Spinal kord yaralanması fiziksel, duygusal ve ekonomik boyutu ile toplumun geniş bir kesimini etkilemektedir. Komplet ya da inkomplet olsun sonuçları açısından büyük bir sosyal problemdir. Omurga cerrahisi ve biyomekaniği üzerinde son yıllarda artan deneyimler ve rehabilitasyon konusundaki gelişmelere rağmen, medulla spinalis yaralanmalarında istenilen başarı sağlanamamaktadır. Yapılan bilimsel çalışmalarda, medulla spinalis yaralanmalarının erken döneminde değişik tedavi yöntemler uygulanarak oluşan kalıcı hasar önlenmeye çalışılmaktadır (104).
Patofizyolojik olarak iki ana mekanizmaya ayrılan spinal kord yaralanmalarında, birinci mekanizma medulla spinalisin mekanik olarak hasar görmesini tanımlar. Birincil hasar, nöronal ve vasküler mekanik hasar yaratır. Hem omurilikteki kan akışı hem de metabolizmadaki değişiklikler sonucunda gelişen ikincil hasar, ilkinin etkisini arttırıp kalıcı hasara yol açar. Kalıcı nörolojik disfonksiyon, primer nöronal hasardan çok ikincil değişikliklerden kaynaklanır. Birincil hasarın tıbbi veya cerrahi herhangi bir tedavisi olmasa da, ikincil değişikliklerin mekanizmalarını ortaya çıkarmak ve bunları engellemek kuramsal açıdan mümkündür (105). Geç dönemde ikincil hasarlanma, hücresel ve biyokimyasal süreçlere bağlı olarak, hücre ölümü ve doku hasarı sonucu oluşur.
Günümüzde travmatik spinal kord travmasının modern anlamda tedavisine yönelik çalışmalar, hasarın ikincil yaralanma mekanizmalarıyla olan şiddetlenmesine odaklanmıştır. Serbest radikal oluşumu, lipid peroksidasyonu, prostoglandin ve eikosanoid oluşumu, proteaz aktivasyonu, glutamat gibi eksitotoksik molekülleri ve intrasellüler kalsiyum artışı ikincil hasar mekanizmasında patofizyolojiyi açıklar (104). İkincil yaralanma mekanizmaları hemoraji, mikrosirkülasyon kaybı, iskemi, intraselüler ATP üretiminde azalma, laktik asidoz, kalsiyum iyonu akışındaki artış, ekstraselüler potasyumda artış, serbest oksijen radikallerinin üretiminde artış, lipid peroksidasyonu yoluyla membran hidrolizi, prostagladin ve lökotrien jenerasyonu ve ödem oluşumu dahil olmak üzere; hem vasküler hem de nöronal hasarları kapsar. Bu hasarın, medulla spinalis hasarındaki kalıcı defisitin ana nedeni olduğu düşünülmektedir (106). Nöroprotektif strateji ikincil hasarlanma ile oluşan etkilerden korunmayı, dokuların ve işlevsel kapasite kaybının önlenmesini amaçlar (104). İkincil hasar mekanizmaları hakkında geniş bilgi edinilmesine rağmen bu hasarın kalıcılığını önleyecek ve motor nöron kaybını engelleyecek evrensel bir tedavi protokolü
belirlenememiştir. Yapılan deneysel çalışmaların odak noktasında ise apoptotik süreç yer almaktadır. Medulla spinalis travması sonrası, gelişen ikincil hasarın önlenmesinde, bu hasardan sorumlu olan apoptozunn engellenmesi veya yavaşlatılması tedavi protokolünda yeni ufuklar açacaktır (107).
Akut spinal kord hasarının tedavisi konusunda son yirmi yıl içerisinde, tedavi protokolünü belirlemek için birçok çalışma yapılmıştır. Metilprednizolon, gangliosidler, nalokson, trilazad mezilat, nimopidin, ginkgo biloba, aktifleştirilmiş protein C, tirotropin salan hormon, prostasiklin, Vitamin E, siklohemiksid ve gabeksat mezilat dahil olmak üzere çeşitli ajanların tedavi edici etkisi hem klinik, hem de deneysel çalışmalarla incelenmiştir. Bu çalışmalar arasında akut dönem metilprednizolon kullanımı NASCIS I, II, III (Ulusal Akut Omurilik Yaralanması çalışmaları) sonuçlarının ardından yaygın olarak kabul görmüştür. NASCIS çalışmaları, yüksek metilprednizolon dozlarının yaralanmayı izleyen ilk 8 saat içerisinde verildiği taktirde, nörolojik iyileşmeyi desteklediğini doğrulamıştır. Şimdiye kadar, metilprednizolonun koruyucu etkisi, metilprednizolonun lipid peroksidasyonunu engelleyerek membran lizisini inhibe etmesi olarak açıklanmıştır (106). Yaptığımız bu deneysel çalışmada NASCIS çalışmaları da göz önüne alınarak tedavi gruplarının karşılaştırılması amacıyla şimdiye kadar kanıtlanmış en etkin ajan olan metilprednizolon pozitif kontrol grubu olarak oluşturulmuştur.
