GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. MateryalBu deneysel hayvan çalışmasında ağırlıkları 200-400 gram arasında değişen 42 Sprague Dawley sıçan kullanılmıştır. Her biri rastgele seçilmiş yedi sıçandan oluşan altı grup üzerinde çalışma gerçekleştirildi. Ortalama üç aylık rattus albinus türü (Sprague Dawley) sıçanlar Kobay A.Ş.’den temin edilmiştir. Memeli bir hayvan olması, fizyolojik ve biyolojik olarak bilinen bir tür olması ve elde edilen sonuçlarının insanlara da uygulanabilme oranının yüksek oluşu nedeniyle deney hayvanı olarak sıçan seçilmiştir. Siklus problemlerinden etkilenmememesi nedeniyle çalışmamızda hayvan cinsiyeti önem taşımamaktadır.
Sıçanlar ameliyat öncesi ve sonrası standart laboratuar yemi ve su ile beslendiler. Biyolojik ritme uygun olarak 12 saat karanlık 12 saat aydınlıkta üçerli kafeslerde barındırıldılar. Sıçanların bakım ve ameliyatları Ege Üniversitesi Argefar Deney Hayvan Laboratuarında yapıldı. Sıçanların kafeslenmiş laboratuvar koşullarına uyumu standart diyet ve su ile ad libitum olarak sağlanmıştır. Odadaki sıcaklık düzeyi 20-24 ºC ve nem düzeyi %50-60 arasında tutulmuştur.
Cerrahi işlem sonrası pleji gelişmesi nedeniyle günde iki kez mesane masajı uygulandı ve alt temizliği batikonlu tampon ile yapıldı. Suya uzanmaları güç olduğu için el ile suları verildi.
Deney grupları aşağıdaki şekilde belirlenmiştir. I. Sham (kontrol) grubu, (n=7)
II. Spinal kord travma grubu, (n=7)
III. Spinal kord travma + rEGF tedavisi grubu, (n=7)
IV. Spinal kord travma + Hiperbarik oksijen tedavisi grubu, (n=7) V. Spinal kord travma + Tetanoz toksini grubu, (n=7)
VI. Spinal kord travma + Metilprednizolon grubu, (n=7) (Pozitif kontrol grubu. Tedavi etkinliğinin kıyaslanması açısından değerlendirimişlerdir.)
A B
Resim 1: Argefar hayvan bakım odası ve kafesleri (A) ve operasyon odası (B).
Anestezi: Deneklerin uyutulmasında Ketamine Hydrochloride (50 mg/kg; Ketalar, Parke-Devis, İstanbul, Türkiye) ve Xylazine Hydrochloride (10 mg/kg; Rompun, Bayer, İstanbul, Türkiye) ile intra peritoneal anestezi yapıldı.
Rahat bir cerrahi girişim sağlamak amacıyla özel deney tespit tahtalarında sıçanlara uygun pozisyon verilerek tüm cerrahi loop altında yapılmıştır.
Bu deneysel çalışma, altı grupta toplam 42 erkek sıçan üzerinde, cerrahi kesi sıçanın sırt kısmında, tıraş yapıldıktan sonra, aseptik şartlar sağlanarak yapıldı. Çalışmada Rivlin ve Tator’ un klip kompresyon modeli uygulandı (94, 95).
A B C
Resim 2: Sıçanların ağırlıkları önce tartılıyor. Daha sonra ağırlıklarına göre verilecek anestezi dozu hesaplanıyor (A). Anestezi intraperitoneal olarak veriliyor (B ve C).
3.2. Yöntem
3.2.1. Cerrahi Yöntem ve Klip Kompresyon Modeli ile OİH
Tüm havyaların anestezi sonrası sırt bölgesi traş edilerek polyvidon iyot (Batticon, Adeka, Samsun) ile lokal antisepsi uygulandı. İnterskapuler mesafe referans alınarak prone pozisyonunda T4-T10 seviyesinden cilt, cilt altı dokular ve paravertebral kas fasiası geçilerek kaslar laterale künt disseksiyonla sıyrıldı. Sıçanın en çıkıntılı olarak göze çarpan Torakal 2’ nin (T2) spinoz çıkıntısı cerrahi işaret noktası olarak kabul edildi ve T4-T10 segmentleri arasında ince uçlu pens coupon ile altı seviyede laminektomi yapıldı. Sham gruplarına yalnızca bu işlem uygulandı omurilik hasarlanmadı. Bu işlem uygulanırken hayvanların duramaterlerinin zedelenmemesine dikkat edildi. Daha sonra hayvanlara ekstradural olarak Rivlin ve Tator klip yöntemi (95) ile bir dakika süreyle klip uygulanarak spinal kord kompresyon travması oluşturuldu. Travmayı standardize edebilmek için ekstradural kapanma basıncı 150 G olan Yaşargil Aesculap® FE 654 tip anevrizma klibi kullanılmıştır.
