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Apesar de intensa investigação científica realizada desde sua descrição original na década de 703 e de mais de 250 artigos científicos publicados, ainda restam lacunas no que diz respeito à definição, etiopatogenia, critérios diagnósticos e possibilidades terapêuticas para a DNI-B2,6,13. Por outro lado, na prática médica, continuamos a encontrar crianças com constipação intestinal grave ou obstruções intestinais, que passam pela investigação diagnóstica das disganglionoses intestinais, através de biópsias do reto, apresentando hiperplasia dos plexos nervosos da submucosa, compatível com o diagnóstico de DNI-B13_.

Um dos maiores desafios é a falta de consenso sobre os critérios necessários para o diagnóstico histopatológico de DNI-B. A proposta mais recente é a representada pelos critérios quantitativos de Meier-Ruge et al.12,13 (Anexo 2). Esta proposta apresenta algumas limitações, representadas pela necessidade de amostras a fresco, para cortes de congelação de 15µm, coradas por reações histoquímicas específicas, de disponibilidade restrita a alguns centros diagnósticos. Além disso, esta proposta leva em conta a hiperganglionose como principal critério diagnóstico, representada pelo valor numérico mínimo de 20% de gânglios gigantes, com mais de 8 células nervosas cada, nos 25 gânglios analisados nos plexos nervosos da submucosa. Há, ainda, a idade mínima, de 1 ano de vida, que limita o diagnóstico desta entidade patológica por um critério temporal. Por tudo isso, poucos são os relatos de aplicabilidade destes critérios em séries de pacientes com hipótese diagnóstica de DNI-B13,23.

No presente estudo, analisamos peças cirúrgicas de pacientes com diagnóstico prévio de DNI-B, estabelecido pelos critérios propostos no Consenso de Frankfurt, de 199011 (Anexo 1). Foi selecionado fragmento de reto distal de espessura total, envolvendo todas as camadas da parede intestinal, o que garantiu análise histológica adequada dos plexos nervosos da submucosa. Este fragmento foi submetido a cortes histológicos de 5µm, corados pela histologia padrão, semelhante ao que é realizado rotineiramente na análise histopatológica das biópsias de reto, para investigação diagnóstica das disganglionoses intestinais. A falta de material a fresco pode ser considerada uma limitação do nosso estudo, já que não permitiu a realização das análises histoquímicas para lactato desidrogenase, succinil desidrogenase e oxido nítrico sintase, recomendadas pelos critérios de Meier-Ruge et al.12,13. Além disso, apesar de todos os casos terem sido previamente submetidos à pesquisa histoquímica da atividade da acetilcolinesterase, como parte dos critérios obrigatórios propostos pelo Consenso de Frankfurt11_{, não foi possível a realização}

de nova análise destas lâminas devido ao desgaste do material pelo tempo.

Apenas 2 dos 29 casos analisados atingiram os valores numéricos exigidos pelos critérios propostos por Meier-Ruge et al.12,13. Destes 2 casos, somente uma criança apresentava mais de 1 ano de idade no momento da cirurgia, e contemplaria a idade de corte exigida por estes critérios diagnósticos12,13_{. Resultados}

semelhantes foram relatados por Taguchi et al., 2014, em estudo multicêntrico retrospectivo dos casos de DNI-B em 167 centros do Japão, no período de 2000 a 2009. Foram diagnosticados 13 casos de DNI-B utilizando-se critérios diagnósticos morfológicos, comuns a todos os centros. Entretanto, quando os autores utilizaram os critérios numéricos propostos por Meier-Ruge et al.12,13, apenas 4 dos 13 casos permaneceriam com o diagnóstico de DNI-B23. Assim, estes critérios quantitativos

parecem ser bastante restritivos quando aplicados à análise histopatológica convencional realizada em cortes de 5µm, corados pela H&E. Cortes histológicos com maior espessura, corados por técnicas que facilitam a identificação de células nervosas, certamente influenciam na determinação quantitativa dos neurônios dos gânglios nervosos da submucosa, o que pode explicar o baixo número de casos que conseguiram atingir este critério numérico em nossa série. Como a análise histopatológica convencional pela H&E é o método mais utilizado na investigação diagnóstica das biópsias de reto para disganglionoses intestinais, é de fundamental importância que sejam determinados valores numéricos para critérios quantitativos, ou que o diagnóstico histopatológico de DNI-B seja qualitativo nestas situações, embasado nas alterações morfológicas que caracterizam esta entidade patológica.

Na presente série de casos, a análise histopatológica realizada permitiu a caracterização morfológica da DNI-B, evidenciando alterações como gânglios com sinais de imaturidade, presença de neurônios hipogênicos, anisomorfia dos neurônios e ectopia neuronal na lâmina própria e na muscular da mucosa (Tabela 3). Estes achados foram confirmados em outras séries de casos e fazem parte de critérios previamente propostos para o diagnóstico de DNI-B16,36,37. A análise quantitativa dos plexos nervosos da submucosa confirmou hiperganglionose, com número máximo médio de 10,7 neurônios por gânglio e revelou que a maior parte dos casos apresentava troncos nervosos hipertróficos, com mediana de 44,6µm de espessura (Tabela 4). Este último achado, característico da DH, é pouco discutido na DNI-B e pode ser considerado como um dos critérios para o seu diagnóstico8,11,36,38-41.

