Sille’nin Osmanlı Hakimiyetine Girmesi

Os ensaios foram realizados utilizando o método descrito por Serra et al. (2005), com modificações.

3.10.1 Soluções empregadas no ensaio de inibição da ECA

3.10.1.1 Solução de pulmão de coelho

Misturou-se 1,0 g de pulmão de coelho pulverizado, desidratado por acetona, à 5 mL de solução de tampão fosfato pH 8,3 (50 mM), em um frasco de centrifugação. A mistura foi centrifugada a 3.000g, por 40 min, à temperatura ambiente. O sobrenadante, de coloração vermelho clara, foi retirado e transferido para outro frasco de centrifugação, sendo centrifugado a 8.460g, por 10 min. Alíquotas do sobrenadande (500 µL) foram, então, distribuídas para frascos plásticos e armazenados a 4 °C por, no máximo, 3 meses. Essa solução corresponde à solução estoque, com concentração de 0,2 g/mL. No momento da realização do ensaio, a solução estoque foi diluída para a concentração de 0,1 g/mL, tranferindo-se, para balão volumétrico de 1 mL, 500 µL da solução estoque, completando-se o volume com tampão fosfato pH 8,3, sendo mantida sob resfriamento até o momento do uso.

3.10.1.2 Solução de hipuril-glicil-glicina (Hip-Gly-Gly) 100 mM

Solubilizaram-se 146,65 mg de Hip-Gly-Gly, sob resfriamento, em balão volumétrico de 5 mL, com 1,25 mL de NH4OH 1 M, completando-se o volume com água Milli-Q. Essa

solução foi distribuída em frascos contendo 2,5 mL cada, e armazenada a -20ºC, até o momento de uso.

3.10.1.3 Solução de ácido 2,4,6-trinitrobenzeno-sulfônico (TNBS) 69,24 mM

Transferiu-se uma alíquota de 2,030 mL de solução de TNBS a 5% p/v para um balão volumétrico de 5 mL, completando-se o volume com água Milli-Q. Essa solução foi distribuída em frascos contendo 200 µL cada, e armazenada a -20ºC, até o momento de uso.

3.10.1.4 Tampão de HEPES pH 8,15

Transferiram-se, para balão volumétrico de 25 mL, 297,5 mg de HEPES (concentração final 50 mM), 438,75 mg de cloreto de sódio (concentração final 300 mM) e 1,420 g de sulfato de sódio anidro (concentração final de 400 mM). Na seqüência, adicionaram-se 20 mL de água Mili-Q e 50 µL de solução saturada de hidróxido de sódio. O pH da solução foi ajustado para 8,15 com adição de solução de NaOH a 10%. Completou-se o volume com água Mili-Q. Essa solução foi distribuída em frascos contendo 2,5 mL cada, e armazenada a -20 ºC, até o momento do uso.

3.10.1.5 Solução de captopril 64 µM

Transferiram-se 6,95 mg de captopril para balão volumétrico de 50 mL, completando- se o volume com água Mili-Q. Essa solução foi armazenada a -20 ºC, até o momento do uso.

3.10.1.6 Tampão HEPES-NaCl pH 8,0

Transferiram-se, para balão volumétrico de 250 mL, 2,98 g de HEPES (concentração final 50 mM) e 4,38 g de cloreto de sódio (concentração final 300 mM), adicionando-se, na

seqüência, 200 mL de água Mili-Q. O pH da solução foi ajustado para 8,0 com adição de solução de NaOH a 10%. Completou-se o volume com água Mili-Q. Essa solução foi distribuída em frascos contendo 10 mL cada, e armazenada a -20 ºC, até o momento de uso.

3.10.1.7 Tampão fosfato 50 mM pH 8,3

Transferiram-se, para balão volumétrico de 25 mL, 170,1 mg de fosfato de monobásico de potássio anidro, solubilizando-se em 20 mL de água Mili-Q. O pH foi ajustado com solução de NaOH a 10% para 8,3. Completou-se o volume para 25 mL com água Milli-Q. Essa solução foi preparada diariamente para cada ensaio.

3.10.1.8 Tampão fosfato para reação de acoplamento 100 mM pH 8,5

Transferiram-se, para balão volumétrico de 25 mL, 340,2 mg de fosfato de potássio anidro. Adicionaram-se 20 mL de água Mili-Q, ajustando o pH com solução de NaOH a 10% para 8,5. Completou-se o volume para 25 mL. Essa solução foi preparada diariamente, para cada ensaio.

3.10.1.9 Solução de tungstato de sódio 0,3 M

Pesou-se 1,0 g de tungstato de sódio e transferiu-se para balão volumétrico de 10 mL, completando-se o volume com água Milli-Q. Essa solução foi preparada diariamente, para cada ensaio.

3.10.1.10 Solução de ácido sulfúrico 0,32 M

Tranferiram-se, sob resfriamento, 1,75 mL de ácido sulfúrico a 98% v/v para balão volumétrico de 100 mL, contendo água Mili-Q, completando-se o volume a seguir. Armazenou-se à temperatura ambiente, por no máximo 3 meses.

3.10.2 Preparo das amostras

Para o ensaio, as amostras foram solubilizadas em solução de MeOH:HEPES (1:4), pH 8,0, na concentração de 1,1 mg/mL, seguindo-se de sonicação por 15 min, em banho de ultra-som, à temperatura ambiente, e posterior centrifugação a 8.460g, por 10 min.

3.10.3 Protocolo experimental

O efeito das amostras (100 µg/mL) sobre a ECA foi avaliado pela quantificação de Gly-Gly produzida a partir da ação da ECA sobre o tripeptídeo Hip-Gly-Gly. Em um placa de 96 poços, não-estéril, com fundo em V, foram adicionados 10 µL de solução da amostra 1,1 mg/mL (concentração final no ensaio: 100 µg/mL), no controle positivo, 10 µL de solução de captopril a 64 µM (concentração final no ensaio: 5,8 µM) e no controle negativo e no branco 10 µL de solução MeOH:HEPES (1:4), pH 8,0, cada (Figura 12). Adicionaram-se, então, 10

µL de solução de pulmão de coelho a 0,1 g/mL (concentração final no ensaio: 9,1 mg/mL), exceto no branco. A mistura foi homogeneizada e pré-incubada a 37 °C, por 10 min. A reação enzimática foi iniciada pela adição de 60 µL de solução tampão HEPES pH 8,15, seguida de 30 µL de solução do substrato Hip-Gly-Gly 100 mM (concentração final 27,27 mM). Após homogeneização, a mistura foi incubada a 37°C, por 45 min. A reação foi interrompida pela adição de 100 µL de solução de tungstato de sódio 0,3 M e 100 µL de solução de ácido sulfúrico 0,32 M, seguido de homogeneização. Diluiram-se 64 µL dessa solução resultante em 100 µl de água MiliQ (placa de diluição, fundo em V). A placa permaneceu em repouso por 5 a 10 min. Em seguida, transferiram-se, para placa de 96 poços de fundo chato, 75 µL da solução presente na placa de diluição, seguida da adição de 100 µL da solução tampão fosfato pH 8,5 (100 mM), e 5 µL de TNBS 69 mM. A microplaca foi colocada em repouso, em ausência de luz, à temperatura ambiente, por 20 min. Em seguida, a absorbância foi determinada em leitor de microplacas no comprimento de onda de 415 nm. O esquema de distribuição das amostras nas microplacas está representado na Figura 13.

Para o cálculo da porcentagem de inibição da ECA, a cada valor de absorbância lido foi aplicado a fórmula representada abaixo:

onde: