Tiopürin S-metiltransferaz azatiopürin, 6-merkaptopürin ve tioguaninin metabolizmasında rol oynayan bir enzimdir. Enzim bir metil donörü olarak S- adenozilmetiyonin (SAM) kullanarak sülfür atomlarının metilasyonunu katalizlemektedir. TPMT, tiopürin ilaçlarını (Şekil 2.1) inaktive etmek için bunların S- metilasyonunu katalizleyen ve toksik olmayan metabolitler oluşturan sitoplazmik bir enzimdir (7,8,9,10). TPMT reaksiyonu metil donörü S-adenozil-L-metiyonin (adoMet) ile metil akseptörü olan iki substratı almakta ve S-adenozil-L-homosistein (AdoHcy) ile metillenmiş ürün oluşturmaktadır (Şekil 2.2). Bu enzimin katalizlediği reaksiyon aşağıda gösterilmiştir (29,30).
TPMT
S-adenozil-L-metiyonin + Tiopürin <==> S-adenozil-L-homosistein + Tiopürin S-metileter
Metil akseptörü olarak 6-merkaptopürin ve diğer tiopürinler çok iyi karakterize edilmesine rağmen, bu enzim için bugüne kadar doğal bir substrat tanımlanamamıştır. Pürin analogları olarak dizayn edilen bu ilaçlar, normal nükleotid homeostazda olduğu
34
gibi aynı metabolik yol ile metabolize edilerek normal DNA sentezini bozmak için hedeflenmiştir. Bu ilaçlar, hücrelerde sellüler DNA yapısına giren ve programlanmış hücre ölümünü tetikleyen 6-TGN’lere dönüştürülmektedir. TPMT ile katalizlenen S- metilasyon, tiopürinlerin biyoyararlanımını azaltmaktadır. Bu nedenle TPMT, intrasellüler sitotoksik 6-TGN’lere dönüşümü önlemektedir (7,33).
Şekil 2.1. Klinikte kullanılan Şekil 2.2. TPMT ile S- adenozil-
Tiopürin grubu ilaçların kimyasal yapısı (31). L-homosisteinin kristal yapısı (32).
2.3.1. TPMT’nin Transkripsiyonu
TPMT, tiopürin ilaçların S-metilasyonunu katalizleyerek inaktif ve toksik olmayan metabolitler oluşturan sitoplazmik bir enzimdir. Bu enzim için bugüne kadar doğal bir substrat tanımlanmamasına rağmen, TPMT transkriptleri akciğer, karaciğer, iskelet kasları, böbrek, lenfositler, platelletler, kırmızı ve beyaz kan hücrelerini içeren değişik doku tiplerinde eksprese edilmektedir. TPMT aktivitesi tüm dokularla korelasyon göstermekte olup, kolay elde edilebilmesinden dolayı kırmızı kan hücrelerinde ölçülmektedir (7,8,9,10,33).
2.3.2. TPMT Geni
TPMT geni 6p22.3 kromozomu üzerinde yerleşmiş olup, 9 intron ve 10 ekson tarafından kodlanmaktadır (Şekil 2.3). Bu genin kodladığı protein, 28 kDa moleküler
35
ağırlığında ve 245 amino asitten oluşmuştur. TPMT eksikliği otozomal kodominant kalıtım göstermektedir (7,8,10,33).
2.3.3. Yaygın Mutant TPMT Allelleri
Birçok çalışmada tiopürin ilaçlarının neden olduğu hematopoeitik toksisitesinin majör faktörün TPMT geninde inaktif enzime neden olan tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP) olduğu tanımlanmıştır. TPMT polimorfizmleri terapötik etkinlik ve merkaptopürinlerin toksisitesi ile ilişkilendirilmiştir. Bugüne kadar çalışılmış bütün büyük popülasyonlarda, TPMT aktivitesinin yüksek derecede değişken ve polimorfik olduğu gösterilmiştir. TPMT’nin trimodal kalıtım gösteren üç temel enzim fenotipi (düşük, orta ve yüksek) vardır. Popülasyonun %89’u wild-tip olarak adlandırılan normal/yüksek TPMT aktivitesine sahiptir. Kalan %11 ise TPMT mutant alleli için heterozigotluğu belirten orta enzim aktivitesine, her 300 kişiden 1 kişi TPMT için çift heterozigot veya homozigot olan düşük yada hiç tespit edilemeyen TPMT aktivitesine sahiptir. (11,12,13).
