Çalışmamızda, 21. kromozomda yerleşmiş 14 adet miRNA’nın ekspresyon düzeyleri trizomili ve sağlıklı fetüs taşıyan toplam 77 gebeden elde edilen fetal kültür örnekleri ve maternal plazma örneklerinde araştırılmıştır. Elde edilen verilerin değerlendirilmesi sonucu çalışma gurubu ve kontrol grubunda maternal plazma ve fetal hücre kültürleri miRNA düzeyleri arasında anlamlı farklılıklar bulunmuştur. Özellikle; DS’li fetüs taşıyan annelerin plazma örnekleri, öploid fetüs taşıyan maternal plazma örnekleriyle karşılaştırıldığında, hsa-mir-3156-3, hsa-mir-3648-1 ve hsa-mir-99a düzeylerinin anlamlı düzeyde yüksek olduğu saptandı. Bunun yanı sıra; hsa-mir-125b-2, hsa-mir-155, hsa-mir-3197, hsa-mir- 4759, hsa-mir-3687 için maternal plazma ekspresyon düzeyi/fetal hücre kültürü düzeyi oranı yalnızca DS’li fetüs taşıyan gebelerde kontrollere göre yüksek bulunmuştur. Bu bulgular, miRNA’ların noninvaziv prenatal tanıda kullanılabilecek moleküller olduğuna işaret etmektedir.
Prenatal tanı kavramı uzun yıllardır bilinmekle birlikte noninvaziv prenatal tanı yöntemleri ile ilgili çalışmalar son on yılda araştırmacıların ilgi odağı haline gelmiştir. Özellikle anne kanındaki serbest fetal DNA’nın prenatal tanı testlerinde kullanılması konusundaki çalışmalar son 2 yıl içerisinde büyük ivme kazanmıştır. Plazmada serbest fetal DNA ölçümlerinin tarama testi kategorisinden tanı testi kategorisine alınması da tartışılmaktadır [161].
Trizomi 21 başta olmak üzere, kromozomal hastalıkların noninvaziv prenatal tanısının mümkün hale gelmesi gebeler ve fetüs için daha az komplikasyon riski taşımaktadır. İşlem kolaylığı ise ayrı bir avantajıdır. Pettit ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada, risk faktörü sadece ileri anne yaşı olan gebeliklerde kadınların noninvaziv testleri daha sık tercih ettiği görülmüştür [162]. Porreco ve arkadaşları, 2014 yılında yayınlanan ve 3430 yüksek riskli gebenin dahil edildiği prospektif çalışmalarında maternal plazmadaki serbest fetal DNA’nın trizomi 21 için %99’un üzerinde duyarlılık ve özgüllüğe sahip bir tarama testi olduğu sonucuna varmışlardır [163]. Zhou ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada ise nonivaziv prenatal testin duyarlılık ve özgüllüğü trizomi 21, 18 için, sırasıyla %100 ve %99 olarak bildirilmiştir [164].
Serbest fetal DNA’nın noninvaziv prenatal testlerde kullanımı konusundaki bu umut vadedici sonuçlar yanı sıra miRNA’ların noninvaziv prenatal tanıda kullanımını inceleyen çalışmalar da mevcuttur [52, 56, 57, 63, 165]. Bununla birlikte; DNA’dan daha küçük moleküller olan miRNA’ların noninvaziv prenatal tanıda kullanılabilirliğini konu alan
67
çalışmalar, özellikle trizomi 21’in noninvaziv tanısında miRNA kullanılabilirliğini inceleyen çalışmalar çok az sayıdadır [64, 162]. Öte yandan; diğer hastalıkların noninvaziv tanısında miRNA kullanımı üzerine de araştırmalar bulunmaktadır. Zhu ve arkadaşları, miR-19b, miR-22, miR-29c ve miR-375’in maternal plazma düzeylerinin fetal konjenital kalp defekti olan olgularda up-regüle olduğunu bildirmişlerdir [166]. Bir diğer çalışmada, nöral tüp defektli fetüs taşıyan gebelerin plazma örneklerinde miR-142-3p, miR-144, miR- 720, miR-575, miR-765 ve miR-1275 düzeylerinin normal fetüs taşıyan gebelerdeki plazma düzeylerine göre anlamlı farklılıklar gösterdiği saptanmıştır [167].