Comparando-se diferentes grupos etários, baseados na idade de corte de 1 ano, proposta pelos critérios quantitativos12,13, não observamos diferenças estatisticamente significativas na análise qualitativa das alterações morfológicas encontradas nos plexos nervosos da submucosa (Tabela 5). Apesar das evidências de que as alterações histopatológicas sugestivas de imaturidade possam sofrer alterações com a idade, através de um processo de maturação e apoptose21,36,42-44_,

nossos resultados mostraram que estas alterações estavam presentes nos dois grupos etários, questionando a necessidade de se estabelecer uma exigência temporal, por meio de uma idade de corte, para o diagnóstico da DNI-B. Além disso, a análise quantitativa dos plexos não evidenciou diferenças significativas entre os grupos etários, em relação à caracterização da hiperganglionose, representada pelo número total de neurônios em 25 gânglios e pelo número máximo de neurônios em um gânglio (Tabela 6). O número de gânglios gigantes identificados foi mais influenciado pela presença de sinais de imaturidade neuronal do que pela idade do paciente (Tabela 7).

A calretinina é uma proteína de 29-kDA, que se liga ao cálcio, dependente de vitamina D, e que possui importante papel como sensor e modulador dos íons cálcio45. A ausência desta proteína leva ao acúmulo destes íons no citoplasma das células nervosas, promovendo hiper-excitabilidade e neurodegeneração27,28_{. Corpos}

celulares de neurônios do sistema nervoso entérico extrínseco, presentes nos plexos submucosos e mioentéricos, e fibras nervosas do sistema nervoso entérico intrínseco, presentes na lâmina própria e na muscular da mucosa, demonstram expressão imuno-histoquímica para calretinina45,46. Esta pesquisa imuno- histoquímica ganhou destaque nos últimos anos firmando-se como método fundamental na investigação diagnóstica da DH, quando há perda total da expressão

desta proteína27-32_{. Como um dos principais diagnósticos diferenciais de DH é a DNI-}

B, é de fundamental importância o conhecimento do perfil de expressão imuno- histoquímica para calretinina na DNI-B.

No presente estudo, observamos que houve expressão para calretinina em todos os casos analisados, tanto nos neurônios dos plexos nervosos da submucosa, como nas fibrilas nervosas da mucosa (Tabela 3), diferentemente do que ocorre na DH27-32. Esta expressão ocorreu também nos neurônios ectópicos, presentes na lâmina própria e na muscular da mucosa, auxiliando substancialmente sua identificação, que faz parte dos achados morfológicos presentes na DNI-B16,36,37

(Figura 3). A identificação destes neurônios heterotópicos é limitada na análise pela histologia padrão, já que há dificuldades para a sua diferenciação com outras estruturas, como células inflamatórias e do estroma.

A concordância entre as análises quantitativas, obtidas pelos métodos da H&E e da calretinina, foi considerada pobre. Além disso, a calretinina permitiu a identificação de um número menor de neurônios do que os obtidos na análise pela H&E (Tabela 4). Isto pode ser explicado pelo fato de que nem todos os neurônios do sistema nervoso entérico apresentam imunopositividade para calretinina47. Beuscher et al., 201448, em estudo realizado em peças cirúrgicas de 28 pacientes, demonstraram que 79% dos neurônios dos plexos nervosos submucosos localizados no cólon apresentavam imunopositividade para calretinina e peptídeo intestinal vasoativo (VIP) e este percentual apresentava variação de acordo com o seguimento intestinal analisado.

A determinação das medidas da espessura de um tronco nervoso e da área de um neurônio, obtidas pela calretinina, também foram diferentes das obtidas pela análise histológica padrão, e podem ser consideradas menos confiáveis. Isto pode ser justificado pelas dificuldades para determinação dos limites das células nervosas no método da calretinina (Figura 5).

Em síntese, concluímos que os critérios numéricos propostos por Meier-Ruge et al.12,13 para análise em cortes de 15 µm, corados por painel histoquímico específico, apresentam aplicabilidade limitada quando transpostos à análise histopatológica convencional, realizada em cortes de 5 µm, corados pela H&E.

No presente estudo, os resultados morfológicos similares encontrados nas diferentes faixas etárias, tanto na análise qualitativa, quanto na análise quantitativa dos plexos nervosos, questionam a aplicabilidade da idade mínima de corte de um ano de vida para o diagnóstico de DNI-B, proposta nos critérios de Meier-Ruge et al.12, 13.

Há expressão imuno-histoquímica para calretinina em corpos celulares de neurônios dos plexos submucosos e em fibrilas nervosas da mucosa em pacientes com DNI-B e este método imuno-histoquímico pode auxiliar a análise histopatológica, principalmente pela identificação de heterotopia neuronal.

A busca para o estabelecimento de critérios que possam ser utilizados na investigação histopatológica das biópsias de reto pela histologia convencional (H&E), e de novos marcadores imuno-histoquímicos para esta doença deve continuar, representando um passo fundamental para melhora da acurácia diagnóstica, bem como do tratamento dos pacientes com DNI-B.