TPMT*1 olarak adlandıran wild-tip dışında 26 farklı mutant TPMT alleli literatürlerde tanımlanmıştır. Bütün bu allellerde TPMT aktivitesi düşük ve/veya homozigotlarda enzim aktivitesi tespit edilmemiştir. Bunlardan dört varyant (TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3B ve TPMT*3C) düşük TPMT aktivitesinin %80- 95’inden sorumludur.
36
Şekil 2.3. Đnsan wild-tip TPMT (TPMT*1) geni ve yaygın mutant TPMT allelleri. Siyah kutular
eksonları, beyaz kutular ise translate edilmeyen bölge dizilimini kodlayan eksonları veya eksonların bir kısmını göstermektedir (9).
Beyaz ırkta, Afrika-Amerikalı ve Asya popülasyonlarında mutant allellerin yaklaşık %90’ı üç mutant allel (TPMT*2, TPMT*3A ve TPMT*3C) oluştururken, diğer mutant alleller sadece birkaç vakada tespit edilmiştir.
Tablo 2.7. Değişik popülasyonlarda TPMT allel sıklığı (46,47,48). Popülasyon Sayı *2 *3A *3B *3C
Amerikan 564 0.2 4.5 TE 0.3 Đngiliz 398 0.5 4.5 TE 0.3 Fransız 938 0.7 3.0 0 0.4 Alman 2428 0.5 8.6 TE 0.8 Polonya 716 0.4 2.7 0 0.1 Đsveç 1600 0.06 3.75 0.13 0.44 Danimarka 400 TE 3.3 0 0.3 Norveç 132 0 3.4 0 0.3 Bulgar 626 0.16 2.24 0 0.16 Đtalyan 206 0.4 3.9 TE 0.9 Afrika-Amerikan 248 0.4 0 TE 2.4 Arjantin 294 0.7 2.1 0 0 Gana 434 0 0 TE 7.6 Kenya 202 0 0 TE 5.4 Çin 384 0 0 TE 2.3 Japon 1044 0 0 0 1.6 Tayvan 498 0 0 0 0.6 Tayland 400 0 0 0 4.75 Güneybatı Asya 198 0 1.0 TE 0 Güneydoğu Asya 1098 0 0 TE 1.0 Brezilya 408 2.2 1.5 0.2 1.0 Kolombiya 280 0.4 3.6 0 0 Mısır 400 0 0.003 0 0.013 Malezya 200 0 0 TE 1.3 Hindistan 200 0 0.5 TE 0.8 Yeni Zelanda 100 0 5.0 TE 0 Endonezya 200 0 0 0 1.0 Filipin 200 0.5 0 0 1.0
37
Beyaz ırkta enzim aktivitesini azaltan en yaygın polimorfizmin TPMT*3A olduğu belirlenmiştir. TPMT*3A, beyaz ırkta %5 olarak tespit edilmiştir. TPMT*3C ise en yaygın olarak Afrika ve Asya popülasyonlarında bulunmakta ve düşük enzim aktivitesine neden olmaktadır. Asya ülkelerinde enzim eksikliğinin çok az olduğu tespit edilmiştir. Batı Asya’da, popülasyonunda baskın olarak TPMT*3A görülmüştür. Doğu Asya’da ise TPMT*3C baskındır (9,12,13,46,47,48).(Tablo 2.7).
TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3B ve TPMT*3C genotipinin tespit edilmesi durumunda TPMT aktivitesi tahmin edilebilir; tüm dört allelin heterozigot formu hastada orta aktiviteye, bu allellerin homozigot formunda ise hastada TPMT aktivitesi gözlenmez. Ek olarak, çift heterozigotlarda da (TPMT*2/3A, TPMT*2/3C, TPMT*3A/3C) hiç TPMT aktivitesi gözlenmemektedir.
Yapılmış olan birçok çalışmada TPMT eksikliği olan hastalarda tiopürinlerin konvansiyonel dozajı ile tedavi edilirse, ağır hematopoeitik toksisite gelişme riskinin çok yüksek olduğu bulunmuştur. TPMT lokusu heterozigot olan hastalarda da orta düzeyde toksisite riskinin olduğu gösterilmiştir. Buna zıt olarak enzim aktivitesi çok yüksek olan hastalarda, bu ilaçların standart dozu ile tedavilerinde yanıt alınmayabilir (7,33,34).
