Stresi Oluşturan Nedenler

As análises de retinol foram realizadas no Laboratório de Análise de Vitaminas do Departamento de Nutrição e Saúde da Universidade Federal de Viçosa. Foram feitas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), com adaptações da metodologia proposta por WEINMANN et al. (1999).

4.2.4.1.1 Reagentes

• Preparo da amostra: água ultra pura, hexano (grau pa), metanol (grau HPLC), nitrogênio gás puro.

• Preparo da solução padrão e padrão interno: trans-acetato de retinol, trans- acetato de retinil, água ultra pura, e metanol (grau HPLC).

• Preparo da fase móvel: água ultra pura e metanol (grau HPLC).

4.2.4.1.2 Aparatos

• Sistema de cromatografia líquida de alta pressão modelo LC-10VP, Shimadzu, composto pelos seguintes acessórios:

o Bomba de alta pressão, modelo LC-10VP.

o Injetor automático, com “loop” de 50µL, modelo SIL-10AF. o Coluna Lichrospher 100, RP-18, 5µm, 150 mm X 4mm. o Detector de fluorescência modelo RF-10AXL.

• Vibrador ultrassônico.

• Microcentrifuga para Eppendorf MOD. 5415 D

4.2.4.1.3 Procedimento: • Preparação da fase móvel

A fase móvel utilizada foi uma mistura de metanol e água ultra pura (95:5, v/v), sendo degasada em vibrador ultrassônico por vinte minutos antes de sua utilização.

• Preparação das soluções padrão

o O trans-acetato de retinil foi usado como padrão interno, o qual é usado como medida de controle de perdas durante a análise (WEINMANN et al., 1999). A solução estoque foi preparada dissolvendo o retinil em uma mistura de metanol e água ultra pura (95:5, v/v). A solução de trabalho foi diluída com a mesma mistura (metanol:água ultra pura) até encontrar a concentração final de 0,4µg/mL.

o O padrão externo utilizado foi o trans-acetato de retinol diluído em metanol e água ultra pura (95:5, v/v).

• Preparação da curva padrão

As concentrações de retinol utilizadas para a construção da curva padrão estiveram entre 0,018 e 0,92µg/mL. A curva foi preparada com 6 diferentes concentrações de retinol adicionadas de volumes constantes de acetato de retinil (1 mL de solução de retinol + 1 mL de solução de acetato de retinil). Cada solução foi injetada na coluna cromatográfica em triplicata. Para a construção da curva padrão procedeu-se uma análise de regressão linear utilizando no eixo X a concentração do padrão externo dividida pela concentração do interno e no eixo Y a área do padrão externo dividida pela área do padrão interno - anexo 4 (WEINMANN et al., 1999).

250µL soro Agitado vigorosamente por 2min

250µl de padrão interno

Agitado vigorosamente por 250µL de hexano mais 2min

Centrifugação (13.000 rpm/15 min)

200µL da camada superior transferidos para um eppendorf

Evaporado em Nitrogênio Resíduo

250µL da fase móvel

50µL injetados na coluna cromatográfica +

+

• Preparação da amostra

A preparação da amostra incluiu os seguintes passos: 1) 250µL de soro foi adicionado à 250µL de acetato de retinil (padrão interno) e agitado em agitador vigorosamente por 2 minutos; 2) em seguida, 250µL de hexano foram adicionados e agitados novamente em agitador por mais 2 minutos; 3) posteriormente foram centrifugados por 15 minutos a 13000rpm; 4) 200µL da camada superior foram removidos para um eppendorf e evaporado em nitrogênio por aproximadamente 6 minutos; 5) o resíduo foi dissolvido em 250µL de metanol-água ultra pura (95:5, v/v/v), 6) alíquotas de 50µL foram injetadas na coluna cromatográfica para análise por CLAE. A figura 1 apresenta a preparação da amostra de forma esquemática.

Figura 1: Preparação da amostra de soro para análise de retinol sérico

• Condições cromatográficas da análise do retinol sérico

A análise do retinol nas amostras seguiram as seguintes condições cromatográficas: coluna Lichrospher 100, RP-18, 5µm, 150 mm x 4mm; fase

detecção por fluorescência (325 nm de excitação e 465 nm de emissão); injeção: 50 µL dos padrões e da amostra; tempo de corrida: 12 minutos.

4.2.4.1.4 Avaliação do retinol 4.2.4.1.4.1 Avaliação qualitativa

A avaliação qualitativa foi feita baseada na comparação entre os tempos de retenção encontrados nas amostras e nos padrões, analisados sob as mesmas condições (WEINMANN et al., 1999).

4.2.4.1.4.2 Avaliação quantitativa

O cálculo da concentração do retinol plasmático foi feito utilizando-se a equação de regressão obtida com a construção da curva padrão.

A classificação do nível de retinol sérico foi feita com base nos pontos de corte propostos pela Organização Mundial de Saúde (WHO, 1996), demonstrados na tabela 1.

Tabela 1: Pontos de corte para a interpretação dos níveis de retinol sérico pela Organização Mundial da Saúde (WHO, 1996)

Nível de retinol sérico Categoria µ µ µ µg/dL µµµµmol/mL Carência grave < 10 < 0,35

Carência marginal moderada 10 - 20 0,35 - 0,70

Grupos com valores duvidosos 20 - 30 0,70 - 1,05

4.2.4.1.5 Determinação da faixa de linearidade

A faixa de linearidade foi obtida utilizando-se as mesmas condições listadas anteriormente, a partir da injeção, em triplicata, de oito concentrações crescentes da solução padrão (0,015 a 9,2µg/mL) e uma solução constante do padrão interno (0,4µg/mL). Desse modo, conseguiu-se os resultados de uma faixa

250µL soro Agitado vigorosamente por 2min

250µL de Padrão Externo ou

250µL da fase móvel (branco)

250µL de padrão interno

Agitado vigorosamente por 250µL de hexano mais 2min

Centrifugação (13.000 rpm/15 min) 400µL da camada superior transferidos

para um eppendorf Evaporado em Nitrogênio

Resíduo 250µL da fase móvel

50µL injetado na coluna cromatográfica +

+

determinada. Para isso, efetuou-se uma análise de regressão linear utilizando no eixo x a concentração do padrão externo dividida pela concentração do interno e no eixo y a área do padrão externo dividida pela área do padrão interno - anexo 5 (WEINMANN et al., 1999).

4.2.4.1.6 Análise da recuperação do padrão

Os testes de recuperação do retinol foram efetuados a partir da adição de concentrações conhecidas de padrão de retinol em amostras de soro (WEINMANN et al., 1999). Pequenas alterações nas condições listadas para preparação das amostras foram utilizadas na análise de recuperação (figura 2).

Figura 2: Preparação da amostra de soro para análise da recuperação do padrão

A recuperação foi avaliada em duplicata em 3 amostras de soro. Cada amostra de soro foi dividida em quatro alíquotas; em duas destas amostras, adicionou-se padrões em concentrações suficientes para representar cerca de 50%

da média de retinol encontrada na população em estudo. As outras duas foram utilizadas como controles.

Os valores de recuperação foram obtidos a partir da diferença percentual entre os teores analisados e adicionados - anexo 6 (WEINMANN et al., 1999).