Türkiye Selçukluları Döneminde Sille

Câncer de mama é o segundo tipo de câncer com maior incendência no mundo (cerca de 1 milhão de casos/ano), sendo superado apenas pelo câncer de pulmão (1,2 milhões/ano), e é o com maior ocorrência entre as mulheres (WHO..., 2007). Do total de casos de câncer de mama, 580.000 casos são detectados em países desenvolvidos e o restante em países em desenvolvimento (WHO..., 2007). Em 2000, cerca de 400.000 mulheres morreram em decorrência deste tipo câncer, representando 1,6% de todos os óbitos femininos, por causa conhecida, no mundo. A proporção é maior em países desenvolvidos, abrangendo 2% do total de óbitos femininos (WHO..., 2007).

No Brasil, estimou-se, para o ano de 2006, 48.930 novos casos de câncer de mama, perfazendo 10,4% do total de novos casos de câncer, e 20,6% do novos casos de câncer em mulheres (BRASIL, 2005). A maior incidência deste tipo de câncer ocorre nas regiões sul e sudeste, seguindo o mesmo perfil de incidência da doença apresentada pelos países desenvolvidos (BRASIL, 2005).

O câncer de mama se inicia na camada de células epiteliais, na unidade terminal do duto lobular, e seu desenvolvimento está associado a mudanças progressivas moleculares e celulares (LITHGOW; COVINGTON, 2005). Evidências epidemiológicas e experimentais suportam o papel de substâncias estrogênicas (estrona e estradiol) no desenvolvimento e no crescimento de câncer de mama hormônio-dependente (KELLOFF et al., 1998; RECANATINI et al., 2002; SMITH; DOWSETT, 2003; LITHGOW; COVINGTON, 2005). A supressão ou redução da expressão de substâncias estrogênicas são estratégias largamente empregadas no tratamento de tumores hormônio-dependente, que podem ser alcançadas com a inibição da enzima aromatase (EC 1.14.14.1, CYP19) (KELLOFF et al., 1998; RECANATINI et al., 2002).

O complexo aromatase, localizado no retículo endoplasmático, é formado por duas proteínas, a aromatase e a NADPH-citocromo P450 redutase (EC 1.6.2.4, POR). A aromatase, um membro da superfamília das enzimas citocromo P450, é responsável pela

conversão de androgênios em estrogênios (reação de aromatização, Figura 10), enquanto, POR é uma flavoproteína essencial para a transferência de elétrons do NADPH para a aromatase (RECANATINI et al., 2002; ENTREZ..., 2007). Esse complexo apresenta alto grau de expressão na placenta, em células granulosas dos folículos ovarianos, em glândulas mamárias normais e no câncer de mama, sendo sua expressão dependente da estimulação cíclica de gonotrofina. A aromatase está presente, em concentrações reduzidas, em vários tecidos não glandulares como hipoderme, fígado, músculos e cérebro (WAGNER; MORREL, 1996; SMITH; DOWSETT, 2003).

A inibição seletiva da aromatase constitui um alvo relevante na busca de agentes quimiopreventivos contra câncer hormônio-dependente (WAGNER; MORREL, 1996; SMITH; DOWSETT, 2003; PEZZUTO et al., 2005; KENDALL; DOWSETT, 2006). Diversos métodos para quantificar a atividade inibitória deste alvo foram desenvolvidos. Entre estes, dois são amplamente empregados (THOMPSON; SIITERI, 1974; RABE et al., 1982; JEONG et al., 1999; STRESSER et al., 2000; EDMUNDS et al., 2005). No primeiro, a atividade da aromatase é determinada pela quantificação do óxido de tritio (água radioativa) liberado durante a conversão da [1β-3H]-androst-4-ene-3,17-diona em estrona pela aromatase (RABE et al., 1982). Já no segundo, pela detecção de fluoresceína (91) como produto de hidrólise da dibenzilfluoresceína (92, DBF) pela enzima (STRESSER et al., 2000). Este útlimo método viabiliza a análise de maior número de amostras, devido ao menor tempo de ensaio (4 horas versus 4 dias) (Figura 11) (STRESSER et al., 2000).

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Figura 10. Representação simplificada da etapa final, da

biossíntese de substâncias estrogênicas catalizada pela enzima

aromatase. 17βHSD = 17-β-hidroxi-esteróide-desidrogenase.

17KSR = 17-cetoesteróide redutase. Modificado de Kellof et al. (1999) e Recanatini et al. (2002).

Empregando-se o método validado por Stresser et al. (2000), Pezzuto et al. (2005) avaliaram 1.273 extratos de plantas, sendo apenas 30 amostras consideradas ativas. Essas amostras estão em processo de fracionamento biomonitorado, visando isolar as substâncias responsáveis pela atividade (PEZZUTO et al., 2005).