2.3.3.1. TPMT*2
TPMT*2 allelinde 80. rezidüde bulunan alanin prolin ile yer değiştirmiştir (Tablo 2.8). Bunun sonucunda TPMT aktivitesi yaklaşık 100 kat azalmakta ve çok düşük immünolojik protein düzeyine neden olmaktadır. TPMT*2 proteinin yarı ömrü 0.35 saate sahiptir ve ubikuitin yolu ile proteozomlarda degrade edilmektedir (35,36).
2.3.3.2. TPMT*3B
A154T (154. rezidüde bulunan alanin treonin ile yer değiştirmiştir) polimorfizmi (Tablo 2.8), wild-tip TMPT ile karşılaştırıldığında immünolojik protein düzeyinde azalmaya neden olmaktadır ve proteinin 24 saatten fazla olan yarı ömrünü 5.5 saate düşürmektedir. Bu da protein düzeyinin dört kat azalması ile sonuçlanmaktadır (35).
38 2.3.3.3. TPMT*3C
TPMT*3C allelinde (Y240C) 240. rezidüde bulunan tirozin sistein ile yer değiştirmiştir (Tablo 2.8). TPMT*3C, wild-tip proteinine göre immünolojik proteinin ve enzim aktivitesinin düzeyi daha düşük olarak saptanmıştır (35).
2.3.3.4. TPMT*3A
TPMT*3A alleli, A154T ve Y240C polimorfizmlerinin her ikisini bulundurmaktadır (Tablo 2.8). Bu allelde, protein düzeyinin ~400 kat azalmasına ve ölçülemeyecek enzim aktivitesine neden olmaktadır. TPMT*3A, wild-tip proteinden yaklaşık 72 kat daha az olan ~0.67 saat yarı ömrü ile hızlıca ubikuitin yoluyla proteozomal olarak degrade olmaktadır (35).
Tablo 2.8. Tiopürin S-Metiltransferaz Allelleri
TPMT Aleli Gen Mutasyonu Aminoasit Değişimi Aktivite (%) *1 Wild tip 100 *2 G238C Ala80→Pro 26 *3A G460A A719G Ala154→Thr Tyr240→Cys 1.6 *3B G460A Ala154→Thr 1.7 *3C A719G Tyr240→Cys 17 *3D G460A A719G G292T Ala154→Thr Tyr240→Cys Glu98stop *5 T146C Leu49→Ser 2.4 *6 A539T Exon 8’de transversiyon Tyr180→Phe 36 *7 T681G Exon 10’da transversiyon His227→Glu 98 *8 G644A Arg215→His 82 *10 G430C Gly144→arg 69 *11 G395A C132→Y 36 *12 C374T Ser125→Leu 41 *13 A83T Glu28→Val 61 *16 G488A Arg163→His *19 A365C Lys122→Thr
39 2.3.4. TPMT genotip-fenotip ilişkisi
TPMT genotipleri ve enzim aktivitesi/fenotipi arasındaki korelasyon, yapılan birçok çalışmada gösterilmiştir. En yaygın mutant allellerin TPMT aktivitesinin hem in vivo hem de in vitro karakterizasyonunda varyant proteinlerin proteolizini artırdığı ve bu nedenle enzimatik aktivitenin azaldığı gösterilmiştir. Farklı popülasyonlarda yapılan birçok çalışmada TPMT enzim aktivitesi ve genotipi arasında %98’in üzerinde bir ilişki olduğu gösterilmiştir. Genotipe bakılarak TPMT fenotipi %90 sensitivite ve %95 spesifite ile belirlenebilmektedir.
TPMT genotipi ve aktivitesi, miyelotoksisite ile korelasyon göstermektedir. Farklı hasta popülasyonu arasında yapılan birçok çalışmada, tiopürinlerin indüklediği toksisite hastalarda, TPMT genotiplerinin çarpık dağılım gösterdiği bulunmuştur. Tiopürin ilaçların toksisite mekanizması ilaç metabolitleri olan TGN’ler, DNA ve RNA’nın yapısına katılmaktadır. Birçok çalışmada yüksek TGN konsantrasyonu enzim aktivitesi düşük olan mutant TPMT allelleri arasında ilişki olduğu gösterilmiştir. Bu veriler, doktorların bu ilaçları reçete etmeden önce TPMT genotip veya enzim fenotipine bakarak, ilaçların yan etki oluşma ihtimalini belirleyebileceklerini sağlamaktadır (7,8,11,37).