Fetal kültür örneklerinde anlamlı sonuç elde ettiğimiz miRNA’lar hsa-mir-125b-2, hsa- mir-155, hsa-mir-3156’dır (p<0,05). Bu üç miRNA’nın ekspresyon düzeyi 17-18 haftalık gebeler arasında trizomili fetüs taşıyan grupta kontrol grubuna göre daha yüksek bulunmuştur (kat değişimi >2). hsa-mir-125b-2; 21p11.1’de miR-99a/let-7c/miR-125b-2 miRNA kümesinde yer almaktadır ve 21. kromozom kaynaklı olup trizomi 21 fenotipine katkısı olabileceği düşünülen önemli miRNA’lar arasındadır [6, 168]. İlginç olarak; 2014’te yayınlanan yeni bir çalışmada, rekürren abortus olgularında genom-wide miRNA ekspresyonu araştırılmış ve kontrol grubuna göre ekspresyonu yüksek saptanan miRNA’lardan biri de hsa-mir-125b-2 olarak bulunmuştur [73].
hsa-mir-155’in hematopoetik dizi farklılaşması, immünite gibi biyolojik işlevlerin yanı sıra kanser ve kardiyovasküler hastalıklar çeşitli patolojik süreçlerde rolü olduğu öne sürülmektedir [74]. 21. kromozom kaynaklı olup DS fenotipine katkısı olabileceği düşünülen önemli miRNA’lardan biri de hsa-mir-155’tir [6, 168]. Bu kadar fazla biyolojik ve patolojik süreçte etkisi olduğu düşünülen hsa-mir-155’in, DS fenotipinde baskın bir etki oluşturması muhtemeldir. Nitekim DS’li bireylerde fenotipik özellikler arasında daha önce değinilmiş olan immünite problemleri, hematolojik malignitelere yatkınlık ve kardiyovasküler defektlerin varlığı, henüz tam olarak kanıtlanmamış olsa da, hsa-mir-155 ve DS ilişkisinin birer kanıtı olabilir.
Tüm maternal plazma örneklerinde anlamlı sonuç elde edilen ortak miRNA’lar hsa- mir-3156-3, hsa-mir-3648-1 ve hsa-mir-99a’dır (p<0,05). hsa-mir-99a çalışmamızda bazı alt gruplarda anlamlı sonuçlar veren, fetal kültür örneklerinde ise istatistiksel olarak iki grup arası karşılaştırmada p değeri 0,05’in üstünde çıkmasına karşın kat değişimi değerleri anlamlı olan bir miRNA’dır. 21. kromozomda yerleşmiş diğer 4 miRNA geni ile birlikte (miR-99a, let-7c, miR-125b-2, miR155 ve miR-802), trizomi 21’li bireylerin beyin ve kalp dokularında aşırı eksprese olduğu bildirilmiştir [6]. Benzer şekilde; Xu ve arkadaşları let- 7c, miR-125b, miR-155 ve miR-802 ve miR-99a düzeylerinin trizomik lenfositlerde öploid
68
lenfositlere göre daha yüksek düzeyde olduğunu saptamışlar ve bu durumun trizomi 21 olgularında immunolojik bozukluklardan sorumlu olabileceğini öne sürmüşlerdir [69]. Ayrıca; 2014’te yayınlanan yeni bir çalışmada, miR-99a/let-7c kümesinin kardiyomyogenezde önemli role sahip olduğu ve Down Sendrom’lu fetüslerde kalp defektlerinden sorumlu olabilecekleri öne sürülmüştür [169].
hsa-mir-3156-3, hsa-mir-3118, hsa-mir-548x ve hsa-mir-3197 ile birlikte, 2009 yılında derin sekanslama kullanılarak yapılan bir çalışmada malign melanomla ilişkilendirilmiştir [82]. Ayrıca meme kanserinde ERBB2 geninin rolünün araştırıldığı çalışmada da bildirilmektedir ve [83] bu çalışmada 361 yeni miRNA prekürsörü tanımlanmış, fakat 21. kromozomda yerleşik bu miRNA’larla ilgili ayrıntılı bilgi verilmemiştir [170]. Bunun yanı sıra; bu miRNA’ların trizomi 21 ile ilişkisini araştıran bir çalışma mevcut değildir.
hsa-mir-3648-1, 21. kromozomda yerleşmiş diğer bir miRNA olup daha önce trizomi 21 ile ilişkisi bildirilmemiştir. Meiri ve arkadaşları tarafından, 23 meme, mesane, kolon ve akciğer tümör örneği ile yapılan, küçük RNA’ların sekanslandığı ve 49 yeni miRNA ve miRNA boyutunda küçük RNA keşfedilen bir çalışmada [84] keşfedilen bu miRNA’nın biyolojik rolü hakkında veri bulunmamaktadır.
