Verificou-se que nos métodos descritos na literatura para determinação simultânea de sulfoniluréias foram utilizadas fases móveis compostas por uma mistura de solvente orgânico e tampão com pH em torno de 3,0. Por isso tentou-se, inicialmente, a utilização de solução de acetato de amônio pH 3,0 e acetonitrila, na proporção de 50:50. Com base no pKa dos fármacos (CL - pKa 4,71 e -1,57; GB - pKa 5,11 e -1,63; GM - pKa 5,10 e -1,48; GZ - pKa 6,07 e 3,89), espera-se que em pH 3,0 aproximadamente 98% das moléculas de clorpropamida e 100% das moléculas de glibenclamida e glimepirida estariam na forma não ionizada e que 90% das moléculas de gliclazida estariam na forma ionizada. A seleção de um valor de pH que propicie que a totalidade ou a quase totalidade das moléculas de determinado analito estejam em sua forma ionizada ou não ionizada é importante para evitar o alargamento dos picos [24].
Tentou-se inicialmente, sem sucesso, dissolver os insumos dos antidiabéticos em acetonitrila. Posteriormente tentou-se a mistura ACN:água (4:1), sugerida como diluente do padrão de glimepirida pelas farmacopeias européia 7ª edição e
americana 34a edição. A mistura ACN:água (4:1) foi capaz de solubilizar todos os
quatro antidiabéticos orais, após banho de ultra som de 5 minutos, produzindo soluções estoque de 1 mg/ml de cada um deles.
Os espectros de varredura dos antidiabéticos utilizando as condições analíticas descritas na Tabela 1.2 estão apresentados na Figura 1.5.
Figura 1.5 - Espectros de varredura dos antidiabéticos
A partir da análise dos espectros foi selecionado 230 nm como o comprimento de onda ideal, capaz de propiciar absortividades próximas às máximas de todos os quatro fármacos.
4.2 Otimização de método analítico por cromatografia líquida para a determinação de CL, GB, GM e GZ em coluna CV
Quatro parâmetros do método analítico desenvolvido em coluna convencional foram otimizados: fase móvel, concentração de trabalho, volume de injeção e temperatura.
4.2.1 Fase móvel
O primeiro parâmetro otimizado foi a proporção de ACN e da solução de acetato de amônio na fase móvel. As curvas de Van Deemter referentes aos quatro antidiabéticos (Figuras 1.6, 1.7, 1.8 e 1.9), em cada uma das três fases móveis testadas, são mostradas a seguir.
Figura 1.6 - Curvas de Van Deemter da CL em diferentes fases móveis
Figura 1.7 - Curvas de Van Deemter da GZ em diferentes fases móveis
Figura 1.8 - Curvas de Van Deemter da GB em diferentes fases móveis 8 12 16 20 24 28 32 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 H ( µ m ) u0 (mm/s) 45% ACN 50% ACN 55% ACN 8 12 16 20 24 28 32 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 H ( µ m ) u0 (mm/s) 45% ACN 50% ACN 55% ACN 8 12 16 20 24 28 32 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 H ( µ m ) u0 (mm/s) 45% ACN 50% ACN 55% ACN
Figura 1.9 - Curvas de Van Deemter da GM em diferentes fases móveis
Percebe-se que em todos os gráficos as curvas estão praticamente sobrepostas, indicando que em termos de eficiência cromatográfica, não há grande diferença entre as fases móveis testadas. Para exemplificar, considere-se a Figura 1.7, referente às curvas de Van Deemter da gliclazida. A eficiência máxima alcançada com as três fases móveis ocorreu em velocidade linear próxima a 0,6 mm/s, com uma altura de prato teórico H em torno de 11 μm.
Outro parâmetro cromatográfico avaliado para as três fases móveis foi o fator de retenção dos quatro analitos. Os resultados estão apresentados na Figura 1.10.
Figura 1.10 - Relação entrepercentual de ACN na fase móvel e k dos antidiabéticos
Percebe-se que quanto maior o percentual de acetonitrila menor é a retenção dos fármacos, já que em cromatografia de fase reversa a maior proporção de solvente
8 12 16 20 24 28 32 0 1 2 3 4 5 H (μ m) u0 (mm/s) 45% ACN 50% ACN 55% ACN 0 2 4 6 8 10 40 45 50 55 60 K % ACN GM GB GZ CL
orgânico contribui para o aumento da força eluotrópica da fase móvel. Além disso, quanto menor a força eluotrópica da fase móvel, maior é a diferença entre os valores de k dos analitos, o que permite uma separação mais eficiente. Conclui-se também que os analitos menos retidos, como a clorpropamida, têm o valor de k menos influenciado por variações na força da fase móvel do que os analitos mais retidos, como a glimepirida. Considerando que idealmente o fator de retenção deve estar entre 1 e 10 [24], a fase móvel composta por 55% de acetonitrila não seria adequada, já que a clorpropamida apresentou k = 0,95 nessa condição.