A B
C D
Resim 3: Cerrahi öncesi bölge traş edildi (A). En çıkıntılı bölgenin distalinden cilt insizyonu(B).Spinöz çıkıntılar ve paravertebral kaslar ortaya kondu (C). Laminalar ortaya kondu (D).
A B
C D
Resim 4: Pens coupon yardımıyla laminektomi safhası (A). Spinal kordun ortaya konması (B) Anevrizma klibi 1 dk süre ile ekstradural koyuldu (C). Hasar sonrası kordun görüntüsü (D).
3.2.2. Tetanoz ve EGF’in Hasar Sonrası Uygulanması
Epidermal büyüme faktörü (15µg/ml, bolus, dura içine) (96) (Heberprot P® 75 Biotech,Küba) ve tetanoz toksini (0,25ml, dura içine,bolus) (8) (Tetavax® , Sanofi Pasteur, Fransa) lokal olarak Hamilton Şırıngasına eklenmiş steril micropipet (tip çapı <50 µm) ile travma bölgesine lokal olarak ~1 mm dura içine girerek uygulandı.
3.2.3. Metilprednizolon Uygulanması
Pozitif kontrol grubunda ise tedavi etkinliği kanıtlanmış metilprednizolon (30 mg/kg) yaralanmanın ardından hemen intraperitoneal olarak uygulanmıştır (97).
3.2.4. Paraplejik Sıçanların Bakımı
OİH olan paraplejik sıçanların bakımı oldukça güçtür. Temel ihtiyaçlarının sağlanması için arka ayakları üzerine kalkması gereken sıçanlar operasyon sonrası, bunu gerçekleştirememektedirler. Bu nedenle, su ihtiyaçlarını günde en az iki kere olmak üzere elle verilmesi gerekti. Yemleri yanlarına bırakıldı. Öte yandan idrar ve gaita inkontinansı gerçekleşen sıçanların perine bakımı günlük olarak batikonlu tampon ile yapıldı. Günde iki kere mesane masajı ile idrar çıkışı sağlandı. Kafesler günlük olarak tamamıyle temizlendi. Genel durumu bozulan sıçanlar ayrı kafeslere alındı.
Resim7. Yemeğe ulaşmaları zor olduğu için yemler yanlarına bırakıldı. Üçerli olarak kafeslere koyuldular.
Resim 8. Paraplejik sıçanlar arka ayaklarının üzerine kalkıp su içmede sıkıntı duyduğundan elle suları verildi.
3.2.5. Hiperbarik Oksijen Tedavisi
Hiperbarik oksijen tedavisi grubundaki yedi deneğe uygulanmıştır. İlk uygulama parapleji yaratıldıktan sonraki bir saat içerisinde olmak üzere; yedi gün boyunca her gün aynı saatte uygulandı. Tedavi denek hayvanları için özel üretilmiş basınç odasında (Barotech Ltd. DB1 model, 2009) 2,80 ATA basınçta günde bir seans ve her seans 60 dakika olacak şekilde uygulandı. Tedavi, Neoks hiberbarik oksijen merkezinde sualtı hekimliği ve hiperbarik tıp Uzm. Dr. Figen Aydın gözetiminde uygulandı. Tedavinin ilk beş dakikası basıncın arttırıldığı kompresyon (dalış) evresi, sonraki 60 dakikalık dönem 2.8 ATA altında özel giriş ve çıkış deliklerinden %100 oksijen ventilasyonunun sağlandığı evre ve son beş dakikalık dönemde basıncın azaltıldığı (çıkış) evresidir (Şekil 16).
Resim 9: Mesane masajı uygulaması. Resim 10: Perine temizliği batikonlu tampon ile yapıldı.