2.4. TĐOPÜRĐN METABOLĐZMASI
Tiopürinler, merkaptopürin, tioguanin ve azatiopürinden oluşan bir ilaç grubudur. Tiopürin ilaçlar romatolojik, otoimmün hastalıklarda, organ transplantasyonunu takiben immünosüpresif, lösemi tedavisinde kemoterapötik ajan olarak kullanılmaktadır. Bu ilaçların sitotoksik etki mekanizmaları, TGN’lerin DNA’nın yapısına katılmasıdır. Bu nedenle tiopürinler inaktif prodrug olup, sitotoksik olan TGN’ye metabolize edilmesi gerekir (Şekil 2.4). Bu aktivasyon multiple enzim tarafından katalizlenmektedir. Đlk basamaktaki reaksiyon, hipoksantin guanin fosforibozil transferaz (HGPRT) tarafından katalizlenmektedir. Alternatif olarak bu ilaçlar, ksantin oksidaz (XO) ile oksidasyonu veya TPMT ile metilasyonu sonucunda inaktive edilebilmektedir (7,8,38).
40
Şekil 2.4. 6-MP’nin aktif metabolitleri olan TGN’ye HGPRT tarafından dönüştürülmesi. TGN’ler
DNA yapısına girerek miyelotoksisite ve antikanser etkisini göstermektedir. 6-MP, TPMT’nin metilasyonu ile 6-MeMP metabolitini oluşturarak inaktive edilmektedir. XO ile oksidasyonu uğrayarak inaktivasyon olabilmektedir (39).
TPMT, azatiopürin, merkaptopürin ve tioguanin gibi tiopürin ilaçların S- metilasyonunu katalizlemesinden dolayı bu ilaçların TGN formasyonundan kaçırmaktadır. Bu ilaçların tam etki mekanizması bilinmemektedir. Bununla birlikte, TGN’lerin etki mekanizması DNA-RNA sentezi ve kromozomal replikasyon ile birleşmesini, T ve B hücre profilerasyonunu inhibe etmesi ve natural-killer hücre sitotoksisitesini içermektedir.
2.4.1. Merkaptopürin, Tioguanin ve Azatiopürinin Etki Mekanizması
6-Merkaptopürin: 6-Merkaptopürin, ribonükleotide dönüştürülerek pürin sentezini inhibe eden pürin analoğudur. 6-Merkaptopürin, akut lenfoblastik lösemili hastaların idame tedavisinde kullanılmaktadır. Merkaptopürin zayıf absorbe edilir. Oral dozunun absorpsiyonu tam olmayıp değişkendir ve uygulanan dozun ortalama %50'si kadardır. Oral doz alındıktan 1-2 saat sonra konsantrasyonu pik yapmaktadır. 6- merkaptopürinin dolaşımdaki yarılanma süresi 90 dakikadır. Büyük ölçüde metabolize edilir ve böbrekler yoluyla itrah edilir. Aktif metabolitlerinin yarılanma süreleri ana ilaca göre daha uzundur. 6-merkaptopürin tedavisinin başlıca yan etkisi, lökopeni ve
trombositopeniye yol açan kemik iliği supresyonudur. Hepatotoksisiteye neden olabilmektedir. Đnsanlardaki histolojik bulgularda hepatik nekroz ve biliyer staz görülmüştür. Hepatotoksisite insidansı çok değişkendir ve herhangi bir dozda meydana
41
gelebilir Merkaptopürin tedavisi yeterince erken durdurulursa yan etkiler genellikle reversibldir. Diğer yan etkileri hafif bulantı, anoreksi, deri döküntüsü ve ciltte kızarıklıktır. Allopurinol 6-merkaptopürinin katabolizma hızını azalttığından, birlikte uygulandıklarında, 6-merkaptopürinin normal dozunun sadece dörtte birinin verilmesi şarttır. Erişkinler ve çocuklarda normal günlük doz 2.5 mg/kg'dır. Ancak, uygulamanın dozu ve süresi 6-Merkaptopürin ile birlikte verilen diğer sitotoksik ilaçların türleri ve dozlarına bağımlıdır. Doz her hastaya özel şekilde, dikkatle ayarlanmalıdır (39,40).