De acordo com a teoria cromatográfica, o aumento do fator de retenção vem acompanhado da redução do Hmin, ou seja, aumento da eficiência [24]. Sendo assim, seria esperado que a fase móvel constituída por ACN:solução de acetato de amônio 5mM pH 3,0 (45:55) propiciasse análises mais eficientes, com menor Hmin. Entretanto, nenhuma diferença significativa foi observada entre a eficiência gerada pelas três fases móveis. Uma hipótese para explicar esse comportamento é que a fase móvel constituída por ACN:solução de acetato de amônio 5mM pH 3,0 (45:55) é mais viscosa (η ACN:solução de acetato de amônio (45:55): 0,78 cp e η ACN:solução de acetato de amônio (55:45): 0,69 cp - valores calculados com base na η da água e da ACN). Sabe-se que
o aumento de viscosidade contribui para a redução da eficiência cromatográfica [24]. Sendo assim, com a redução do percentual de solvente acetonitrila tem-se o aumento de k dos analitos, que é favorável à melhora da eficiência, mas ao mesmo tempo há um aumento da viscosidade da fase móvel, que é desfavorável.
A resolução entre os picos também foi avaliada. Para exemplificar plotou-se na Figura 1.11 a resolução (Rs) entre o par de picos adjacentes mais próximos (glimepirida e glibenclamida), em função da vazão, para cada fase móvel.
Figura 1.11 - Relação entre vazão e Rs (GM/GB) nas diferentes fases móveis 0 1 2 3 4 5 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 Rs GM /GB Vazão (ml/min) 45% ACN 50% ACN 55% ACN
Com qualquer uma das fases móveis, em qualquer vazão testada, a resolução entre o par de picos refrentes a glimepirida e glibenclamida está adequada, pois foi superior a 2,0 [25].Analisando-se a Figura 1.11 percebe-se que em qualquer vazão, quanto maior a força eluotrópica da fase móvel, menor é a resolução. Isso é justificado, pois o aumento da força da fase móvel promove redução da seletividade (α) e redução de k, parâmetros que afetam diretamente a resolução (equação 1.4). É
interessante destacar que o formato da curva de resolução x vazão é similar ao formato da curva de Van Deemter invertida, já que a resolução é proporcional a N .
k
k
N
R
s1
)
1
(
4
/
1
(1.4)Rs = Resolução, α = seletividade, N = número de pratos teóricos e k = fator de retenção
Por último, avaliou-se a pressão do sistema (Figura 1.12) e o fator de assimetria (As) dos picos (Tabela 1.4) nas diferentes fases móveis.
Figura 1.12 - Relação entrevazão e pressão do sistema nas diferentes fases móveis 0 20 40 60 80 100 120 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 P re ss ão (bar ) Vazão (ml/min) 45% ACN 50% ACN 55% ACN
Tabela 1.4 - Fatores de assimetria dos picos dos antidiabéticos nas diferentes fases móveis
Antidiabético Fator de assimetria médio*
ACN:Solução (45:55)** ACN:Solução (50:50)** ACN:Solução (55:45)**
Clorpropamida 1,21 1,24 1,26
Gliclazida 1,08 1,12 1,16
Glibenclamida 1,03 1,05 1,08
Glimepirida 1,05 1,05 1,07
* Média dos fatores de assimetria nas 10 vazões analisadas ** Solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0
Como esperado, quanto maior o percentual de solvente orgânico na fase móvel, menor é a pressão gerada no sistema, o que é consequência da redução da viscosidade da fase móvel [24]. Entretanto, na prática, em todas as vazões testadas a diferença entre os valores de pressão verificados em função da fase móvel não foi significativa. O mesmo pode-se dizer em relação à simetria dos picos: apesar das pequenas diferenças, na prática, empregando-se qualquer uma das fases móveis, picos com fatores de assimetria dentro da faixa ideal de 0,8-1,8 foram obtidos [26].