Şekil 16: Hiperbarik oksijen tedavisinin uygulanışı
Barotech Ltd. DB1 model (2009) AR-GE basınç odasının teknik özellikleri ise şöyledir: Çalışma basıncı: 2.6 Bar, 3.6 ATA
Test basıncı: 4 ATA İç çap: 40 cm
Toplam uzunluk: 55 cm Kapı çapı: 46 cm
Malzeme: Tamamı akrilik pencere ve yatay olup pleksiglass maddesinden yapılmıştır. Bütünüyle şeffaf ve net hacmi 70 lt’ dir. Basınç göstergeleri; hat basıncı ve basınç odası göstergesi olmak üzere iki adet olup güvenlik regülatörü bulunmaktadır (Resim 10).
A B
C D
Resim 11. Çalışmada kullanılan Barotech DB1 AR-GE basınç odası (A), sıçanların HBO seansında basınç odasına yerleştirilmesi (B), basınç odasının kapağı kapatılırken görüntüsü (C), sıçanların HBO seansında basınç odasında görüntüsü (D)
3.2.5.1. Omurilik Hasarı Sonrası HBO
OİH uygulandıktan sonra birinci saatte başlanarak, yedi gün boyunca 2,80 ATA basınçta günde 1 seans ve her seans 60 dakika olacak şekilde HBO uygulanmıştır. Postop sekizinci günde bütün sıçanlar sakrifiye edilerek alınan spinal kord örnekleri -80 derecede saklanmıştır.
3.2.6. Motor Performansı Değerlendirme
Motor performansı değerlendirme Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) lokomotor skalasına göre değerlendirilmiştir (Tablo 6 ve Resim 12) (98).
Tablo 6. BBB (Basso-Beattie-Bresnahan) lokomotor skalası 0 Gözlemlenebilir arka ayak hareketi yok.
1 Bir veya iki eklem, genellikle kalça ve / veya diz hafif hareketi
2 Bir eklemde geniş hareket veya bir eklemde geniş hareket ile diğer bir eklemde hafif hareket 3 İki eklemde geniş hareket
4 Herhangi üç farklı arka ayak ekleminde hafif hareket 5 İki eklemde hafif hareket ile üçüncü eklemde geniş hareket 6 İki eklemde geniş hareket ile üçüncü eklemde hafif hareket 7 Üç arka ayakta da geniş hareket
8 Sürünürken ağırlığını destekleyemiyor veya pençelerini yerleştirerek ağırlığını kaldırarak plantar adımlama yapamıyor. Sürünerek yürüyor.
9 Pençelerinin üzerinde sadece duruş fazında ağırlığını kaldırarak durabiliyor (Yani sadece sabit duruyorken)veya arasıra ile sık arasında değişen oranda dorsal adımlama vardır ama plantar yürüyüş yoktur.
10 Zaman zaman ağırlık dengelenerek plantar adımlama, ön ayak - arka ayak koordinasyonu yok. 11 Sık görülen ağırlık dengelenerek plantar adımlama, ön ayak - arka ayak koordinasyonu yok. 12 Sık görülen ağırlık dengelenerek plantar adımlama, Ara –sıra yapılabilen ön ayak- arka ayak
koordinasyonu
13 Sık görülen ağırlık dengelenerek plantar adımlama ile sıklıkla olan ön ayak - arka ayak koordinasyonu
14 Uyumlu ağırlık dengelenerek plantar adımlama, sürekli ön ayak - arka ayak koordinasyonu var. Etkilenen taraf üzerinde duruyorken vücudunu duruş fazının sonunda bir miktar havalandırıp iç-dış rotasyon yapabilir veya sıklıkla plantar adımlamayla beraber nadiren dorsal adımlama gözlenir.
15 Uyumlu plantar adımlama ve uyumlu ön ayak- arka ayak vardır. Ayağını temizlemek için kaldırma ya hiç yoktur ya da çok az ilerletebilmektedir. Ayağa kalkınca etkilenen extremite başlangıçta vücuda pareleldir.
16 Uyumlu plantar adımlama ve yürüyüşte uyumlu ön ayak- arka ayak vardır. Ayakta artan iyileşme ile hafif ayak temizliği yapılır. Pençesinin pozisyonu vücuduna parelel ve vücudunu rotasyonel hafif çevirebiliyor. Kaldıramıyor.
17 Uyumlu plantar adımlama ve yürüyüşte uyumlu ön ayak- arka ayak vardır. Ayakta artan iyileşme ile sıklıkla ayak temizliği yapılır. Pençesinin pozisyonu vücuduna parelel ve vücudunu hafif dengede tutabiliyor. Hafif vücudunu kaldırıyor.
18 Uyumlu plantar adımlama ve yürüyüşte uyumlu ön ayak- arka ayak vardır. Ayakta artan iyileşme ile sıklıkla ayak temizliği yapılır. Pençesinin pozisyonu vücuduna parelel ve vücudunu dengede tutabiliyor. Vücudunu kaldırıyor.
19 Uyumlu plantar adımlama ve yürüyüşte uyumlu ön ayak- arka ayak vardır. Ayak temizliği sürekli yapılır. Pençesini vücuduna paralel tutuyor. Vücudunu dengede tutarak kalkabiliyor. Kuyruk her zaman yerde duruyor. Koordine edemiyor.
20 Uyumlu plantar adımlama ve yürüyüşte uyumlu ön ayak- arka ayak vardır. Ayak temizliği ve vücut temizliği devamlı yapılır. Kuyruk havada ve koordineli kullanılıyor. Gövde instabildir. 21 Uyumlu plantar adımlama ile koordineli yürüyüş vardır. Vücut temizliği sürekli ve bütün duruş
Resim 12: BBB skorlaması yapılabilmesi için hergün sıçanların her birine en az 3 dakika
boyunca yürüme ve hareket analizi yapıldıktan sonra skor sonucu günlük olarak kaydedildi.
3.2.7. Ratların Sakrifiye Edilmesi
Akut ve subakut dönemin sonunda (operasyon sonrası sekizinci günde) tüm ratlar yüksek doz anestezik madde ile sakrifiye edildi (Resim 13). Spinal kord segmentleri eksize edildi. Örnekler western blot ve enzim aktivite tayini ölçümleri için -80 °C’de saklandı.
Araştırmada oluşturulacak farklı gruplardaki deney hayvanlarının doku örneklerinde (medülla spinalis) oksidatif stres belirteçlerinden süperoksit dismutaz, katalaz ve glutatyon peroksidaz düzeyleri spesifik kitler kullanılarak, spektrofotometrik yöntemlerle: apoptoz belirteçlerinden bax, bcl-2, kaspaz-3 protein düzeylerindeki değişim ilgili proteine ait antikorlar kullanılarak, western blot yöntemiyle saptandı.
3.2.8. Kullanılan Biyokimyasal Yöntemler
3.2.8.1. Dokuların Homojenizasyonu
Spinal kord dokularının bir kısmı tartılarak 4 ºC’de 1:10 (a/h) oranında içerisinde 140 mM KCl bulunan 20 mM fosfat tamponu (pH 7.4) ile homojenizatörde 1500 rpm’de homojenize edildi. Daha sonra tüm örnekler 4 °C’de 1200 x g’de 10 dakika santrifüj edildi ve süpernatanlar ayrıldı. Ayrılan süpernatanlar protein miktar tayini, katalaz, SOD, GPx enzim aktivitesi ve western blot analizinde kullanıldı.
3.2.8.2. Protein Miktar Tayini
Dokuların protein içeriğinin ölçümünde Lowry yöntemi kullanıldı (99). Bu yöntemin prensibi proteinlerin alkali ortamda bakır iyonları ile Biüret tepkimesi vermesidir. Alkali çözeltide önce peptid bağları ve bakır tuzları mor renkli bir kompleks oluşturur. Daha sonra Folin-Ciocalteu reaktifinin eklenmesiyle protein yapısındaki tirozin
ve triptofan aminoasitleri indirgenir ve renk oluşumuna katkıda bulunur. Oluşan mavi rengin absorbansı 750 nm dalga boyunda ölçülür.
A B
C D
Resim 13. Sham grubundan sakrifizasyon örneği (A), sıçanların sakrifizasyon sırasındaki penset ile kompresyona uğrayan bölge gösterimi (B), hasar almış bölgedeki makroskobik değişikliklerin görünümü (C), eksizyon sonrası serum fizyolojik ile temizlenmiş spinal kord kesiti (D)
Daha sonra Folin-Ciocalteu reaktifinin eklenmesiyle protein yapısındaki tirozin ve triptofan aminoasitleri indirgenir ve renk oluşumuna katkıda bulunur. Oluşan mavi rengin absorbansı 750 nm dalga boyunda spektrofotometrede ölçülür.
