A transformação genética proporciona uma moderna tecnologia para o melhoramento de microorganismos industrialmente importantes pela introdução de novos genes. Entretanto, o melhoramento de muitas linhagens bacterianas industriais tem sido dificultado pela falta ou pela baixa eficiência dos sistemas de transformação genéticos (Xue et al., 1999).
A eletroporação envolve a aplicação de campos elétricos de alta intensidade e curta duração para permeabilizar membranas reversivelmente. O potencial de membrana induzido, e, portanto, a eficiência de entrada de DNA nas células bacterianas, aumenta com a força do campo elétrico aplicado. Entretanto, a porcentagem de morte celular causada por danos elétricos também aumenta proporcionalmente com a força do campo elétrico aplicado. Como resultado, a eficiência de transformação é o efeito combinado desses dois fatores, sob dadas condições de transformação. A força do campo elétrico ótima varia entre as diversas espécies bacterianas e é usualmente mais baixa para bactérias Gram-positivas (4 – 12,5 kV/cm para alguns bacilos e 7 – 18 kV/cm para pequenos coccos) que para espécies Gram-negativas (10 – 20 kV/cm). Não está claro se isto é devido ao fato de que espécies de bactérias Gram-positivas sejam mais sensíveis a tratamentos com elevados campos elétricos que espécies Gram-negativas, sob as mesmas condições (Dower et al., 1992 apud Xue et al., 1999). Em geral, as eficiências de transformação obtidas por eletroporação de bactérias Gram-positivas são relativamente baixas, se comparadas às das espécies Gram-negativas (Trevors et al., 1992 apud Xue et al., 1999).
Teoricamente, maiores taxas de sobrevivência celular conduziriam a um aumento da eficiência de eletrotransformação, particularmente para espécies Gram- positivas, para as quais a aplicação de elevados campos elétricos deveriam facilitar a entrada de DNA nas células através de suas relativamente densas paredes celulares. Substâncias osmoticamente ativas como sacarose, sorbitol e glicerol são geralmente utilizadas em concentrações isosmóticas como meios para suspensão de células eletro- competentes. A inclusão de substâncias osmoticamente ativas no meio para eletroporação poderia balancear a elevada pressão interna das células bacterianas (Trevors et al., 1992 apud Xue et al., 1999).
A amplitude, a forma do campo elétrico e a força do pulso são determinadas pela capacitância do equipamento de eletroporação e pelas dimensões da cubeta. Células mantidas a 0ºC após o pulso elétrico podem manter os poros abertos e, assim, aumentar a probabilidade de penetração do DNA através desses poros. A diluição deve ser realizada em meio à temperatura ambiente. O DNA em conformação linear apresenta os melhores níveis de expressão e transformação; recomenda-se utilizar concentração de DNA entre 1 e 40 µg/mL. A eficiência de transformação é aumentada se as células são ressuspendidas em tampão salino (por exemplo, tampão HEPES, comparado a tampões de solução não – iônicos como manitol ou sacarose) (Sambrook et al., 1989).
Argumentos teóricos sugerem que a formação do poro é devida a um potencial transmembrana que se desenvolve como resultado de um campo elétrico induzido pelo acúmulo de íons nas superfícies das membranas. A magnitude do campo externo requerido para gerar um potencial transmembrana suficiente para a formação do poro é inversamente relacionada ao tamanho da célula e depende da forma celular (Miller et al., 1988).