Vale destacar que apesar de não haver diferença significativa na assimetria dos picos em função do percentual de ACN na fase móvel, observa-se que os fatores de assimetria se aproximam do valor ideal (As = 1) com a redução do percentual de ACN e consequente aumento de k dos analitos (conforme Figura 1.10). Esse comportamento (melhora da simetria do pico com aumento de k) ocorre quando são os efeitos extracoluna os principais responsáveis pela piora da simetria dos picos [24].
Considerando os resultados e as discussões, a fase móvel constituída por 55% de acetonitrila não foi selecionada, já que com essa fase móvel o k da clorpropamida foi inferior a 1 (k = 0,95). Os outros parâmetros avaliados (eficiência, resolução, pressão e assimetria) não justificam a escolha da fase móvel constituídas por 50% ou 45% de acetonitrila. Sendo assim, optou-se pela fase móvel selecionada preliminarmente, constituída por 50% de acetonitrila e 50% de solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0, objetivando-se a obtenção de uma análise mais rápida.
4.2.2 Concentração
Após seleção da fase móvel otimizou-se a concentração de trabalho dos antidiabéticos. As concentrações de 20, 100 e 250 μg/ml foram testadas. Os resultados obtidos com soluções de concentração igual a 20 μg/ml não foram reprodutíveis, provavelmente em consequência da baixa relação sinal ruído, e não foram considerados.
Para exemplificar, as curvas de Van Deemter obtidas para a glimepirida, nas concentrações de 100 e 250 μg/ml, estão apresentadas na Figura 1.13.
Figura 1.13 - Curvas de Van Deemter da GM nas concentrações de 100 e 250 μg/ml
Verifica-se que as duas curvas se sobrepõem, indicando que em termos de eficiência cromatográfica as concentrações testadas se equivalem. O mesmo comportamento foi observado para os outros três antidiabéticos.
A assimetria e resolução entre os picos também foram avaliadas. Os fatores de assimetria nas duas concentrações (100 e 250 µg/ml) foram próximos (Tabela 1.5) e dentro da faixa ideal (0,8-1,8) [26]. Os valores de resolução entre os picos foram todos superiores a 2,0, valor mínimo aceitável [25] e praticamente não houve diferença entre os valores de resolução obtidos nas duas concentrações experimentadas. Para exemplificar: a resolução média nas 10 vazões experimentadas entre o par de picos adjacentes mais próximos (glibenclamida e glimepirida) foi igual a 3,47 para a concentração de 250 µg/ml e igual a 3,51 para a concentração de 100 µg/ml. 8 12 16 20 24 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 H (μ m) u0 (mm/s) 250 μg/ml 100 μg/ml
Tabela 1.5 - Fatores de assimetria dos picos dos antidiabéticos nas concentrações de 100 e 250 μg/ml
Antidiabético Fator de assimetria médio* 250 μg/ml 100 μg/ml
Clorpropamida 1,24 1,23
Glibenclamida 1,05 1,07
Glimepirida 1,05 1,05
Gliclazida 1,12 1,12
* Média da dos fatores de assimetria nas 10 vazões experimentadas
Como não houve diferença em termos de eficiência, resolução e fator de assimetria entre as concentrações de 100 e 250 μg/ml, optou-se pela seleção da concentração de 100 μg/ml, objetivando a simplificação dos cálculos durante a validação dos métodos analíticos no capítulo 5 desse trabalho.
4.2.3 Volume de injeção
Após seleção da fase móvel e concentração ideais, avaliaram-se os seguintes volumes de injeção: 1, 2 e 5 μl. Com a finalidade de evitar a dispersão da amostra e consequente redução da eficiência cromatográfica, o volume de injeção deve ser reduzido, embora volumes de injeção muito pequenos possam conduzir a uma baixa detectabilidade do método [24,27]. Faz-se necessário, portanto, otimizar o volume de injeção objetivando eficiência cromatográfica e detectabilidade satisfatórias.
A seguir encontram-se apresentadas as curvas de Van Deemter da clorpropamida (Figura 1.14) e glimepirida (Figura 1.15), nos três volumes de injeção testados.
Os resultados da clorpropamida e glimepirida foram selecionados como exemplos porque eles representam os analitos de menor (k = 1,3) e maior retenção (k = 5,2), respectivamente.
Figura 1.14 - Curvas de Van Deemter da CL nos diferentes volumes de injeção
Figura 1.15 - Curvas de Van Deemter da GM nos diferentes volumes de injeção
Analisando-se os gráficos apresentados nas Figuras 1.14 e 1.15 percebe-se que para a glimepirida, independente do volume de injeção, o valor de Hmin está em torno de 10 μm. Já para a clorpropamida a eficiência varia em função do volume de injeção. Quando 5 μl foram injetados o valor mínimo de H obtido ficou em torno de 21 μm. Já com as injeções de 1 e 2 μl a eficiência foi superior, e valores de Hmin menores, em torno de 17 μm, foram obtidos.