Yapılmış önceki çalışmalar değerlendirildiğinde nöral doku hasarının hücresel ölümün üç farklı yolla olduğu görülmüştür. Bunlar nekroz, apoptoz ve otofajidir. Apoptoz hücresel büzüşme, nükleustaki kromatin kitlelerin ayrılması, nükleer fragmantasyon ve devamında memrana sıkışmış apoptotik cisimlerin varlığıyla karakterize edilir. Bununla birlikte apoptoz daha çok kaspaz, sitokrom c, bax, bcl ve DNA fragmantasyonlarının biyokimyasal ölçümü ile saptanabilir (108). Çalışmamızda nöral dokulardaki hasarın gösterilmesinde western blot yöntemiyle apoptoz değerlendirilmiş olup; bu amaçla kaspaz- 3, bax ve bcl-2 değerleri tespit edilmiştir.
Yapılan deneysel çalışmalarda açıklığa kavuşturmaya çalıştığı temel mekanizma, ikincil hasar mekanizmasının altında yatan fizyopatolojidir. Kompresyon yaralanması sonrası spinal kordun mikrovasküler dolaşımı ve kan akımı, iskemiye neden olacak kadar düşer. Bu sebeple birçok deneysel çalışmanın değindiği serbest oksijen radikalleri ve membran lipid peroksidasyonu ikincil hasar patofizyolojisinde önemli rol oynar (109). Çalışmamızda serbest oksijen radikallerinin ortamdan uzaklaştırılmasında rol oynayan süperkoksit dismutaz, katalaz ve glutatyon peroksidaz enzimlerinin nöral dokudaki aktiviteleri tespit edilmiştir.
5.1. HBO Tedavisinin Spinal Kord Yaralanması Üzerine Etkisi
HBO tedavisi, nörovasküler kan akımını artırıcı ve oksidatif stress parametrelerini ortadan kaldırıcı etki ettiği bilinmektedir. Deneysel modellerde HBO tedavisinin hipoksik durumu düzelttiği ve ödemi azalttığı spinal kordda gösterilmiş bununla birlikte beyin travması ve serebral iskemiyi önlediği görülmüştür (110). Hiperbarik oksijenin biyolojik etkisi tedavi sırasında ve hemen sonrasında plazmada artmış olarak bulunan çözünmüş oksijenin dolaşım ile çevre dokular arasındaki diffüzyon gradientini geçici olarak arttırmasıyla gerçekleşir (110,111). HBO tedavisi, %100 oksijenin normal atmosfer basıncını aştığı basınçlarda inhalasyon olarak uygulanır (105). Rölatif hipoksi süreleriyle gerçekleştirilen değişimli HBO tedavileri, doku iyileşmesini ve onarımını sağlamak üzere gerek duyulan sürekli anjiyogenezi, fibroblastik proliferasyonu, kollajen oluşumunu ve lökosit aktivasyonunu desteklemek için gerekli olan oksijen gradientlerini temin eder (105,7).
HBO tedavisini, OİH deneysel modelinde ilk kez tatbik eden Maeda ve ark. (1965), yaptıkları deneysel çalışmada OİH oluşturulan köpeklerde iskemiye neden olan hipoksiye karşı 2 ATA HBO tedavisi uyguladıktan sonra spinal kord dokularında oksijen seviyelerinin önemli ölçüde arttığını göstermişlerdir (112). Yeo ve ark.,(1976)’da HBO tedavisinin yaralanmayı takiben ilk iki saat içinde uygulanması halinde motor yenilenmeyi arttırdığını ve dejenerasyonu azalttığını tespit etmişlerdir (113). HBO tedavisinin spinal kord yaralanması sonrası apoptozu azalttığı ve erken dönem uygulamanın progresif dejenerasyonu engellediği gösterilmiştir (114, 115,116).
