Foram avaliados os seguintes parâmetros microbiológicos: número mais provável de coliformes totais (30ºC), número mais provável de coliformes termotolerantes (45ºC), pesquisa de Salmonella spp. em 25 mL, contagem de Staphylococcus coagulase positivo e contagem de bolores e leveduras. Foi, ainda, realizada a contagem total de bactérias lácticas viáveis. Todas as análises foram realizadas em duplicata.
3.1.2.1- Pesquisa de coliformes totais e termotolerantes
A pesquisa de coliformes totais e termotolerantes foi feita utilizando o método do Número Mais Provável (NMP). Na Prova Presuntiva, 1 mL da amostra e das diluições decimais 10-1 e 10-2, preparadas com água peptonada 0,1%, foram inoculadas em triplicata em tubos contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose (Acumedia Manufactures Inc., Lansing, Michigan, EUA) e tubos de Durhan invertidos. Estes tubos foram incubados a 36ºC por 48 horas. A identificação da presença de gás nos tubos de Durhan indicava resultado positivo e requeria a realização do teste confirmatório em ágar Levine (Acumedia Manufactures
Inc., Lansing, Michigan, EUA) para coliformes totais e caldo Escherichia Coli (Acumedia Manufactures Inc., Lansing, Michigan, EUA) para coliformes termotolerantes (International..., 1974). O NMP foi determinado pela tabela de Mc Crady (Feng et al., 2002).
3.1.2.2- Pesquisa de Salmonella spp. em 25 mL
A pesquisa de Salmonella spp. em 25 mL foi feita seguindo-se as etapas de pré- enriquecimento, enriquecimento seletivo, isolamento e seleção, identificação bioquímica e sorologia (Brasil, 2003). O pré-enriquecimento baseou-se na incubação, a 36 ± 1ºC por 16 a 20 horas, de 25 ± 0,2 mL da amostra, adicionada de 225 mL de solução de água peptonada 1,0%. Para o enriquecimento seletivo, foram utilizados o caldo Rappaport Vassiliadis (Acumedia Manufactures Inc., Lansing, Michigan, EUA) e caldo selenito-cistina (Acumedia Manufactures Inc., Lansing, Michigan, EUA), ambos incubados à temperatura de 41 ± 0,5ºC por 24 a 30 horas. Para o isolamento e seleção, foram utilizados o ágar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose ou BPLS (Isofar Indústria e Comércio, Duque de Caxias, RJ, Brasil), o ágar Hecktoen (Acumedia Manufactures Inc., Lansing, Michigan, EUA) e o ágar
Salmonella-Shigella (Acumedia Manufactures Inc., Lansing, Michigan, EUA), todos incubados a 37 ºC por 24 horas. A identificação bioquímica foi procedida utilizando-se o meio Instituto Adolfo Lutz ou IAL (Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte, MG, Brasil) incubado a 37 ºC por 24 horas. Para a prova de soroaglutinação, foi utilizado anti-soro para Salmonella polivalente “O” (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EUA).
3.1.2.3- Contagem de Staphylococcus coagulase positivo
A contagem de Staphylococcus coagulase positivo baseou-se na inoculação de 0,1 mL da amostra e das diluições decimais 10-1 e 10-2 em ágar Baird-Parker (Acumedia Manufactures Inc., Lansing, Michigan, EUA) suplementado com gema de ovo e telurito de potássio. Os inóculos foram espalhados com auxílio da alça de Drigalski sobre a superfície do ágar e, em seguida, incubados a 36oC por 48 horas. As colônias que apresentaram halos de transparência e precipitação foram ativadas em caldo Brain
Heart Infusion ou BHI (Acumedia
Manufactures Inc., Lansing, Michigan, EUA) e submetidas à prova da coagulase (Brasil, 2003).
3.1.2.4- Contagem de bolores e leveduras
A contagem de bolores e leveduras baseou- se na inoculação de 0,1 mL da amostra e das diluições decimais 10-2 e 10-4 em ágar batata glicose 2% (Acumedia Manufactures Inc., Lansing, Michigan, EUA), acidificado pela adição de ácido tartárico (Ecibra, São Paulo, SP, Brasil) 10% até pH 3,5. Os inóculos foram espalhados com auxílio da alça de Drigalski sobre a superfície do ágar e, em seguida, as placas foram incubadas a 25 ± 1ºC por sete dias (Brasil, 2003).
3.1.2.5- Contagem total de bactérias ácido-lácticas viáveis
Para a contagem total de bactérias ácido- lácticas viáveis, foram preparadas diluições decimais de 10-3 a 10-6 das bebidas lácteas fermentadas utilizando-se água peptonada 0,1%. As contagens foram obtidas pelo método de plaqueamento em profundidade ou pour plate, adicionando-se 1 mL de inóculo em placas de Petri e, em seguida, vertendo-se de 15 a 20 mL do ágar fundido. Foram utilizados os ágares MRS (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, EUA) e M17 (Difco Laboratories, Detroit, Michigan,
EUA). As placas de ágar MRS foram incubadas a 37°C durante 72 horas em câmara anaeróbica (Forma Scientific, Marietta, EUA) contendo uma atmosfera de 85% de N2, 10% de H2 e 5% de CO2. As placas de ágar M17 foram incubadas a 37 ºC em aerobiose por 48 horas. Após os referidos tempos de incubação, a contagem foi realizada em placas cujas diluições apresentaram entre 10 e 300 colônias para ambos os meios de cultura. A enumeração dos microrganismos foi, então, obtida pela multiplicação do número de colônias pelo inverso da diluição para cada um dos meios, e em seguida, foi realizada a soma das contagens no ágar MRS e no ágar M17 para obtenção da contagem total (International..., 1988).
3.1.2.5.1- Purificação, testes morfológicos e bioquímicos e manutenção dos microrganismos isolados
As colônias de bactérias ácido-lácticas de tipos morfológicos diferentes encontradas nas cinco marcas de bebidas lácteas fermentadas avaliadas, que cresceram em ágar MRS foram inoculadas em 3,0 mL de caldo MRS (Difco) e incubadas a 37°C, durante 72 horas, em câmara anaeróbica. As colônias de tipos morfológicos diferentes encontradas nas cinco marcas de bebidas lácteas fermentadas avaliadas oriundas do ágar M17 foram inoculadas em 3,0 mL de leite desnatado em pó da marca Molico (Nestlé®, Araçatuba, SP, Brasil), reconstituído a 10%, e incubadas a 37°C, durante 48 horas, em aerobiose. A partir de colônias de bactérias ácido-lácticas isoladas dos meios ágar M17 e MRS, foram feitos esfregaços em lâminas para coloração pelo método de Gram e teste de catalase, em lâmina, utilizando-se H2O2 a 30%. Após o crescimento, uma alíquota de 800 µL de cada tubo foi transferida para tubo
eppendorf e adicionada de glicerol
esterilizado (200 µL), sendo em seguida congelada a -18°C para posterior utilização. O restante dos cultivos foi destinado à
biologia molecular, com a finalidade de identificação das espécies isoladas, por intermédio de análise de restrição do ácido desoxirribonucléico ribossomal (rDNA) amplificado por reação de polimerização em cadeia (PCR) da região espaçadora 16S-23S do rDNA (ARDRA) conforme metodologia proposta por Moreira et al. (2005), Tannock
et al. (1999) e Tisala-Timisjarvi e
Alatossava (1997).
3.1.3- Identificação de bactérias ácido-