Esse comportamento pode ser explicado porque o volume de injeção máximo que não contribue excessivamente para o alargamento depende do fator de retenção dos compostos de interesse. Em geral, podem ser injetados volumes maiores de analitos mais retidos sem que ocorra alargamento excessivo do pico [27]. Esse fato pode ser comprovado pela equação 1.5 [28].
10 15 20 25 30 35 40 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 H ( µ m ) u0 (mm/s) 1 2 5 10 15 20 25 30 35 40 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 H (μ m) u0 (mm/s) 1 2 5
N
K
V
V
inj
r
(1.5)Vinj = volume de injeção, = fração do alargamento do pico, Vr = volume de retenção, K = constante característica da qualidade da injeção normalmente igual a 2, N = número de pratos teóricos
Analisando-se a equação 1.5 verifica-se que considerando um mesmo volume de injeção, analitos mais retidos (maior Vr e, portanto, maior fator de retenção k) sofrerão menor alargamento (menor ).
Sendo assim, como a glimepirida possui maior fator de retenção (k = 5,2), o pico relativo a ela sofreu menor alargamento quando o volume de injeção de 5 μl foi injetado, tendo apresentado eficiência semelhante às verificadas quando volumes de 1 e 2 μl foram utilizados. Já o pico da clorpropamida (k = 1,3) sofreu maior alargamento quando 5 μl foram injetados, o que explica o fato de a eficiência cromatográfica com esse volume de injeção ter sido inferior a eficiência observada quando 1 e 2 μl foram injetados. O comportamento da gliclazida (k = 2,7) e da glibenclamida (k = 4,2) foi similar ao da clorpropamida, ou seja, houve redução da eficiência (aumento de Hmin) quando 5 μl foram injetados.
Considerando o exposto, os volumes de injeção de 1 e 2 μl poderiam ser utilizados, já que garantem uma maior eficiência cromatográfica dos quatro antidiabéticos quando comparados ao volume de injeção de 5 μl. Analisando-se os parâmetros assimetria e resolução entre os picos, percebe-se que os volumes de 1 e 2 μl se mostraram novamente equivalentes: valores de fator de assimetria e resolução similares e satisfatórios (0,8<As<1,8 e Rs>2,0) [25, 26] foram obtidos. Para exemplificar: a resolução média nas 10 vazões experimentadas, entre o par de picos mais crítico (glibenclamida e glimepirida), foi igual a 3,49 para o volume de injeção de 1 μl e igual a 3,51 para o volume de injeção de 2 μl; o fator de assimetria médio do pico de glibenclamida nas 10 vazões testadas foi igual a 1,09 para o volume de injeção de 1 μl e igual a 1,07 para o volume de injeção de 2 μl.
Deve-se destacar que com os volumes de injeção de 1 e 2 μl picos com relações sinal/ruído superiores a 10, adequadas à quantificação [29], foram gerados. Ao final, arbitrariamente, optou-se pela seleção do volume de injeção de 2 μl.
4.2.4 Temperatura
Por último, foi realizada avaliação da temperatura de análise. Foram avaliadas temperaturas de 30, 35 e 40 oC. Nenhuma diferença significativa em termos de
eficiência, fator de retenção, resolução, fator de assimetria e pressão foram observadas. Possivelmente esse comportamento é consequência da pequena variação de temperatura testada. Optou-se por manter a temperatura de 30 oC estabelecida preliminarmente, visando aumentar o tempo de vida útil das colunas.
Concluindo, as condições analíticas selecionadas para determinação de antidiabéticos em coluna convencional foram: fase móvel constituída por ACN: solução de acetato de amônio 5 mM pH 3,0 (50:50), concentração de trabalho de 100 μg/ml, volume de injeção de 2 μl e temperatura de 30 oC. Nessas condições os
fatores de retenção dos antidiabéticos foram aproximadamente iguais a: clorpropamida k = 1,3; gliclazida k = 2,7; glibenclamida k = 4,2 e glimepirida k = 5,2. Na Figura 1.16 há um cromatograma referente à análise dos antidiabéticos em coluna convencional aplicando-se as condições acima e vazão de 0,4 ml/min.
Figura 1.16 - Cromatograma obtido durante análise de antidiabéticos em coluna convencional
4.3 Transferência do método desenvolvido e otimizado em coluna CV para as