Çalışmamızda, yaralanma sonrası erken dönem HBO tedavisinin nörolojik geri dönüşü, BBB skorlarına (p<0.05) dayanarak anlamlı şekilde arttırdığı tespit edilmiştir. SOD, GPx ve katalaz enzimleri, travma grubunda sham grubuna göre anlamlı şekilde yüksek bulunmuştur (p<0.05). Bu durum ise travmanın yeterli olduğunu göstermiştir. İskemiye ikincil gelişen doku hasarı, SOD miktarının hızlı bir şekilde yükselmesine ve serbest O2 radikallerinin parçalanmasına yol açar. O2 radikalleri hızla H2O2’ye indirgenmelidir. Eğer bu dönüşüm hızla gerçekleşemezse, OH-
‘ye dönüşür ve nöral doku için en tehlikeli radikal oluşur. Ardından H2O2 molekülü, GPx ve katalaz enzimleri sayesinde H2O ‘ye indirgenir. GPx ve katalaz enzimleri aynı substratı kullanırlar (7). SOD enzimi, GPx gibi travma grubuyla karşılaştırıldığında HBO grubunda anlamlı fark bulunmuştur. Katalaz enzimi ise GPx gibi H2O2 ‘yi substrat olarak kullanır; ancak yüksek düzeyde substrat konsantrasyonuna ihtiyaç duyar. Bu çalışmamızda GPx anlamlı oranda yüksek çıkmakla birlikte aynı substratı kullanan katalazın onun kadar yüksek çıkamaması,
düşük substrat konsantrasyonuna bağlanmıştır. Ancak spinal korda ait katalaz enzim kinetiğinin (H2O2 optimal konsantrasyonu) belirlenmeden kesin birşey söylemek olası değildir. HBO uygulanmış spinal kord hasarında SOD ve GPx düzeylerinin yüksek olması, serbest O2 radikallerinin hızla indirgendiğini göstermiştir (p<0.05).
Çalışmamızda elde ettiğimiz sonuçlar, Huang ve ark. (2003) ile Murakami ve ark. (2001) tarafından yapılan çalışmaların sonuçlarıyla benzer şekilde, HBO tedavisinin spinal kord motor hücre korunmasında etkili olduğunu göstermiştir (117,118). HBO tedavisi yüksek düzey O2’nin plazmada çözünmüş olarak taşınmasını sağlar ve muhtemelen bu durum post-iskemik ATPaz’ın çalışmasının azalmasını önleyerek dokunun ihtiyacı olan enerji ihtiyacını karşılamasına yardımcı olur. ATPaz bağımlı Na+,Ca++ ve K+ kanallarının gradientinin korunması yoluyla da doku hasarının azalmasını sağlar.
Hipoksinin aktive ettiği bir transkripsiyon faktörü olan, global iskemi ve hipotansiyondan sonra ortaya çıkan ve apoptozdan sorumlu olan hypoxia-inducible faktör 1 alfa (HIF-1alfa) ekpresyonunun HBO tedavisi ile baskılandığı, apoptozun belirgin şekilde azaldığı saptanmıştır (105). Wang ve ark. (2009), torasik aort oklüzyonu yaparak oluşturdukları iskemi modelinde 24. saat sonunda bcl-2, SOD ve katalaz enzim düzeylerinin yükseldiğini, HBO’nun iskemiye bağlı sıçan medulla spinalisinde apoptozu azalttığını, kaspaz-3 düzeylerinin ise yükseldiğini göstermişlerdir (115). Bcl-2 hücrede mitokondrial fonksiyonlarda yer alan bir moleküldür. Mitokondrial membran bariyer fonksiyonunu stabilize ederken transisyon por kompleks geçirgenliğini inhibe eder ve adenine nükleotit translokaz (ANT)’in oluşturduğu kanal formasyonunu engelller. Bax ve ANT arasındaki kooperasyonu nötralize eder. Dahası azaltılmış mitokondrial permeabilite ile solunum zincirinin kompleks-1 safhasındaki reaktif oksijen üretiminin azaltılmasında rol alır. Çalışmamızda mitokondrial yolakta yer alan anti-apoptotik bcl-2, HBO grubunda