A amplitude (força do campo elétrico inicial, E 0) e a duração (Duração do Pulso
Elétrico, T) da onda descarregada são importantes, e valores ótimos dependem da espécie e linhagem testadas (Miller et al., 1988). Para células procarióticas, recomenda- se a realização de processos de eletroporação com valores de T entre 5 e 10 ms (Gene Pulser® II Electroporation System Instruction Manual Catalog). Entretanto, melhores eficiências de transformação de espécies Gram – positivas foram obtidas sob valores para Duração do Pulso Elétrico superiores a 10 ms (Miller et al., 1988; Dunny et al., 1991)
O pulso produzido pela descarga de um capacitor apresenta forma de onda com decaimento exponencial. A força do campo elétrico declina com o tempo como uma função da resistência do circuito e do tamanho do capacitor. A curva do decaimento exponencial é descrita por
E (t) = E 0 e –t/T
em que E (t) é a força do campo elétrico (V/cm) em qualquer tempo t (s), E 0 é o campo
elétrico inicial, e T é a Duração do Pulso Elétrico (s) resistência – capacitância (RC). A Duração do Pulso Elétrico (T) depende da resistência total (R, em Ω) e da capacitância (C, em F) do sistema, como segue:
T = RC
Portanto, T descreve a forma de decaimento da onda e é o tempo requerido para que a força do campo elétrico inicial decline para 1/e (aproximadamente 37%) do valor inicial. Devido ao fato de que a resistência da amostra afeta a Duração do Pulso Elétrico
(T), a composição da amostra e a geometria da cubeta têm importante influência na forma de descarga do pulso. A resistência da amostra é inversamente proporcional à força iônica e à temperatura do Meio e da área trans-seccional da interface solução- eletrodos. A resistência é diretamente proporcional à distância entre os eletrodos (Miller et al., 1988).
Figura 2.5. Curva do decaimento exponencial do pulso produzido pela descarga de um capacitor. A Duração do Pulso Elétrico (T) é o tempo requerido para que a força do campo elétrico inicial (V0) decline para 1/e (aproximadamente 37%) do valor inicial.
2.5.1 Condições elétricas requeridas para eletroporação
Segundo Sambrook et al. (1989), a voltagem transmembrana (∆U) é um valor constante e independente da natureza bioquímica da membrana celular; provavelmente, variações na eficiência da eletroporação de uma linhagem celular para outra são devidas a diferenças na taxa e eficiência de reconstituição da membrana ao final do pulso elétrico. A voltagem transmembrana (∆U) é induzida por campos elétricos e varia à proporção direta do diâmetro da célula. Valores ótimos caracterizados para leveduras e bactérias encontram-se entre 12,5 e 16,5 kV/cm.
Quando a descarga do capacitor é direcionada a uma amostra colocada entre dois eletrodos, a voltagem que atravessa os eletrodos atinge rapidamente um pico e declina com o tempo:
V t = V0 [ e –F (t, T) ]
em que T é a Duração do Pulso Elétrico, isto é, o tempo necessário para que a voltagem (V) decline para 1/e do valor inicial do pico de voltagem (V0). A Duração do Pulso
Elétrico é definida pelo produto da resistência total (R, em Ω) e pela capacitância (C, em µF). Desta forma, um alto capacitor requer mais tempo para descarregar através de um meio apresentando uma dada resistência; um capacitor de um dado tamanho descarrega mais lentamente na medida em que a resistência do meio aumenta (Sambrook & Russel, 2001).
De acordo com Sambrook & Russel (2001), a força do campo elétrico (E) varia à proporção direta da voltagem inicial aplicada (V0) e à proporção inversa da distância
(d) entre os eletrodos (parâmetro determinado pelo tamanho da cubeta para eletroporação). Por exemplo, uma cubeta de espaço entre eletrodos igual a 0,2 cm proporcionará um campo elétrico inicial de força igual a 500 V/cm, quando a ela for aplicada V0 de 1000 V.
A forma do pulso é determinada pelo design do equipamento. A forma de onda produzida pela maioria dos equipamentos comerciais é simplesmente o padrão de decaimento exponencial de um capacitor em processo de descarga elétrica (Sambrook & Russel, 2001).
Cuidados especiais devem ser tomados para evitar a explosão da cubeta de eletroporação, geralmente causada por soluções muito condutivas. O limite da
condutividade depende da voltagem selecionada, da distância entre eletrodos e da força iônica da amostra; em geral, superior a 10 meq. Dentre as causas para a condutividade excessiva das soluções de eletroporação estão: (1) lavagem e ressuspensão de células em meio de elevada força iônica; (2) lavagem insuficiente das células; sais contidos no meio que não foram removidos; (3) células lisadas durante a preparação: conteúdo celular contribui para a condutividade; (4) DNA em solução de elevado conteúdo de sais; (5) eletroporação de células acima de 0°C (lise celular) (Gene Pulser® II Electroporation SystemInstruction ManualCatalog).