Dokular 20 mM fosfat tamponu (pH 7.4) ile homojenize edildikten ve 1:10 oranında seyreltildikten sonra 0.4’er mL homojenat cam tüplere aktarıldı. Üzerine 2 mL taze alkali bakır çözeltisi eklenerek karıştırıldı. Tüpler 15 dakika oda sıcaklığında bekletildi. Daha sonra 1:1 oranında distile su ile seyreltilmiş 0.2 ml Folin-Ciocalteu çözeltisi eklenerek oda sıcaklığında 1 saat bekletildi. 1 saatin sonunda oluşan mavi renkli çözeltilerin köre karşı spektrofotometrede 750 nm dalga boyunda absorbansları ölçüldü. Kör olarak 0.4 ml distile su, 2 mL taze alkali bakır çözeltisi ve 0.2 mL Folin-Ciocalteu
çözeltisi içeren karışım kullanıldı. Her örnek için üçer kez ölçüm yapıldı. Spinal dokusu protein miktarları daha önceden konsantrasyonu bilinen BSA çözeltileriyle hazırlanarak tespit edilmiş standart eğri grafiği yardımıyla hesaplandı.
3.2.8.3. Protein Miktar Tayini Belirlenmesinde Kullanılan Standart Çözeltilerin Hazırlanması
Stok protein standardı (1 mg/mL) hazırlamak üzere 50 mg BSA tartıldı. Distile suyla 50 ml’ye tamamlandı. Bu stok çözeltiden alınan belirli hacimler, distile su ile seyreltilerek ml’de 20, 60, 80, 100, 150 ve 250 µg protein taşıyan standart çalışma çözeltileri hazırlandı. Bu çözeltilerden alınan 0.4’er mL üzerine 2 mL taze alkali bakır çözeltisi eklenerek karıştırıldı. Tüpler 15 dakika oda sıcaklığında bekletildi. Daha sonra üzerlerine 1:1 oranında distile su ile seyreltilmiş 0.2 mL Folin-Ciocalteu çözeltisi eklenerek oda sıcaklığında 1 saat bekletildi. 1 saatin sonunda 0.4 mL distile su, 2 ml taze alkali bakır çözeltisi ve 0.2 mL Folin-Ciocalteu çözeltisi içeren köre karşı spektrofotometrede 750 nm dalga boyunda absorbansları ölçüldü. Tüm örnekler için üçer kez ölçüm yapıldı. Okunan absorbans değeri ve protein konsantrasyonu arasındaki ilişkiyi gösteren standart bir grafik çizildi.
3.2.8.4. SOD Enzim Aktivitesi Tayini
SOD aktivitesi tayini Superoxide Dismutase (SOD) Activity Assay enzim kiti (Biovision®, ABD) kullanılarak yapıldı. Yöntemin esası, deney ortamında oluşturulan süperoksit radikalinin verdiği renk reaksiyonunun SOD tarafından inhibisyonunun kolorimetrik olarak tayin edilmesi dayanır. Bu yöntemde ksantin, ksantin oksidaz enzimi katalizörlüğünde süperoksit radikaline ve ürik asite dönüşür. Açığa çıkan süperoksit radikali, 2-(4-iyodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-fenil tetrazolyum kloriti (INT) kırmızı renkteki bir bileşiğe (formazan) dönüştürür. Ancak süperoksit radikalinin bir kısmı ortamda bulunan SOD enzimi ile etkileşerek bu reaksiyonu inhibe eder. Bu inhibisyonun oranına bağlı olarak SOD enzim aktivitesi tayin edilir.
SOD enzim aktivitesi tayini için öncelikle süpernatanlar dilüe edici ajan ile 25 kat seyreltildi. Seyreltilmiş örnekler ve hazırlanan substrat karışımı ölçümden en az 5 dakika önce 37°C’lik su banyosunda inkübe edildi. Temiz bir tüpe 850 µL substrat karışımı ve 25 µL dilüe örnek konulduktan sonra 125 µL ksantin oksidaz ilave edildiği anda süre başlatıldı. Tüp içeriği manyetik karıştırıcıda karıştırıldı. Kör küveti boş bırakılıp, örnek küvetine tüp içeriği aktarıldı. 30. saniye, 1., 2., 3. dakikalarda ve 3.5’inci dakikada spektrofotometrede 505 nm’deki absorbans havaya karşı okundu. Tüm örnekler üçer kez çalışıldı. SOD aktivitesi % inhibisyon olarak gösterildi.