travma grubuna oranla yüksek çıkmıştır (p<0.05); ancak pozitif kontrol grubu metilprednizolona oranla düşük düzeyde olduğu belirlenmiştir (p<0.05). Bu sonuçlar literatürdeki benzer çalışmalarla uyumlu bulunmuştur (119,120,121). Ancak apoptoz yolağının son aşamalarında yer alan, apoptozda anahtar rolü olan kaspaz-3 düzeyi, travma grubuna ve metilprednizolon grubuna oranla anlamlı düzeyde yüksek olarak saptanmıştır (p<0.05). Aynı şekilde apoptotik bir molekül olup mitokondrial yolakda yer alan Bax protein, çalışmamızda HBO, sham ve metilprednizolon grubuna göre anlamlı düzeyde yüksek bulunmuştur (p<0.001) ve travma grubuyla arasında anlamlı fark tespit edilmemiştir (p≥0.05). Sonuçta HBO grubunda Bax ve kaspaz-3 apoptotik süreçte artmış; bu durumda bu gruplarda apoptozun arttığını göstermiştir. Literatürde konuyla ilgili az
sayıda çalışma olup mevcut yayınların çoğu verilerimizin aksine HBO uygulamasında apoptozunn azaldığını göstermektedir. Huang ve ark. (2015) ve Long ve ark (2014), spinal kord yaralanması olan hayvanlarda uygulanan HBO tedavisi sonrası apoptozun azaldığını belirtmişlerdir (122,123). Huang ve ark., (2015), HBO uygulamasının Bax ekpresyonunu azaltarak sitokrom c’nin salınımını azaltarak apoptozu azalttığını öne sürmüştür. Ancak Bcl-2 düzeylerini anlamlı düzeyde yüksek bulmamış; bunu da HBO tedavisinin apoptoz mekanizmasında bcl-2’nin yerinin olmadığını belirtmişlerdir (122). Wang ve ark.(2009) ise yaptıkları çalışmada antioksidan enzimlerin yanı sıra, bcl-2 sentezinin arttığını ve bunun mitokondrial membran geçirgenliğini azaltarak, apoptoza engel olduğunu belirtmişlerdir (115). Bu bulgular çalışmamızı destekler nitelikte olup; kaspaz-3 ve bax değerlendirilmediği için apoptoz açısından değerlendirmede çelişki doğurmaktadır.
Paradoksal olarak oksijen, hem hücre yaşamı için hem de hücre ölümü için gereklidir. Yüksek seviye oksijene maruziyet sonrası hücre çoğalması ve canlılığı arttırdığı gibi, hiperoksijen endothelial hücre proliferasyonunu inhibe edebilmekte, in vivo ve in
vitro çalışmalarda apoptozu çeşitli hücrelerde indüklediği gösterilmiştir (124,125,126).
Moleküler oksijen, elektron transfer (redox) kimyasıyla hücre içinde reaktif oksijen moleküllerine dönüşmektedir. Bu reaktif ürünler hücrede hidrojen peroksit (H2O2) , süperoksit anyon (O2−) ve hidroksil radikali (OH−) olarak bulunur. Reaktif oksijen ürünleri direkt olarak enzim redokslarını, transkripsiyon faktörlerini ve iyon kanallarını değiştirerek etki ederler. Redokstaki bu değişim proteinlerin aktivasyonu ve inaktivasyonuyla sonuçlanabilir. Reaktif oksijen ürünlerinin hücre içinde yaptıkları bu değişimler izlendiğinde apoptozun indüklenmesi sürecinde önemli rol aldıkları düşünülebilir (127). Reaktif oksijen ürünleri ve apoptoz arasındaki bu ilişki bazı hastalıklarla da ilişkilendirilebilir. Hücresel reaktif oksijen ürünlerinin kontrol defekti, HIV enfekte T lenfositlerin apoptozu ve amniyotrofik lateral sklerozdaki motor nöron kaybıyla ilişkilendirilebilir (124).