Azatiopürin: Azatiopürin, glutatyon gibi nükleofillere maruz kalmasından sonra merkaptopürini oluşturmakta ve de novo pürin sentezini inhibe eden metabolitlere dönüştürülmektedir. Yalancı bir nükleotid olan 6-tio-IMP, 6-tio-GMP’ye dönüştürülmekte ve sonuçta 6-tio-GMP DNA yapısına girmektedir. Böylece lenfositlerin fonksiyonlarını bozarak hücre proliferasyonu inhibe etmektedir. Azatiopürin, 6- merkaptopürinden daha kuvvetli bir immünsüpresan olduğu görülmektedir. Azatiopürinin majör yan etkisi lökopeni (yaygın), trombositopeni (daha az yaygın) ve/veya anemiyi (nadir) kapsayan kemik iliği süpresyonudur. Diğer önemli yan etkileri ise enfeksiyonlara karşı hassasiyet (özellikle suçiçeği ve HSV), hepatotoksisite, pankreatit ve artmış neoplazi riskini içermektedir. Azatiopürin katabolizmasında bir anahtar enzim olan XO, allopürinol ile bloke olmaktadır. Azatiopürin ve allopürinol eşzamanlı kullanılırsa, azatiopürin dozu kullanılan dozun %25-30’u kadar azaltılmalıdır; en iyi koşul ise bu iki ilacın birlikte kullanılmamasıdır (39,40).
6-Tioguanin: 6-Tioguanin, 6-merkaptopürine benzer işlenen diğer bir pürin analoğudur ve bundan dolayı çapraz rezistans gözlenir. Tioguaninin farmakokinetiği hakkında bilinenler çok az iken, dozun yaklaşık %30’u absorbse olduğu görülmektedir. Yan etkileri miyelosupresyon, hafif bulantı, kolestaz ve nadir olarak veno-oklüzif hastalıktır (40).
Azatiopürin ve merkaptopürin orta düzeyde plazma proteinlerine bağlanmaktadır ve kısmi olarak zardan geçebilmektedir. Her ikisi karaciğerde ve/veya eritrositlerde metilasyon veya oksidasyon ile hızlıca kandan uzaklaştırılmaktadır. Renal klerens, biyolojik etkinliliğini veya toksisitesini az etkilemektedir. Renal bozukluğu olan hastalarda doz azaltılmalıdır.
42 Merkaptopürinin üç metabolik yolu vardır: 1. XO tarafından 6-tioürik asite dönüştürülür
2. TPMT ile 6-metil-merkaptopürine metabolize edilir.
3. HGPRT ile 6-TGN’lere ve diğer metabolitlere dönüştürülür (Şekil 2.5).
Şekil 2.5. 6-merkaptopürin ve azatiopürin metabolizması. Đnaktif metabolitlerin veya
hepatotoksik veya miyelotoksik metabolitlerin oluşumunda rol oynayan enzimatik yol komponenetleri (TPMT, Tiopürin Smetiltransferaz; XO, ksantin oksidaz; HGPRT, hipoksantin
43
guanin fosforiboziltransferaz; IMPDH, inozinmonofosfat dehidrogenaz, GMPS, Guanin monofosfat sentaz) (41).
Azatiopürin absorbsiyondan sonra aktif ilacı olan 6-merkaptopürine dönüşen bir prodrugdır. Bunlar DNA ve RNA yapısına girerek sitotoksisite gelişiminde majör rol oynamaktadır. Đlk enzim olan XO, tioürik asit formasyonunu oluşturmaktadır. Bu 6- merkaptopürinin inaktivasyonunda önemli rol oynamaktadır ve XO inhibitörü olan allopürinol ile belirgin bir şekilde azatiopürin toksisite riskini artırmaktadır. Bununla birlikte XO düzeyi bireyler arasında önemli farklılıklar göstermemektedir. 6- Merkaptopürin klerensinde rol oynayan ikinci enzim TPMT’dir. TPMT metil merkaptopürin formasyonu oluşturarak 6-merkaptopürinleri inaktive etmektedir. Bu farklı yolakların aktiviteleri, etkinliği ve bunların immünosupresif yan etkileri kısmi olarak bireysel varyasyonlarla açıklanabilir (7,39,40).