3.2.8.5. SOD Tayininde Kullanılan Standart Çözeltilerin Hazırlanması ve Örneklerin SOD Aktivitesinin Hesaplanması
Kit içinde bulunan standart SOD şişesinin içeriği 10 mL bidistile su ile karıştırılıp, 4.9 U/mL konsantrayonunda SOD içeren S6 standardı hazırlandı. Bu standarttan hareketle uygun seyreltmeler dilüe edici ajan ile yapılarak sırasıyla 2.45, 1.225, 0.612 ve 0.204 U/mL konsantrasyonlarında SOD taşıyan S5, S4, S3, S2 standartları hazırlandı. S1 standardı ise yalnız dilüe edici ajan içermektedir; yani S1 reaksiyonu sırasında herhangi bir inhibisyon meydana gelmez.
AS1/dk = İnhibe olmamış reaksiyon oranı = % 100
Standart çözeltilerine örneklere uygulanan işlemler aynen uygulanıp absorbanslar okundu. Aşağıdaki formülden hareketle örneklerin ve standartların A/dk değeri hesaplandı.
A/dk (örnek veya standart) = (A2 – A1)/dk A2: 3.5’inci dk.’daki absorbans
A1: 0.5’inci dk.’daki absorbans
dk: 3 dakika
Tüm standart ve örneklerin A/dk değeri ile AS1/dk değeri arasında orantı kurularak örnek ve standart verileri % olarak ifade edildi. Sonuçlar 100’den çıkarılarak inhibe olmuş reaksiyon oranı hesaplandı.
% inhibisyon = 100 – (Astd/dk x 100) / AS1/dk % inhibisyon = 100 – (Aörnek/dk x 100) / AS1/dk
Örneklerden elde edilen yüzde inhibisyon verileriyle standart inhibisyonları arasında doğru orantı kurularak örneklerdeki SOD aktivitesi U/mL olarak tayin edildi. Buradan elde edilen değer seyreltme faktörü ile çarpıldıktan sonra, sonuçlar ‘‘U/mL protein’’ olarak verildi ve her örnek üçer kez çalışıldığından ortalamaları alındı.
3.2.8.6. Katalaz Enzim Aktivitesi Tayini
Katalaz enzim aktivitesi tayininde, H2O2’in katalaz enzimi tarafından parçalanması (Şekil 18) sonucu 240 nm dalga boyunda absorbansta meydana gelen düşüş üzerinden enzimin aktivite tayinini yapan kolorimetrik bir yöntem kullanılmıştır (101).
2 H2O2 Katalaz 2 H2O + O2
Şekil 18: Katalaz aktivite tayininde temel reaksiyon denklemi (101)
Katalaz enzim aktivitesi tayini için öncelikle bütün süpernatanlar 1 mg/mL protein içerecek şekilde 20 mM fosfat tamponu (pH 7.4) ile seyreltildi. Kör küvetine 1.5 mL 1 mg/mL protein içeren süpernatan konuldu. Örnek küvetine 0.5 mL 30 mM H2O2 çözeltisi ve 1 mL 1 mg/mL protein içeren süpernatan ilave edildi. 30 mM H2O2 çözeltisinin ilave edilmesiyle birlikte süre başlatıldı. Spektrofotometrede 240 nm dalga boyunda absorbanstaki azalma 15., 30., 45., 60., 90., saniyelerde ve 2. 3. dakikalarda köre karşı okundu (102). Tüm örnekler üçer kez çalışıldı.
Absorbans değişiminden hareketle ‘k’ değeri hesaplandı ve sonuçlar mU/mL şeklinde verildi.
k = 2.3 / t x logA1/A2 A1: ilk okunan absorbans A2: son okunan absorbans
t: t2 - t1 (180 sn – 15 sn) 3.2.8.7. GPx Enzim Aktivitesi Tayini
GPx enzim aktivitesi tayininde Glutathione Peroxidase Activity Colorimetric Assay kit kullanıldı (Biovision®, ABD). Beyin dokularındaki GPx aktivitesi bu yöntemle indirekt olarak ölçüldü. Bu yöntemde organik peroksitlerin GPx yardımıyla indirgenmesi sonucunda ortamda bulunan glutatyon okside hale dönüşür. Okside glutatyon glutatyon redüktaz enzimi vasıtasıyla tekrar indirgenmiş hale dönüşür. Bu esnada ortamda bulunan NADPH, NADP+ ‘ya yükseltgenir ve açığa çıkan serbest hidrojen molekülleri okside glutatyona aktarılır. Bu tepkimeler esnasında 340 nm dalga boyunda absorbansta zamana bağlı bir azalma gerçekleşir. Bu azalmadan hareketle GPx enzim aktivitesi tayini yapılır.