Reaktif oksijen molekülleri hücrede yerleşimlerine ve konsantrasyonlarına göre pozitif veya negative etkiyi aynı anda gösterebilir. Hücre içinde hızla miktarının artması sonrası lipid membranlara saldırıp, yapılarını bozar. Hiperbarik tedavi sırasında reaktif oksijen moleküllerinin artışı membran yapılarını bozar ve mitokondrial permeabiliteyi arttırır (128,129). Bai ve ark. (2014)’nın akut pakreatit yarattıkları ratların T lenfositleri üzerinde yaptıkları çalışmada, normobarik, hiperoksik ve hiperbarik oksijen uygulamaları karşılaştırılmıştır. Yaptıkları çalışmada HBO grubunda mitokondrial membran
permeabilite potansiyelinin anlamlı oranda düştüğünü ve aynı grupta hücre içi reaktif oksijen moleküllerinin de anlamlı şekilde arttığını tespit etmişlerdir. Lenfositlerin apoptozunun HBO sonrası % 41.5 ve % 40.6 oranlarında arttığını, bununla birlikte western blotta kaspaz-9 ve kaspaz-3 düzeyinin de arttığını tespit etmişlerdir (128). Bahsedilen bu çalışmalar apoptoz sonuçları açısından bizim çalışmamız ile uyumlu bulunmuştur. Çalışmamızda bulunan kaspaz-3 ve bax protein yüksekliği, benzer apoptoz mekanizmasının spinal kord yaralanmasında da olabileceğini göstermiştir. Mitokondrial yolak üzerinden gerçekleşen apoptoz, mitokondrinin membrane potansiyelini düşürüp, hücre içine sitokrom c salınmasını arttırmaktadır. Bu durum, çalışmamızda anlamlı oranda yüksek çıkan bax proteinini açıklamaktadır (p<0.05). Hücreye salınan sitokrom c, pro- kaspaz 9 vasıtasıyla kaspaz kaskadını aktive edip; en son kaspaz 9 ve kaspaz 3 üzerinden apoptozu gerçekleştirmektedir. Bu yolak mitokondrial yolak veya intrensek yolak olarak tariflenir (130,131,132).
Weber ve ark. (2009) hücre kültürleri üzerinde yaptıkları çalışmada jurkat T hücrelerinde HBO uygulaması sonrası apoptozun arttığını tespit etmişler. Kaspaz-9 ve kaspaz-3 düzeylerinin yüksek olmasını mitokondrial yolak üzerinden geliştiği hipoteziyle değerlendirmelerde bulunmuşlardır. Onlar da mitokondrial permeabilite potansiyelinin kaybı sonrası sitokrom c artışıyla kaspaz yolağının aktive olduğunu göstermişlerdir. Ekstrensek yolağın etkisini değerlendirebilmek için FAS reseptörü ve kaspaz-8 düzeyleri ölçülmüş; kaspaz-8 ve fas reseptörlerinin düşük çıkmasıyla HBO uygulamasının mitokondrial (intrensek) yolak üzerinden etkili olduğunu göstermişlerdir (129). Çalışmamızda da yüksek bulduğumuz mitokondri üzerinden etkili anti-apoptotik protein Bcl-2’nin artışını, Weber ve ark. (2009) tarafından belirtildiği gibi, bax protein artışının ve mitokondrial permeabilite artışının etkisiyle olduğunu söyleyebiliriz. Çalışmamızda spinal korddaki antioksidan enzimlerin artışı mevcut yayınlarla korele iken; literatürde çok az çalışmada gösterilmiş olan HBO etkisiyle indüklenen apoptoz, spinal kord yaralanmalı hayvan modelinde ilk kez ortaya konulmuştur. Fonksiyonel BBB skorları değerlendirildiğinde, HBO grubunun diğer gruplardan anlamlı düzeyde yüksek olduğu görülmüştür (p<0.05). Bunun yanısıra antioksidan enzimler ve anti-apoptotik Bcl-2 proteinin yüksek oluşu göz önüne alındığında, kaspaz-3 ve bax protein yüksekliği ile artan apoptoz, hücre rejenerasyon ve yıkımının artışına bağlı paradoksal bir yükselme olarak açıklanabilir. Travmaya maruz kalmış motor nöron hücrelerinin apoptozunun kaçınılmaz oluşu HBO uygulaması sonrası hızlanmış olup; sakrifizasyonu gerçekleştirdiğimiz 8. günde alınan örneklerde apoptotik belirteçleri (kaspaz-3 ve bax) yüksek saptamamıza
sebep olmuştur. Yukarıda açıkladığımız HBO sonrası hücre içi reaktif oksijen ürünlerinin artışının mitokondrial yolak üzerinden apoptozu hızlandırdığı mekanizma, hasarlı motor nöronlarda bulduğumuz bu sonucu açıklamaktadır. Ancak literatürdeki çok az veri ve hayvan çalışması bu mekanizmayı açıklayabilecek düzeydedir.