Maternal miRNA ekspresyon profillerinin gebelik boyunca dinamik bir değişim içerisinde olduğu ve üç trimestrede maternal plazmada farklı sayıda miRNA saptanabildiği daha önce gösterilmiştir [171]. Hatta bu değişimlerden yararlanarak preeklampsinin patogenezinde miRNA’ların rolünün ortaya konabileceği [172] ve gestasyonel diabetes mellitus’un öngörülebileceği [173] öne sürülmüştür. Çalışmamızda, 13-14 haftalık ve 20- 21 haftalık olguların fetal kültür örnekleri için ortalama ct değerleri ve delta ct değerleri bakımından iki grup arasında farklılık saptanmamıştır (p>0,05). Benzer şekilde; 20-21 haftalık olguların plazma örnekleri için ortalama ct değerleri ve delta ct değerleri de iki grup arasında farklılık göstermemekteydi (p>0,05). Bu sonuçlar örnek sayısının bu gruplarda az olmasına bağlanabilir çünkü çalışmaya alınan olgular gebelik haftasına göre gruplandığında 13-14 haftalık ve 20-21 haftalık hasta ve kontrol gruplarında hasta sayısı 10’un altına inmekteydi. Hasta sayısının az olması göz ardı edilirse, miRNA ekspresyon düzeylerinin optimal değerlendirilmesi için en uygun zaman aralığının 17-18. gebelik haftaları olduğu öne sürülebilir. Ancak bu konuda literatürde destekleyici bir veri bulunmamaktadır. Maternal-fetal etkileşimin zamanla artacağı ancak gebelik terminasyonu için de etik ve yasal sınırlar olduğu düşünülürse miRNA’ların prenatal tanıda kullanılabileceği en doğru zaman dilimi gelecekte rutin kullanım için önem teşkil
69
edecektir. Geniş hasta gruplarıyla yapılacak çalışmalarla bu durum daha ayrıntılı araştırılabilir ve optimal gebelik haftası ortaya konabilir.
13-14 haftalık olguların plazma değerleri dikkate alındığında ise, hasta grubu ve kontrol grubu arasında yalnızca hsa-mir-155’in istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdiği saptanmıştır (p=0,03). Bununla birlikte; bu örneklerde hasta grubu ile kontrol grubu arasındaki hsa-mir-155 ekspresyon farkı sadece 0,14 kat olduğu için bu verinin dikkatli yorumlanması ve geniş hasta gruplarında doğrulanması uygun olacaktır.
Çalışmada karşılaştırdığımız diğer parametreler fetal hücre kültürü miRNA ekspresyon değerleri ile maternal plazma miRNA ekspresyon değerleri idi. Bu karşılaştırmaya göre, DS’li fetüs taşıyan gebeler arasında, maternal plazma ekspresyon düzeyleri fetal hücre kültürü düzeylerinden >2 kat fazla olan miRNA’lar hsa-mir-99a, hsa-mir-3156, hsa-let7c, hsa-mir-125b-2, hsa-mir-155, hsa-mir-3197, hsa-mir-4759, hsa-mir-3687’dir. Tüm grup karşılaştırmalarında anlamlı sonuç veren sadece hsa-mir-99a olmakla birlikte çalışmaya alınan diğer miRNA’lar gibi hsa-mir-99a için de lineer regresyon analizinde anlamlı neden-sonuç ilişkisi kurulamamıştır (p>0,05). Kontrol grubunda hsa-let-7c, hsa-mir-155, hsa-mir-3156 ve hsa-mir-99a maternal plazma ekspresyon düzeyleri fetal hücre kültürü düzeylerinden >2 kat fazla saptanmıştır (p<0,01). Maternal plazma düzeylerinin fetal hücre kültürü düzeylerinden yüksek olması bu miRNA’ların noninvaziv prenatal tanıda kullanılabilirliği açısından da umut vericidir. Ayrıca, plazma hücre ekspresyon düzeyi fetal hücre kültürü ekspresyon düzeyinden yüksek olan miRNA’ların bazıları trizomi 21’li fetüs taşıyan gebeler ile kontrol grubu için ortak iken bazı miRNA’lar (hsa-mir-125b-2, hsa-mir- 155, hsa-mir-3197, hsa-mir-4759, ve hsa-mir-3687) sadece DS’li fetüs taşıyan gebelerin plazmalarında yüksek saptanmıştır. Bu veri, gelecekte yapılacak çalışmalara temel oluşturabilir. Maternal plazma miRNA ekspresyon düzeylerinin fetal hücre kültürü miRNA ekspresyon düzeylerine oranı DS’de gereksiz olmakla birlikte tek gen hastalıklarında yapılacak olan araştırmalara rehber olarak kullanılabilir.
