado para a amostra não borbulhar/ebulir. As amostras concentradas foram transferidas para vials. Os frascos de vidro foram enxaguados com 1,5 mL de éter por duas vezes e os líquidos transferidos para as respectivos vials. Os vials contendo aproximadamente 4 mL foram colocados em “dry block” em temperatura ambiente e fluxo de argônio de 300-350 mL por minuto. Um fluxo não tão forte para espirrar a amostra, somente para mover a superfície. O fluxo foi mantido até a formação de uma fina camada de solução, evitando a secagem total. A derivatização da amostra foi feita com 50 µL de BSTFA (N-O-Bis(trimetilsilil)trifluoracetamida). Os vials foram
aquecidos em bloco aquecedor a 70 oC pro 30-40 minutos. Após resfriamento até
temperatura ambiente, as amostras foram analisadas conforme descrito na sequência.
A análise dos fenóis derivados de lignina foi feita utilizando um cromatógrafo a gás (HP 6890, Hewlett Packard) equipado com coluna HP-5 5% Phenil Methil Siloxane de capilaridade 30,0 m x 320 µm x 0,25 µm (HP) e detector de ionização em chama (FID). Foram injetados 1 µL de cada amostra e solução padrão contendo 11 compostos (p-hidroxibenzaldeído, p-hidroxiacetofenona, vanilina, acetovanilona, ácido p-hidroxibenzóico, siringaldeído, ácido vanílico, acetosiringona, ácido siríngico, ácido p-hidroxicoumárico e ácido ferúlico). A temperatura do injetor, operado na condição sem divisão de fluxo (splitless), foi de 100 ºC. Durante as
análises utilizou-se a seguinte rampa de aquecimento 4 ºC min-1 até 220 ºC e 25 ºC
min-1 até 270 ºC, com duração de corrida de 42 minutos. Hélio ultrapuro foi utilizado
como gás de arraste, com fluxo constante de 1,0 mL min-1. Foi empregado um
Figura 9. Bombas de pressão, tampa, o-rings e bolas de agitação em banho aquecido de
NaOH/metanol e em estufa de secagem.