Merkaptopürinin plazma yarılanma ömrü (t1/2) eritrosit ve diğer dokularda alınımı (1–2 saatte) rölatif olarak hızlıdır. Bu dokulara alınımını takiben TPMT aktivitesindeki farklılık, bu ilacın yolağını belirlemektedir. TPMT aktivitesi düşük olan bireylerin merkaptopürin metabolizmasında, 6-metilmerkaptopürin oluşumundan kaçınılarak ağır kemik iliğini suprese edebilen 6-TGN’leri oluşturmaktadır. TPMT aktivitesi orta düzeydeki bireylere standart doz verildiği zaman, normal metabolize eden bireylere göre daha yüksek 6-TGN düzeyine sahip olma eğilimindedirler. Yüksek TPMT aktivitesine sahip bireyler merkaptopürini 6-TGN’lerinden çok 6-metilmerkaptopürine dönüştürmektedir.
2.4.2. Toksisite
6-Merkaptopürin, 6-tioguanin ve azatiopürinin toksisite doz sınırı tedaviye başlandıktan 1–4 hafta sonra miyelosupresyon oluşmakta ve ilaçlara devam edilmezse reversible olabilmektedir. Hepatotoksisite, 6-merkaptopürin alan hastaların bir kısmında görülebilir. Transaminazların yüksek düzeyine rağmen kolestatik tipte sarılık görüntüsü reversible ve genellikle hafiftir. Hepatik nekroz ve venooklüzif hastalık gelişebilir. 6- Merkaptopürin ve azatiopürin potansiyel olarak teratojeniktir (42).
44 2.4.3. Tedavi
Merkaptopürin toksisitesi ile TPMT enzim aktivitesi arasında korelasyon göstermesinden dolayı, tiopürin ilaçları reçete edilmeden önce TPMT genotip veya fenotip tayinini istenmelidir. Đki fonksiyonel olmayan TPMT allelini (çift heterozigot) taşıyan hastalar tiopürinlerin standart dozun %5-15’i, bir mutant alleli olan heterozigotlara ise başlangıç olarak dozun %50-70’ini alarak TGN birikimi ve hematotoksisitesi azaltılabilir. Lösemili hastalarda tiopürinlerin doz yoğunluğu ile de ilişki vardır; düşük veya orta düzey TPMT aktivitesi olan hastalar tespit edildikten sonra, TPMT wild-tip hastalarına daha uzun yaşam süresi ve tedaviye erken yanıt almak için yüksek doz verilmelidir. Hastalara tiopürin ilaçları verildiği zaman toksisite riskini azaltmak için laboratuar bulgularıyla kontrol edilmesi gereklidir. Tedavinin başlangıcında, 4 hafta boyunca haftada bir veya iki, tedavinin geri kalan zamanında ise aylık tam kan takibi yapılması önerilmektedir. TPMT durumunun bilinmesi ile hastaların takibi daha kolay, tedavisi daha uygun ve daha az maliyette olmaktadır. Bu nedenle tedaviden önce TPMT mutasyon varlığının tespit edilmesi hastane masraflarını daha düşük tutmakla birlikte, ölüm ve toksisite oranını da azaltabilir. Kişisel ilaç tedavisi TPMT vakalarında olduğu gibi daha ekonomik ve daha etkili hasta tedavisi ile sonuçlanabilir (35,41) .
45
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Örnek Toplama
Temmuz 2007-Temmuz 2010 tarihleri arasında, Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk ve Erişkin Hematoloji Bilim Dalı’nda ALL tanısı konan ve idame tedavisine devam eden 22’si erişkin ve 33’ü çocuk, toplam 55 hasta çalışma kapsamına alındı. Her hastalardan EDTA’lı tüplere birer kan örneği alındı ve DNA’ları izole edildi. Kan örneği alınan tüm hastalar bilgilendirilerek Hasta Onay Formu kağıdı imzalatıldı.
Hastalarımızda yaş, cinsiyet, doğum yeri, lökosit, hemoglobin, hematokrit, trombosit değerleri, biyokimyasal parametreleri, FAB sınıflaması, immünofenotip, translokasyonları, tedavi protokolü ve aşaması, kullanılan 6-merkaptopürin dozu ve doz değişimi incelendi.
Tüm hastalardan anemnez alınıp fizik muayeneleri yapıldı. Eski tanılı hastaların dosyalarına arşivden ulaşıldı. Tüm hastaların tanılarının teyid edilmesi amacıyla ilk ve son tam kan ve biyokimya değerleri, periferik yayma, daha önceden yapılan kemik iliği aspirasyon örneği, immünofenotiplendirme, boyanma özellikleri ve translokasyonlar ve aldığı tedavi protokolleri incelendi.