Literatürde çalışmamıza benzer bazı çalışmalar da bulunmaktadır. Önceki çalışmalarda 21. kromozomda yerleşmiş 5 miRNA geninin (miR-99a, let-7c, miR-125b-2, miR155 ve miR-802), trizomi 21’li bireylerin beyin ve kalp dokularında aşırı eksprese olduğu bildirilmiştir [6]. Benzer şekilde; Xu ve arkadaşları let-7c, miR-125b, miR-155 ve miR-802 ve miR-99a düzeylerinin trizomik lenfositlerde öploid lenfositlere göre daha yüksek düzeyde olduğunu saptamışlar ve bu durumun trizomi 21 olgularında immunolojik bozukluklardan sorumlu olabileceğini öne sürmüşlerdir [69]. Bunun aksine; Kotlabova ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada ise, bunların 4’ü (miR-99a, let-7c, miR-125b-2 ve miR-
70
155) plazmada tespit edilebilmiş; miR-99a, miR-125b-2 ve miR-155’in gebelerde gebe olmayan kadınlara göre daha yüksek düzeyde eksprese olduğu ancak bu ekspresyonun sağlıklı fetüs taşıyan gebeler ile trizomili fetüs taşıyan gebeler arasında belirgin olmadığı saptanmıştır [63]. Hromadníková ve arkadaşları ise, 21. kromozom kökenli miRNA’ların maternal dolaşımda tespitinin DS taramasında kullanılıp kullanılmayacağını araştırmışlardır [165]. Çalışmaya DS’li fetüs taşıyan 12, normal karyotipe sahip fetüs taşıyan 12 gebe ile gebe olmayan 6 olgu alınmıştır. Maternal plazmada miR-99a, let-7c, miR-125b-2 ve miR-155 düzeyleri saptanabilmiş, bununla birlikte; DS’li fetüs taşıyan gebelerle normal karyotipe sahip fetüs taşıyan gebeler arasında bu miRNA’ların ekspresyon düzeyleri bakımından anlamlı farklılık saptanmamıştır. Hromadníková ve arkadaşları, miRNA’ların noninvaziv DS tanısında tarama testlerinde kullanılamayacağı yorumunda bulunmuşsalar da çalışma gruplarının oldukça az sayıda olgudan oluştuğu göz önünde bulundurulmalı ve yazarların bu yorumu dikkatle değerlendirilmelidir.
Çalışılan miRNA’lardan hsa-mir-802 grup 1’e ait yalnızca 5 olguda, grup 2’de ise 15 olguda saptanabilmiştir. Bu nedenle; hsa-mir-802’e ait verilerle bu miRNA’nın ekspresyonu için yorum yapılamamıştır. Diğer 4 miRNA arasında ise ekspresyon düzeyleri maternal plazmada iki grup arasında anlamlı farklılık gösteren sadece hsa-mir-99a’dır. Bu bulgular Kotlabova ve arkadaşlarının verileri ile kısmen uyumludur. Fetal kültür örneklerinde miR-125b-2, miR155 düzeylerinin, trizomili fetüs taşıyan grupta daha yüksek çıkması ise Elton ve arkadaşlarının [6] ve Xu ve arkadaşlarının [168] bulgularına benzer özellik göstermektedir. hsa-mir-99a düzeyleri de p değeri 0,05’in üstünde olmakla birlikte; grup 1’ de daha yüksek bulunmuştur.
Çalışmamızda, diğer çalışmalardan farklı olarak, hsa-mir-3156’nın trizomi 21’li fetüs taşıyan olguların hem fetal kültür örneklerinde hem de maternal plazma örneklerinde yüksek düzeyde ekspresyon gösterdiği saptanmıştır. Literatürde hsa-mir-3156 ve trizomi 21 arasında bir ilişki bildirilmemiş olup bu miRNA ile ilgili olarak keşfedildiği [82] çalışma dışında, sadece bir çalışma [83] bulunmaktadır. Daha önce de belirtildiği gibi; meme kanserinde ERBB2 geninin rolünün araştırıldığı bu çalışmada, hsa-mir-3156’nin biyolojik rolü hakkında bilgi verilmemiştir. Bu nedenle; gelecekte miRNA’ların trizomi 21 patogenezindeki rolünün araştırılacağı çalışmalarda hsa-mir-3156 ilişkisinin de ayrıntılı olarak incelenmesi uygun olacaktır.