5.2. Tetanoz Toksininin Spinal Kord Yaralanması Üzerine Etkisi
Tetanoz toksininin c-domainin motor nöron iyileşmesine etkisi siyatik sinir ve hücre kültürü ortamında kanıtlanmıştır. Spinal kord yaralanma modelinde ise motor nörona koruyucu ve yenileyici etkisi olacağını varsayılmaktadır. Tetanoz toksinin c-domainin nöroprotektif ve anti-apoptotik etkilerinin olduğu gözlemlenmiştir ve bu etkilerin nörotropin yolaklarının sinyalizasyonun aktivasyonu sonucu ortaya çıkmaktadır (8,9). SKY modelinde kısa dönemde (ilk iki saat) uygulanan Hc-TeTx’in p44/p42 MAP kinaz (ERK1/2) ve glikojen sentaz kinaz-3 (GSK3b) yolaklarının sinyalizasyonunda çok önemli bir rol oynayarak nöroprotektif bir etki ortaya çıkarmaktadır (8).
Akut spinal kord yaralanmasından sonra fizyopatolojik olarak bir çok mekanizma ikincil yaralanmayı açıklamaya çalışır. Eksitoksisite bu ana mekanizmalardan birisidir (133). Bazı çalışmalar iskemi, apoptoz ve enerji kollapsı gibi süreçlerin indüklenmesinde eksitoksisiteyi sorumlu tutmaktadır (134). Spinal kord motor nöronları da eksitoksisiteden büyük oranda zarar görür (135,136).
Yapılan bazı çalışmalarda tetanoz toksininin (TTX) serebellar granül nöronlarının potasyum yokluğu sonrası oluşan mitokondrial permeabiliteye bağlı apoptozu engellediği aynı zamanda nöronal 1-metil-4-phenylpridium toksisitesini in vitro ve in vivo olarak azalttığını tespit etmişlerdir (137, 138). Chaïb-Oukadour ve ark (2001, 2003) yaptıkları çalışmalarda, tetanoz toksinin c-domaininin rat sinaptozomlarında ve kortikal nöronlarında p21ras/MAPK (mitogen-activated protein kinase), PI3-K (phosphatidylinositol 3- Kinase)/Akt ve PLCc/PKC sinyal yolaklarını aktive ettiğini bununda tirozin kinaz reseptör indüksiyonuyla nöronlarda anti-apoptotik etki gösterdiğini belirtmişlerdir (137).
Moreno–İgoa ve ark. (2010), spinal kord motor nöron hasarıyla seyreden amniyotrofik lateral skleroz (ALS) hayvan modelinde, intramusküler tetanoz c-domaini kodlanmış DNA enjekte edip hastalığın başlamasının geciktiğini ve fonksiyonel olarak iyileşme gözlendiğini belirtmişlerdir (139). Gunay ve ark. (2014) ise siyatik sinir yaralanma modelinde ilk kez periferik sinir üzerinde tetanoz toksini c-domaini uygulanmış fonksiyonel, elektromiyografik ve histolojik olarak anlamlı iyileşme tespit etmişlerdir (10). Apoptoz schwan hücrelerinin ölümünde temel mekanizmayı oluşturmakta ve tetanoz
toksinin c-domainin bu mekanizmayı engellemesini Bcl-2 ve Bcl-xL üzerinden anti- apoptozla gerçekleştirdiği düşünülmektedir. Bcl-xL ile c-domaini arasında gerçekleşen bağlanma sayesinde periferik sinir üzerindeki nötrofil aracılı apoptozu engellediği ortaya konmuştur (140). Çalışmamızda tetanoz toksini uyguladığımız spinal kord doku örneklerinde apoptoz ve antioksidan enzimler değerlendirildi. Bu modelde apoptozla ilgili yapılmış çalışma çok az sayıda iken; antioksidan ölçümü değerlendirilmesine de literatürde rastlanmamıştır. Apoptoz üzerine yoğunlaşan çalışmalar yukarıda değindiğimiz mitokondrial yolak üzerinden kaspaz aracılı apoptozu azalttığı yönündedir. İkincil yaralanma mekanizması değerlendirildiğinde, hücrede oksijen reaktif ürünlerinin gene mitokondrial (intrensik) yolak üzerinde apoptoza sebep olması nedeniyle tetanoz toksininin etkinliğinde antioksidan ölçümü değerli veriler vermiştir. Çalışmamızda yaralanma sonrası erken dönem intradural uygulanan tetanoz toksini tedavisinin nörolojik geri dönüşü, BBB skorlarına (p<0.05) dayanarak anlamlı şekilde arttırdığını tespit ettik. SOD, GPx ve katalaz enzimleri travma grubunda sham grubuna göre anlamlı şekilde yüksek (p<0.05) iken; bu da travmanın yeterli olduğunu göstermiştir. SOD ve Gpx enzimleri travma grubuna göre anlamlı oranda yüksekken (p<0.05) pozitif kontrol grubu metilprednizolondan farklı bulunmamıştır (p≥0.05). Katalaz enzimi sonuçlarının düşük olmasını (p<0.05) HBO grubunda bulduğumuz sonuçlarla birlikte değerlendirdiğimizde Gpx ile aynı substratı kullanmasını ve Gpx’e oranla daha yüksek substrat konsantrasyonlarına ihtiyaç duymasını neden olarak gösterebiliriz. Tetanoz toksini uygulanmış spinal kord hasarında SOD ve GPx düzeylerinin yüksek olması, serbest O2 radikallerinin hızla indirgendiğini göstermiştir (p<0.05).