Tüm hastalar için, Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Laboratuvarı’nda TPMT gen mutasyonu tayini amacıyla, TPMT*2, TPMT*3B ve TPMT*3C polimorfizmleri Real Time PCR yöntemiyle bakıldı.
3.2. YÖNTEMLER
3.2.1. DNA Đzolasyonu: EDTA’lı tüplere alınan kan örneği, Roche-Magna Pure Compact otomatik DNA izolasyon cihazında hazır izolasyon kiti ile DNA izolasyonu yapıldı.
3.2.2. Real Time PCR Aşaması: PCR miskinin hazırlanması: 1. H2O 3,4 µL
2. MgCl2 1,6 µL 3. F Primer 2 µL 4. R Primer 2 µL
46 5. FL prob 2 µL
6. LC prob 2 µL 7. M mix 2 µL
Toplam 15 µL
15 µL miks , kapiller tüpe alındı ve üzerine daha önceden elde edilen DNA solüsyonu eklendi. Master miks ve DNA karışımının kapiller tüpün dibine çökmesi için santrifüj işlemi yapıldı. Örnekler Light Cycler 2.0 cihazında yürütülerek sonuçlar değerlendirildi.
47 4. BULGULAR
Bu çalışma, Temmuz 2007 - Temmuz 2010 tarihleri arasında Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk ve Erişkin Hematoloji Bilim Dalında Akut Lenfoblastik Lösemi tanısı konan ve tedaviye devam eden 55 hastanın bulgularını içermektedir. Hastaların hepsi, ALL’nin idame tedavisinde kullanılan ilaçlardan biri olan 6-merkaptopürini almaktaydı.
Çalışmaya 22’si erişkin (%40), 33’ü çocuk (%60) olmak üzere toplamda 55 hasta alındı. Erişkin hastaların 9’u kadın (%40,9), 13’ü erkek (%59,0) hastaydı. Çocuk hastaların 14’ü kız (%42,4), 19’u erkekti (%57,5).
Çocuk hastaların yaşları 2 ile 14 arasındaydı ve ortanca yaş 6 idi. Erişkin hastaların yaşları 16 ile 78 arasındaydı ve ortanca yaş 28 idi.
Çocuk hastaların 17’si Diyarbakır (%51,5), 7’si Batman (%21,2), 7’si Mardin (%21,2), 2’si Şanlıurfa (%6,0) doğumluydu. Yetişkin hastaların 14’ü Diyarbakır (%63,6), 3’ü Mardin (%13,6), 1’i Batman (%4,5), 1’i Bitlis (%4,5), 1’i Siirt (%4,5), 1’i Şanlıurfa (%4,5), 1’i Tunceli (%4,5) doğumluydu.
Mesleklerine yönelik incelemede; çocuk hastaların 19’u öğrenci (%57,5), 14’ü okul öncesi dönemdeydi (%42,4). Erişkinlerin hastaların 9’u ev hanımı (%40,9), 4’ü öğrenci (%18,1), 4’ü işsiz (%18,1), 3’ü işçi (%13,6), 2’si esnaftı (%9,0).
Bu analiz sonucunda; erişkin ve çocuk hastaların tümünde TPMT *2 geni heterozigot ve homozigot olarak negatif bulundu. Hastaların 2’sinde TPMT*3B geni heterozigot olarak saptandı (%3,6). TPMT*3B homozigot mutant bireylere rastlanmadı. TPMT*3B heterozigot olarak saptanan hastaların biri erişkin, diğeri çocuk hastaydı. Hastaların 2’sinde TPMT*3B ve TPMT*3C çift heterozigot olarak saptandı (%3.6). Bunların ikiside çocuk hastaydı. Analiz edilen genler arasında hem çocuk hemde yetişkin hastalarda homozigot mutant bireylere rastlanmadı (Tablo 2.9).