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Figura 11. Fundamento químico do método fluorimétrico desenvolvido por Stresser et al. (2000) para

avaliação in vitro da atividade inibitória da aromatase.

Stresser et al. (2000) avaliaram várias substâncias, cuja atividade inibitória da aromatase havia sido previamente descrita, porém empregando diferentes métodos. Os flavonóides α-naftoflavona (CI50 = 0,18 µM, 93), crisina (CI50 = 0,70 µM, 94) e (±)-

naringenina (CI50 = 1,54 µM, 95) foram ativos no ensaio fluorimétrico de inibição da CYP19,

apresentando valores de CI50 próximos aos obtidos nos ensaios realizados de detecção do

óxido de trítio (STRESSER et al., 2000).

O fracionamento do extrato em acetato de etila de Broussonetia papyrifera, biomonitorado por ensaio in vitro de inibição da aromatase, baseado na detecção de óxido de trítio, levou ao isolamento de 15 substâncias ativas, com valores de CI50 na faixa entre

0,1 e 31,1 µM (LEE et al., 2001b). Quatro substâncias apresentaram maior atividade: isolicoflavanol (CI50 = 0,1 µM, 96), (2S)-2’,4’-diidroxi-2’’-(1-hidroxi-1-metiletil)-diidrofuro–[2,3]-

flavanona (CI50 = 0,1 µM, 97), (2S)-abissinona II (CI50 = 0,4 µM, 98) e 11’-O-cumarato de 3’-

[γ-hidroximetil-(E)-γ-metilalil]-2,4,2’,4’-tetrahidroxichalcona (CI50 = 0,5 µM, 99) (LEE et al.,

2001b). 98 e 23 derivados deste foram avaliados no ensaio fluorimétrico de inibição da aromatase. Sete derivados foram ativos, com valores de CI50 entre 1,9 e 7,7 µM, enquanto

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A toxicidade apresentada por alguns fármacos é uma das razões frequentes para a retirada destes do arsenal terapêutico (XU et al., 2004; KIM et al., 2006). Paradoxalmente, na busca por agente quimiopreventivos de câncer, algumas amostras podem ser selecionadas para estudo a partir da sua atividade citotóxica ou anti-proliferativa (XU et al., 2004; KIM et al., 2006). A atividade citotóxica pode estar relacionada à inibição ou à indução de um alvo molecular específico, uma vez que a toxicidade depende de uma variedade de interações físicas e químicas no sítio de ação (BRADBURY, 1994). Em ensaios in vitro de avaliação da atividade citotóxica, são consideradas ativas as amostras que inibem o crescimento celular, com valor de inibição igual ou inferior a 50% (XU et al., 2004).

Por outro lado, muitos agentes antitumorais em avançado estágio de ensaios clínicos, os quais não foram selecionados a partir de uma triagem inicial de citotoxicidade, são reprovados por apresentaram elevados efeitos tóxicos e ausência de eficácia na dose tolerada (JOHNSON, 1990). Dessa forma, o ensaio de citotoxicidade pode ser empregado como um screening secundário, visando avaliar se a amostra, ativa nos ensaios de inibição ou de indução de determinados alvos moleculares, apresentam uma atividade anti- proliferática inespecífica (JOHNSON, 1990). Nesses casos, são considerados citotóxicas as

amostras que inibirem a proliferação celular em mais de 10%, ou seja o percentual de células viáveis, após contato de 72h com as amostras, deve ser de no mínimo 90% (CUENDET et al., 2006).

O ensaio de citotoxicidade, ou anti-proliferativo, mais empregado baseia-se na habilidade da sulforodamina B (SRB) de se ligar eletrostaticamente aos resíduos de aminoácidos básicos das proteínas, após a fixação com ácido tricloroacético (TCA) (RUBINSTEIN et al., 1990; SKEHAN et al., 1990). A absorbância é determinada no comprimento de onda 515 nm (RUBINSTEIN et al., 1990; SKEHAN et al., 1990). Esse ensaio é sensível e de baixo custo (RUBINSTEIN et al., 1990; SKEHAN et al., 1990).

As linhagens tumorais mais comumente empregadas são LU-1 (câncer de pulmão humano), SW626 (células de câncer de ovário humano), LNCaP (câncer de próstata humano hormônio-dependente), KB (carcinoma oral epidermóide humano), HOS (osteosarcoma humano), ZR-75-1 (câncer de mama humano hormônio-dependente), MCF-7 (câncer de mama humano hormônio-dependente), BC1 (câncer de mama humano) e Col2 (câncer de cólon humano) (HORGEN et al., 1997; ZHANG et al., 2002; KIM et al., 2006).