Çalışmamızın en önemli kısıtlılığı hasta sayısının az olmasıdır. mikroRNA’ların gebelikteki düzeylerinin 3 trimester arasında farklılık gösterdiği bildirilmiştir [50]. Çalışmaya dahil ettiğimiz gebeler arasında en büyük grubu 17-18 haftalık gebeler
71
oluşturmaktadır ve 13-14 haftalık ve 20-21 haftalık gebelerden daha sağlıklı sonuçlar elde etmek için hasta sayısının arttırılmasına ihtiyaç vardır. Bu nedenle de; miRNA’ların gebelik boyunca gösterdikleri ekspresyon farklılıkları göz önüne alınarak daha çok sayıda gebelerden oluşturulacak çalışma gruplarında çalışmalar yapılmasına gereksinim vardır.
Sonuçlarımızı etkilemiş olabilecek diğer bir faktör ise izole edilen mikroRNA’ların saklanma koşullarıdır. Mraz ve arkadaşları, üç izolasyon kitini karşılaştırmış; Trizol/TRI- Reagent ile uygun koşullarda elde edilmiş ve saklanmış miRNA’ların degrade olmayacağını, uygun koşullarda saklanmış örneklerin alınma tarihinden 10 ay sonra dahi RT-PCR ile güvenilir sonuçlar alınabileceğini bildirmişlerdir [174]. Çalışmamızda da izolasyon için Trizol/TRI-Reagent kullanılmıştır. Bununla birlikte; olguların bir kısmında örnekler alınıp saklandıktan sonra RT-PCR işlemine dek 10 aydan fazla süre geçmiştir. Çalışmamızda örnek toplama süresi 2 yıl gibi uzun bir döneme yayılmıştır. Her ne kadar topladığımız örneklerin saklama koşulları mümkün olduğunca örnekler arasında eşitlenmeye çalışılmış olsa da örneklerin bekleme süreleri birbirlerinde farklıdır. Dolayısıyla da saklama koşullarının örneklerdeki miRNA düzeylerine olumsuz etkisi ekarte edilemez.
mikroRNA’lar DNA’dan küçük moleküllerdir ve bu nedenle de fetal-maternal etkileşimde daha kolay yer değiştirebilir. DS ile maternal plazmada miRNA kaynağını plasenta olduğu kadar fetustan geçen miRNA’lar da oluşturabilir. Trizomi 21’e bağlı hem plasenta hem de fetal kaynaklı miRNA’ların maternal plazmada daha yüksek düzeyde saptanabileceği varsayımı, çalışmamızı tasarlamamızda önemli rol oynamıştır. Ancak, günümüzde, fetal DNA’nın prenatal tanıda kullanımı üzerine daha çok yayın bulunmaktadır. Bu durum, yani miRNA’larla ilgili çalışmaların az sayıda olması, hem verilerimizin yorumlanmasını güçleştirmekte hem de bu konudaki ilerlemelerin daha yavaş olmasına neden olmaktadır. Fakat miRNA’larla yapılan çalışmaların sonuçları, bu küçük moleküllerin tanı, izlem ve tedavi süreçlerinde kullanımını mümkün göstermekte olup sonuçlar umut vericidir. Doku ve sıvı örneklerinden hem DNA hem miRNA izolasyonu yapılabildiği göz önüne alındığında iki molekülün karşılaştırılacağı çalışmaların gündeme gelmesi çok uzak görünmemektedir.
Sonuç olarak; çalışmamız, bilgilerimize göre, maternal kan miRNA ekspresyonu ile DS’nin noninvaziv tanısı konusunda yapılmış ikinci çalışmadır. Olgu sayımız az olmakla birlikte; elimizdeki bilgilere göre; konuyla ilgili olarak literatürdeki en geniş seriyi yansıtmaktadır. Bulgularımız söz konusu miRNA’ların, özellikle kromozomal hastalıkların noninvaziv prenatal tanısında kullanılmaya aday moleküller olduğunu desteklemektedir.
72
Farklı hastalık gruplarında yapılacak çalışmalarla, miRNA ekspresyon düzeylerinin ya da oranlarının prenatal tanıda kullanılabilecek bir biyobelirteç olması mümkün gözükmektedir. Bununla birlikte; literatürden farklı olarak ekspresyon düzeylerinde ilk kez farklılık saptadığımız miRNA’lar başta olmak üzere, bu konuda geniş hasta serileri içeren ve çok merkezli çalışmalar yapılması gerekmektedir. Elde edilecek yeni bulgular ve ayrıntılı çalışmalar ile miRNA’lar ve DS fenotipi arasındaki epigenetik ilişkinin aydınlatılması da mümkün olabilecektir.
73