Hastaların tümü idame kemoterapi protokollerinde yer alan 6-merkaptopürini kullanmaktaydı. Erişkin hastaların 5’inde tedavi seyrinde 6-merkaptopürinin sık görülen hematolojik yan etkisi olan lökopeni gelişmişti (%22,7). Bu hastaların 4’ünde TPMT polimorfizmleri saptanmadı. Bu hastalarda orta derecede hematolojik toksisite gelişmiş ve 6-merkaptopürin dozu lökopeni nedeniyle %25 oranında azaltılmıştı. Diğer 1 erişkin hastada TPMT*3B heterozigottu ve diğer erişkinlere göre daha yüksek derecede
48
hematolojik toksisite gelişmişti. 6-merkaptopürin dozu lökopeni nedeniyle %50 oranında azaltılmıştı ve bir kez enfeksiyon nedeniyle tedavisine ara verilmişti. Geriye kalan 17 erişkin hastada TPMT polimorfizimlerine ve toksisite bulgularına rastlanmadı. Tedaviye devam eden çocuk hastaların 30’unda lökopeni saptandı (%90,9). Yine bunlardan TPMT*3B ve TPMT*3C çift heterozigot olan 2 çocuk hastada yüksek derecede hematolojik toksisite gelişmişti. Lökopeni ve enfeksiyon nedeniyle zaman zaman tedavileri kesilmiş olarak saptandı. Bu 2 çocuk hastanın eski dosya bilgilerine bakıldığında enfeksiyon ve eşlik eden lökopeni nedeniyle hastande yatarak tedavi gördüklerine dair verileri mevcuttu. TPMT*3B heterozigot olan 1 çocuk hastada da lökopeni ve enfeksiyon nedeniyle tedaviye ara verildiği görüldü. Diğer 27 çocuk hastada TPMT polimorfizmleri saptanmamış olup, orta derece hematolojik toksisite bulguları ile prezente olmuştu ve lökopeni nedeniyle %25 ile 50 oranında doz azaltımı yapılmıştı. Geriye kalan 3 çocuk hastada da TPMT polimorfizmleri ve toksisite bulguları görülmedi. Doz azaltımından yada tedavinin kesilmesinden sonraki periyotta tüm hastaların yapılan tam kan tetkiklerinde lökopenide düzelme olduğu saptandı. TPMT mutant alelleri bulunmayan 5 çocuk hastada da hepatotoksisite bulgularına rastlandı (%9,0).
Tablo 2.9. ALL’li hastalar ve saptanan TPMT gen mutasyonları
TPMT gen mutasyonu Erişkin Çocuk
TPMT*2 (heterozigot) (-) (-) TPMT*2 (homozigot) (-) (-) TPMT*3B (heterozigot) 1 1 TPMT*3B (homozigot) (-) (-) TPMT*3C heterozigot) (-) (-) TPMT*3C homozigot) (-) (-) TPMT*2 ve 3B (Çift heterozigot) (-) (-) TPMT*2 ve 3C (Çift heterozigot) (-) (-) TPMT*3B ve 3C (Çift heterozigot) (-) 2
49
5.TARTIŞMA VE SONUÇ
Akut lenfoblastik lösemi (ALL), kemik iliğindeki lenfoid öncü hücrelerin olgunlaşma sürecini tamamlayamaması ve klonal olarak kontrolsüz çoğalması ile karakterize neoplastik bir hastalıktır. Farklılaşmadaki duraklama sonucu sıklıkla normal fonksiyonunu yapamayan immatür görünümlü lösemik hücreler başta kemik iliği ve periferik dolaşım olmak üzere retiküloendotelyal sistem, merkezi sinir sistemi ve diğer vücut bölgelerinde birikir. Kemik iliğinin kontrolsüz çoğalan lösemik hücrelerle infiltre olması anemi, trombositopeni ve nötropeniye neden olur (14,62).
Akut lenfoblastik lösemilerde tedavi supportif bakım, kemoterapi, kemik iliği nakli gibi tedavi yaklaşımlarından oluşmaktadır. Kemoterapi esas olarak üç aşamadan oluşmaktadır (remisyon indüksiyon, konsolidasyon ve idame tedavileri). Đdame tedavisi konsolidasyonu takiben hastalığın nüks etmesini yani rezidü blastların öldürülmesi, normal kemik iliği hematopoetik progenitörlerin korunması amacı ile uygulanır. Đdame tedavisi süresi 2-3 yıl devam etmektedir ve bu süreçte kullanılan önemli ilaçlardan biride 6-merkaptopürindir (4,5,6).
Çocukluk çağı ALL tedavisinde, vakaların üçte ikisi tedaviye olumlu yanıt vermektedir. Erişkin ALL’lerde ise sonuçlar aynı derecede olumlu olmayıp, vakaların