R-O-O-H + 2GSH R-O-H + GSSG + H2O
GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+ GPx
GR
Şekil 19: GPx aktivite tayininde temel reaksiyon denklemi (103)
GPx enzim aktivitesi tayini için küvete 350 µL deney tamponu, 350 µL NADPH karışımı ve 70 µL süpernatan ilave edilerek karıştırıldı. Küvete 350 µL ter-butil hidroperoksit çalışma substratının ilave edimesiyle kronometre çalıştırıldı. Kör olarak süpernatan yerine distile su konulmuş çözelti kullanıldı. 1., 2., 3. dakikalarda spektrofotometrede 340 nm’deki absorbans değişimleri kaydedildi. Tüm örnekler üçer kez çalışıldı. Absorbans/dakika hesaplandı. Net A340/dakika, harcanan NADPH (nmol/dk/ml) miktarına aşağıdaki denklem kullanılarak çevrilerek GPx enzim aktivitesi mU/mL şeklinde hesaplandı.
1 mU/mL = 1 nmol NADPH/dk/ml = (A340/dk) / 0.00622 NADPH’ın molar ekstinksiyon katsayısı= 0.00622 µM-1
cm-1 (340 nm) Örneklerdeki GPx enzim aktivitesi U/ml olarak verildi.
3.2.8.8. Western Blot Yöntemi
SDS-PAGE ile jel üzerinde proteinlerine ayrılan örnekler poliviniliden difluorid (PVDF) membrana transfer edilmek üzere transfer tankına alındı. Transfer işlemi 4 °C’de tüm gece yapıldı. Transfer sonrasında membran 1X yıkama tamponu ile 10 dakika çalkalayıcıda yıkandı. Membran 2 saat boyunca içinde bloklama tamponu bulunan kap içinde çalkalayıcıda bekletildi. Daha sonra membran anti bax (fare monoklonal antikor- 1:500), anti kaspaz-3 (fare monoklonal antikor-1:1000) ve anti bcl-2 (fare monoklonal antikor-1:200) içeren solüsyonlarda bir gece boyunca 4°C’de çalkalayıcıda bekletildi. Membran 3 kez 10’ar dakika 1X yıkama tamponu ile yıkandı. Yıkama sonunda anti β-aktin (fare monoklonal veya tavşan poliklonal antikor-1:1000) ile 1 saat oda sıcaklığında bekletildi. Tekrar 3 kez 10’ar dakika 1X yıkama tamponu ile yıkandı. Kızılötesi boya ile işaretli sekonder antikor ile 1 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta bekletildi. Bloklama ve görüntüleme işlemi Odyssey® Western Blotting Kit II (Li-Cor®., ABD) kullanılarak yapıldı. Membran 6 kez 10’ar dakika 1X yıkama tamponu ile yıkandı. Oda sıcaklığında kurutularak membran üzerindeki proteinlere ait bantlar kızılötesi görüntüleme sisteminde görüntülendi. Dansitometrik hesaplamaların ardından tüm protein bantlarının yoğunluğu
beta-aktin bandının yoğunluğuna oranlanarak gruplar arasındaki istatistiksel farklılıklar hesaplandı.
3.2.9. İstatistiksel Değerlendirme Yöntemi
Sonuçların değerlendirilmesinde SPSS (Statistical Package for Social Sciences) for Windows 18.0 (Illinois, ABD) programı kullanıldı. Tüm örnekler üçer kez çalışıldı ve deney grupları arasındaki istatistiksel farklar Tek Faktörlü Varyans Analizi (One-Way ANOVA) yöntemi ile %95 güven aralığında değerlendirildi; gruplar arasındaki ilişkiler Tukey’s post-hoc yöntemiyle saptandı. Sonuçlar %95 güven aralığında p < 0.05 düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı, p > 0.05 istatistiksel olarak anlamsız olarak değerlendirildi.
3.3. Etik Kurul Onayı
Tez çalışmasının başlangıcında, Ege Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’ndan 2015-010 sayılı ve 25.02.2015 tarihli bir yazıyla söz konusu çalışma için onay alınmıştır.