3.2.1 Desenvolvimento de método analítico por cromatografia líquida para a determinação de CL, GB, GM e GZ em coluna CV
A seleção da fase móvel e diluente do método analítico para a determinação de CL, GB, GM e GZ foi realizada com base nos métodos para quantificação de sulfoniluréias descritos na literatura e nas características físico químicas dos fármacos. O objetivo era que o diluente selecionado tivesse composição similar à fase móvel, de maneira a evitar o alargamento dos picos cromatográficos.
Após seleção preliminar da fase móvel e do diluente foi realizada uma corrida exploratória de varredura na região do ultravioleta (200-400 nm) de uma solução contendo 250 μg/ml de cada um dos antidiabéticos, utilizando as condições analíticas preliminares descritas na Tabela 1.2. Para obtenção dessa solução partiu- se de soluções estoques de cada um dos antidiabéticos, a 1 mg/ml, preparadas em ACN:água (4:1) e submetidas a banho de ultra som por 5 minutos. Posteriormente realizaram-se diluições dessas soluções estoques de modo a obter uma solução de trabalho com os quatro antidiabéticos na concentração de 250 μg/ml. O volume da solução de trabalho foi completado com ACN:solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0 (50:50). O objetivo dessa corrida exploratória de varredura foi determinar o comprimento de onda de análise ideal, ou seja, aquele capaz de detectar seletivamente os quatro antidiabéticos e propiciar a maior absorção possível.
Tabela 1.2 - Condições analíticas preliminares*
* Foram utilizados loop de 10 μl, tubo de poli éter cetona (poly ether-ether-ketone - PEEK) de 0,004 polegada e frequência de aquisição dos dados/constante de tempo do detector iguais a 20 Hz/0,1 s.
3.2.2 Otimização de método analítico por cromatografia líquida para a determinação de CL, GB, GM e GZ em coluna CV
Após seleção das condições cromatográficas preliminares e do comprimento de onda da análise, algumas condições cromatográficas foram otimizadas. Inicialmente foram testadas três fases móveis com diferentes proporções de ACN e solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0. Utilizando a fase móvel selecionada, foram testadas três concentrações de trabalho. Em seguida, utilizando a fase móvel e a concentração de trabalho selecionadas, testaram-se três volumes de injeção. Por último, fazendo-se uso da fase móvel, concentração de trabalho e volume de injeção selecionados, três temperaturas foram avaliadas. O esquema de otimização está sumarizado na Tabela 1.3.
Em cada condição teste apresentada na Tabela 1.3, dez diferentes vazões de fase móvel, variando de 0,02 a 0,6 ml/min, foram experimentadas. Determinaram-se o número de pratos teóricos e o tempo de retenção dos picos referentes aos quatro fármacos, em cada vazão avaliada, em cada condição teste. Outro parâmetro determinado em cada vazão avaliada e em cada condição teste foi o tempo morto da coluna. Para estimativa do tempo morto, injetaram-se 2 μl de uracila (10 μg/ml).
Parâmetros Condições
Fase móvel ACN:Solução de acetato de amônio 5mM pH 3,0 (50:50)
Vazão da fase móvel 0,2 ml/min
Volume de injeção 2 μl
Coluna C18 100 x 2,1 mm, 5 μm
Temperatura da coluna 30 oC
Solução de CL, GB, GM e GZ 250 μg/ml em fase móvel
Tabela 1.3 - Otimização das condições cromatográficas em coluna convencional
Experimento 1 Experimento 2 Experimento 3 Experimento 4
Fase Móvel Concentração Volume de injeção Temperatura
ACN:Solução (55:45)* 250 μg/ml 5 μl 30 oC ACN :Solução (50:50)* 100 μg/ml 2 μl 35 oC ACN:Solução(45:55)* 20 μg/ml 1 μl 40 oC Condições cromatográficas Conc. = 250 μg/ml Vinj = 2 μl T = 30 oC = 230 nm V = 0,02 a 0,6 ml/min Condições cromatográficas FM = Escolhida no experimento 1 Vinj = 2 μl T = 30 oC = 230 nm V = 0,02 a 0,6 ml/min Condições cromatográficas FM = Escolhida no experimento 1 Conc . = Escolhida no experimento 2 T = 30 oC = 230 nm V = 0,02 a 0,6 ml/min Condições cromatográficas FM = Escolhida no experimento 1 Conc. = Escolhida no experimento 2 Vinj = Escolhido no experimento 3 = 230 nm V = 0,02 a 0,6 ml/min *Solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0
A partir dos dados de número de pratos teóricos, tempo de retenção e tempo morto, foi construída uma curva de Van Deemter para cada antidiabético em cada condição testada. Para os cálculos foram utilizadas as equações (1.1), (1.2) e (1.3).
A seleção da fase móvel, concentração, volume de injeção e temperatura ideais foram realizadas com base na análise das curvas de Van Deemter e também com base na análise dos parâmetros fator de retenção (k), resolução (Rs), fator de assimetria dos picos (As) e pressão do sistema cromatográfico (P).
3.2.3 Transferência do método desenvolvido em coluna CV para as colunas MN, NF e Sub 2 μm
O método desenvolvido e otimizado para análise de antidiabéticos orais em coluna convencional foi aplicado às colunas cromatográficas empacotadas com partículas sub 2 μm, com partículas de núcleo fundido e coluna monolítica. Todos os parâmetros cromatográficos estabelecidos no método desenvolvido e otimizado na coluna convencional foram mantidos, exceto a proporção de acetonitrila e solução de acetato de amônio na fase móvel. A constituição da fase móvel foi ajustada para
cada coluna cromatográfica em estudo, de forma que os fatores de retenção de todos os antidiabéticos fossem próximos aos verificados na coluna convencional. O cálculo de k foi realizado utilizando-se a equação (1.3).
Para ajustar o percentual de acetonitrila e solução de acetato de amônio realizou-se uma corrida, em cada coluna, aplicando-se o método desenvolvido e otimizado na coluna convencional. Naquelas colunas em que a retenção foi superior à observada na coluna convencional, aumentou-se o percentual de acetonitrila progressivamente até que valores de k próximos aos objetivados fossem alcançados. Já nas colunas nas quais a retenção foi inferior à observada na coluna convencional, reduziu-se o percentual de acetonitrila até que valores de k próximos aos de interesse fossem atingidos.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Desenvolvimento de método analítico por cromatografia líquida para a