Spinal kord hücre kültürlerinde ve ALS hayvan modelinde yapılan çalışmalarda tetanoz toksini c-domaininin motor nöronlardaki apoptozu azalttığı gösterilmiştir (141, 142, 8, 139). Bunun mekanizmalarının sinyal yolağı araştırmalarında, mitokondrial yola bağlı kaspaz-9 ve kaspaz-3’ü işaret ettikleri görülmüştür. Çalışmamızda değerlendirdiğimiz kaspaz-3’ün tüm gruplara göre anlamlı oranda düşük olduğu ortaya konulmuştur (p<0.001). Bu durum apoptozun son kaskadının azaldığını göstermektedir. Carlton ve ark. (2008)’da tetanoz toksininin Bcl üzerinden anti-apoptotik mekanizmayla da apoptozu yavaşlattığını belirtmiştir (140). Çalışmamızda Bcl-2 değerleri travma grubuna kıyasla anlamlı oranda yüksekken (p<0.05), metilprednizolon grubuyla arasında fark bulunamamıştır. Bir diğer apoptotik belirteç bax proteinin de düşük olması mitokondrial yolak üzerinde etkili bir apoptoz inhibisyonu sağlandığını doğrulamıştır. Antioksidan enzim aktivitelerinde anlamlı yükselme, apoptozdaki düşüş ve fonksiyonel BBB
skorlarındaki sonuçlarımız literatürle korele olup, önceki açıklanan mekanizmaları kanıtlar niteliktedir. Tetanoz toksininin motor nöron koruyucu etkisinin ortaya konması, spinal kord yaralanması ve ALS gibi motor nöron hastalıklarında umut vermekte ve ilerleyen çalışmalara ihtiyaç duymaktadır.
5.3. EGF’in Spinal Kord Yaralanması Üzerine Etkileri
Büyüme faktörlerinin uygulama alanları son dönemde artmış ancak Fgf-2 ve Egf spinal kord yaralanma modelinde koruyucu etkisinin etkinliği az sayıda yeni çalışmayla gündeme gelmiştir. Spinal kord yaralanması sonrası epicenterda normal dokuda kayıp ve kistik kavitasyon gerçekleşmektedir (143,144). Spinal kord yaralanması aksonal büyüme, yeni myelin oluşumu ve ependimal hücre proliferasyonu gibi çok çeşitli rejeneratif değişikliği tetiklese de bu minimal düzeyde kalmakta ve fonksiyonel geri dönüş olmamaktadır (145). Oluşan kistlerin transekt aksonların tekrar büyümesine ve diğer hücrelerle bağlantı kurmasına engel olmaktadır. Rejenerasyonu tekrar sağlamak için hasarlı korda diferansiye olamış prekürsör hücre transplantasyonu gibi stratejiler geliştirilmektedir. Mcdonald ve ark. (1999) yılında yaptıkları çalışmada kord yaralanmalı t- ratlarda transfer ettikleri embriyonik kök hücrelerin yaşayıp farklılaşarak fonksiyonel iyileşmeye katkı sağladığını tespit etmişlerdir (146). Yapılan çalışmalarda erişkin memeli spinal kordunda da multipotent nöral kök hücre ve prekürsör hücreler (nöral progenitor