Dez marcadores foram dosados: proteína C reativa ultra-sensível (hs-CRP), fração solúvel do receptor da interleucina 2 alfa (IL-2sRα), proteína quim iotática de m onóci- tos-1 (MCP-1), metaloproteinase 2 (MMP-2), metaloproteinase 9 (MMP-9), inibidor teci- dual de metaloproteinases-1 (TIMP-1), molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1), P- selectina, interleucina 6 (IL-6) e fator estimulador de colônias de monócitos (M-CSF).
Os marcadores IL-2sRα, MCP-1, TIMP-1, ICAM-1, Interleucina 6 e M-CSF foram dosados pela técnica de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). A faixa de de- tecção foi de 31 pg/mL a 2000 pg/mL para IL-2sRα, TIMP-1 e M-CSF, e de 15.625 pg/ mL a 1000 pg/mL para MCP-1 e ICAM-1, e de 9.375 pg/mL a 1000 pg/mL para IL-6. Foram utilizados kits que contêm os componentes básicos para desenvolvimento do en- saio (DuoSet ELISA development system, R&D Systems, Minneapolis, USA). Estes kits foram com plem ent ados com placas, soluções, diluent es e subst rat os adquiridos sepa- radam ent e e preparados em nosso laborat ório, conform e orient ações do fabricant e.
A técnica utilizada na realização do ensaio é descrita nos passos abaixo.
1-Sensibilização da placa. Cada placa contem 96 poços para dosagem. O anticorpo de captura foi diluído em solução estabilizadora (PBS) sem proteína carreadora e 100 m icrolit ros de solução foram colocados em cada poço. A placa foi ent ão selada e dei- xada incubar à noite em ar ambiente. No dia seguinte foi lavada e aspirada conforme prot ocolo do fabricant e ant es do ensaio.
2-Adição da am ost ra. Foram adicionados 100 m icrolit ros do soro por poço e incu- bada a placa por 2 horas.
3-Adição do ant icorpo det ect or. Após repet ir o ciclo lavagem e aspiração, adiciona- m os 100 m icrolit ros do ant icorpo por poço e incubam os por 2 horas.
4-Streptavidina-HRP. Após lavagem e aspiração, adicionamos 100 microlitros por poço desta solução e incubamos por 20 minutos mantendo a placa longe da luz.
5-Após lavagem e aspiração, adicionamos 100 microlitros de substrato enzimático e incubamos a placa por 20 minutos longe da luz direta.
7-Leitura das placas. Realizada imediatamente após parar a reação, com o leitor calibrado para um comprimento de ondas de 450 nanômetros.
Um a curva padrão da concent ração das m oléculas dosadas foram const ruídas em cada placa a part ir da solução padrão fornecida pelo fabricant e, de concent ração co- nhecida. Est a solução sofreu diluições sucessivas, t endo a solução seguint e m et ade da concent ração da ant erior, num t ot al de set e pont os de diluição. Foram usados 16 poços para const rução da curva padrão, rest ando oit ent a poços para dosagem . Com o t odas as dosagens foram em duplicat a, cada placa t eve capacidade para dosar 40 pont os. Um gráico foi construído plotando as concentrações da curva padrão no eixo X contra suas absorbâncias médias no eixo Y. Uma reta foi obtida deste gráico usando a análise de regressão linear, e com a equação desta reta as absorbâncias foram convertidas em concent ração sérica.
Os marcadores MMP-9, MMP-2 e p-selectina foram dosados pelo ELISA com kits comerciais prontos para uso (Quantikine HS Human®, R&D Systems, Minneapolis, USA). A faixa de detecção para MMP-9 é de 0.156 ng/ml a 20 ng/ml; para MMP-2 é de 0.78 ng/ml a 100 ng/ml; e para P-selectina é de 0.5 ng/ml a 50 ng/ml. Os coeicientes de variação int ra- ensaio e int er- ensaio fornecidos pelo fabricant e são respect ivam ent e: menor que 3% e menor que 8% para MMP-9; menor que 6% e menor que 10% para MMP-2; e menor que 6% e menor que 10% para P-selectina.
