As fases estacionárias monolíticas surgiram no final da década de 80 e início da década de 90. A popularização dessas fases, entretanto, só aconteceu a partir do ano 2000, quando monolitos de sílica se tornaram disponíveis comercialmente. Ao longo dos últimos cinco anos os monolitos, que podem ser feitos de material orgânico sintético (ex: resina acrílica), natural (ex: celulose) ou material inorgânico (ex: sílica), foram amplamente difundidos [1, 2].
A fase monolítica de sílica é preparada no formato de um cilindro, pelo processo “sol-gel”. Esse preparo não ocorre dentro das colunas cromatográficas convencionais de aço inoxidável, pois após a etapa de secagem o cilindro monolítico encolhe e perde o contato com a parede interna da coluna cromatográfica. Sendo assim, materiais especiais, como o PEEK, devem ser utilizado, pois se ajustam mais facilmente ao diâmetro do monolito de sílica [1].
Em um procedimento típico de preparo de monolitos de sílica pelo processo “sol- gel”, tetrametoxissilano ou tetraetoxissilano é adicionado a uma solução aquosa de poli(oxietileno) (agente porogênico) contendo ácido ou base (catalisador). A mistura é agitada a 0 oC e a solução resultante é colocada dentro de um molde de policarbonato para que ocorram as reações de hidrólise e policondensação. A primeira etapa é a formação de um “sol”, suspensão coloidal de espécies sólidas em um líquido. Em seguida, a suspensão é convertida em gel, por meio de um processo de policondensação. A amostra na forma de gel é então envelhecida por alguns dias. O cilindro de sílica úmido formado é colocado em uma solução aquosa para formar as estruturas mesoporosas. Sucessivas evaporações, secagens e
tratamentos térmicos são realizados para decompor os constituintes orgânicos e estabilizar a superfície do gel hidrofílico de sílica. Após as etapas de envelhecimento e secagem, o monolito de sílica encolhe dentro do molde. O cilindro monolítico é retirado do molde e encaixado em um tubo de PEEK, e por meio de aquecimento e aplicação de pressão externa o tubo de PEEK se ajusta ao monolito, assegurando a inexistência de espaços vazios. O monolito é posteriormente funcionalizado com o reagente de interesse [3].
A fase monolítica é um meio contínuo de separação, contendo uma "partícula única". Possui uma estrutura sólida e altamente porosa, de pequenos domínios, que fornece elevada eficiência cromatográfica (Figura 2.1) [1].
Figura 2.1 - Micrografia da fase monolítica de sílica [4]
Os domínios do monolito podem ser micro, macro ou mesoporosos. Segundo a IUPAC, os microporos são poros com diâmetros que não excedem 2 nm (20 Å), os mesoporos são poros de tamanhos intermediários entre 2 e 50 nm e os macroporos são definidos como poros com diâmetros superiores a 50 nm (500 Å). Nas colunas monolíticas de sílica de primeira geração os macroporos, em inglês chamados de
through-pore, são de 2 µm. É principalmente através deles que a fase móvel passa
durante o processo de eluição cromatográfica. Já os mesoporos, chamados em inglês de skeleton-pore, possuem poros de aproximadamente 13 nm nos monolitos de primeira geração. São os mesoporos que geram a área superficial, normalmente entre 50 a 300 m2/g, necessária à separação cromatográfica [1,5]. Na figura 2.2 há um esquema de uma coluna monolítica e os respectivos macroporos e mesoporos.