A hs-CRP foi dosada pelo método de quimiluminescência (immulite®, DPC Labs, Los Angeles, CA, USA) . As am ost ras foram adicionadas a um a unidade de t est e que t em na sua parte interna uma pérola recoberta com anticorpo especíico conjugado com fosfat ase alcalina. Após período de incubação com agit ação int erm it ent e, a unidade gira no seu eixo vertical em alta velocidade, o que faz com que o líquido excedente suba e seja capturado numa câmara lateral da unidade. A câmara principal da unidade sofre várias lavagens para retirada do material não ligado ao anticorpo. Por im, um substrato luminogênico é adicionado. A luz emitida pela reação química é então lida por um con- tador de fótons de alta sensibilidade (luminômetro). A faixa detectável da hs-CRP neste método é de 0.01 mg/dl a 890 mg/dl.
Os níveis do sirolim us foram dosados no sangue t ot al pelo m ét odo da crom at ogra- ia liquida de alta performance do tipo ultravioleta (HPLC/UV), com limite inferior de de- tecção de 80 picogramas, estendendo a faixa detectável com linearidade até pelo me- nos 25 nanogram as128, 129. Est es valores com preendem com boa m argem de segurança
o necessário para o cont role das doses de sirolim us em pregadas na prát ica clínica.
3.5-Apresentação de Dados e Análise Estatística
Todas as variáveis contínuas foram expressas como média ± desvio-padrão e as varáveis categóricas como porcentagens. No caso de haver assimetria na distribuição dos dados, transformação logarítmica ou de raiz quadrada dos dados era realizada.
28
Os valores basais dos três grupos foram comparados usando a análise de variância (ANOVA), e no caso de encontrar diferenças entre grupos o teste de Tukey foi aplica- do. No seguimento foram analisadas as médias das variações absolutas, ou deltas, dos m arcadores em relação ao t em po basal para cada um dos quat ro t em pos do segui- m ent o, ou sej a, 24 horas, 1 sem ana, 4 sem anas e 8 sem anas. A variação foi obt ida pela subtração do valor de cada tempo menos o valor basal. Para análise estatística foi usado um modelo misto de análise de variância para medidas repetidas com a correção de Kenward-Roger130 para os graus de liberdade131. No caso de ser detectada intera-
ção signiicativa tempo-grupo - ou tempo-tratamento – testes de efeitos simples eram aplicados para t est ar o efeit o do grupo em cada um dos t em pos de seguim ent o. Com o o estudo foi uma comparação entre duas séries de casos e portanto não randomizado, havia a possibilidade de recrut am ent o de pacient es em est ágios diferent es da doença em cada grupo. Isto poderia se reletir em diferenças nos níveis basais dos marcadores entre os grupos sirolimus e controle, introduzindo um importante viés na interpreta- ção dos resultados. No caso de ocorrer esta situação em qualquer dos marcadores, o m odelo de m edidas repet idas em pregado seria inadequado pois seus pressupost os não cont em plam event uais diferenças int rínsecas ent re os grupos. Assim , em pregam os também modelos de análise de covariância (ANCOVA) com ajuste para os níveis basais dos m arcadores para com parar os grupos sirolim us e cont role em cada um dos t em pos de seguim ent o132.
Apresentamos os dados com gráicos do tipo barra-erro. Neles a média das varia- ções é represent ada com o um pequeno círculo t ranspassado por um a linha vert ical com limites superior e inferior, que são os limites do intervalo de coniança (IC 95%).
Toda a análise estatística foi feita com o software SAS (versão 9.2 ;SAS Institute, Inc., Cary, N.C,USA). Todos os testes são bi-caudados. Considerou-se estatisticamente signiicantes diferenças com valores de P menores que 0.05. Valores maiores que 0.05 e menores que 0.10 foram considerados marginalmente signiicantes e interpretados como tendência e valores iguais ou maiores que 0.10 foram considerados não signii- cant es.
30