Figura 2.2 - Macroporos de 2 μm (a) e mesoporos de 13 nm (b) da fase monolítica [4]
Característica física importante das colunas monolíticas é a elevada porosidade (ε),
situada em torno de 80% [5]. A alta porosidade justifica os elevados valores de permeabilidade (Kv0) característicos desse tipo de coluna. Valores de permeabilidade iguais a 5,00 x 10-14 e 8,00 x 10-14 m2 foram descritos na literatura para a coluna
monolítica da marca Onyx® [6, 7]. Verifica-se que, em consequência da elevada
porosidade e da baixa densidade características das colunas monolíticas, o fator de retenção (k) dos analitos nesse tipo de coluna é inferior ao observada nas colunas com partículas porosas convencionais de diâmetro entre 3 e 5 µm. Observa-se também que colunas monolíticas e convencionais que possuem o mesmo grupo químico ligante apresentam valores de seletividade (α) próximos, indicando que os
mecanismos que governam a separação em ambas são similares [8].
Como já foi relatado, a geometria dos canais dos monolitos apresentam estrutura altamente permeável e, portanto, de menor resistência à vazão da fase móvel do que a gerada pelas partículas porosas presentes nas colunas cromatográficas convencionais. Sendo assim, é possível realizar análises rápidas, em vazões elevadas (> 5 ml/min), utilizando instrumentos convencionais de cromatografia líquida (HPLC), sem que haja aumento da pressão para valores acima do máximo suportado por eles (400 bar) [1, 2].
Embora as colunas monolíticas apresentem as vantagens mencionadas, menos de 1% dos profissionais que trabalham com cromatografia as utilizam. Os motivos são o pequeno número de fornecedores (apenas Merck e Phenomenex) e de grupos químicos ligantes (sílica, C8, C18), inexistência de colunas com comprimento superior a 100 mm (por limitações durante o processo produtivo), estabilidade
química limitada a uma estreita faixa de pH (2-8) e elevado consumo de solvente [9, 10]. Além disso, a limitação do número de fornecedores faz com que o custo das colunas monolíticas seja elevado. Em cotação realizada no primeiro semetre de 2011, a coluna monolítica da marca Phenomenex (Onyx® C18 100 x 2,0 mm) foi
cotada em R$ 1700,00, enqunato que a coluna convencional da marca ACE (C18 100 x 2,1 mm) foi cotada em R$ 960,00.
Outro ponto negativo é que as fases monolíticas dão origem a picos de pior simetria [11]. Além disso, a eficiência cromatográfica das colunas monolíticas, apesar de ser comparável à apresentada por colunas convencionais com partículas porosas de diâmetro entre 3,5 e 5,0 μm, é inferior à alcançada por colunas empacotadas com partículas de núcleo fundido e partículas porosas sub 2 μm [1,10,12].
Com o objetivo de melhorar o desempenho das colunas monolíticas, a empresa Merck introduziu no mercado, no fim de 2011, a fase monolítica de sílica de segunda geração. Essa nova fase é chamada de Chromolithic High Resolution® e possui duas vantagens em relação à fase de primeira geração: gera uma maior eficiência cromatográfica (H fase monolítica 2a geração < 7 μm; H fase monolítica 1a geração < 12,5 μm) e
propicia a obtenção de picos mais simétricos. Essas características foram alcançadas mediante o desenvolvimento de um processo de fabricação mais reprodutível, garantindo que poros de tamanhos homogêneos fossem formados, além da redução do tamanho dos macroporos. Na fase de primeira geração o macroporo possui tamanho entre 1,8-2,0 μm, já na de segunda geração esse tamanho encontra-se situado entre 1,1-1,2 μm. É óbvio que a redução do tamanho do macroporo conduziu a um aumento da pressão, entretanto as colunas Chromolithic High Resolution® ainda podem ser utilizadas em cromatógrafos
convencionais, pois a pressão gerada é inferior a 400 bar [12].
Apesar de não serem utilizadas com elevada frequência, muitos trabalhos científicos vem sendo realizados com os monolitos. Separações de compostos orgânicos sob condições de fase reversa, dos quais se destacam fármacos, peptídeos e proteínas, representam a quase totalidade dos trabalhos publicados [1].Exemplo de aplicação das colunas monolíticas é a determinação de tadalafil em coluna C18, 100 x 4,6 mm, empregando-se vazão de 5 ml/min, em aproximadamente 10 minutos [13].