Sessizlik Türleri

O vírus da bronquite infecciosa (VBI) é, por definição, um coronavírus de aves domésticas (espécie Gallus gallus), e se notabiliza por ser o agente etiológico da bronquite infecciosa (BI), mais comumente conhecida como da bronquite infecciosa das aves. A BI se caracteriza por ser uma enfermidade aguda e altamente infecciosa, acompanhada, não raro, por lesões significativas dos tratos respiratório e uro-genital.

Esta enfermidade está distribuída mundialmente e destaca-se como um dos mais importantes problemas sanitários para o plantel avícola, em virtude de acarretar acentuadas reduções na capacidade produtiva das aves afetadas com consequentes perdas econômicas consideráveis para a indústria avícola.

Na indústria avícola, rotineiramente muitas amostras são colhidas e analisadas por ocasião da suspeita da ocorrência de doenças infecciosas ou no monitoramento da resposta imune pós-vacinal, de forma que se torna cada vez mais necessário o acesso a metodologias de execução mais simples e econômicas. Assim, é fundamental que estejam disponíveis reagentes eficientes e baratos, que ofereçam boa reprodutibilidade quando usados em ensaios sorológicos. Ademais, uma parcela importante de reagentes sorológicos ideais depende da existência ou do preparo de antígenos purificados, em especial, aqueles derivados de patógenos virais.

Um aspecto relevante no contexto acima é que há uma limitação importante no sentido de tornar disponíveis reagentes ideais para serem usados em testes sorológicos aplicados ao diagnóstico de patógenos virais. Assim sendo, há uma necessidade de serem produzidas preparações purificadas de vírus, o que requer a propagação de grandes volumes desses microrganismos e o seu processamento por técnicas demoradas, trabalhosas e muito onerosas, tal como se configura a purificação de massa antigênica do VBI por meio de inoculação em ovos embrionados SPF, seguido da ultracentrifugação em gradiente de sacarose para serem utilizados no preparo dos kits comerciais de ELISA, que são usados na detecção e mensuração de anticorpos contra diversos patógenos virais aviários.

O VBI apresenta, quatro proteínas estruturais, que foram identificadas como a glicoproteína de espícula (S) a qual é clivada pós-traducionalmente em S1 e S2, a glicoproteína integral de membrana (M), a proteína pequena de membrana (E) e proteína fosforilada de nucleocapsídeo (N). Dentre elas, a proteína N do VBI, que se constituí na proteína principal do capsídeo, é produzida em grande quantidade na infecção por esse vírus e tem a sua estrutura altamente conservada, com cerca de 94 a 99% de identidade entre as várias estirpes do VBI, além de ser altamente imunogênica, sendo, por conseguinte capaz de induzir a produção de anticorpos específicos e de linfócitos T efetores específicos, sobretudo com ação. Dessa forma, a proteína N do VBI se constituí no antígeno de eleição para o desenvolvimento de ensaios sorológicos para a detecção/mensuração de anticorpos anti-antígenos de grupo desse vírus, o que seria de grande utilidade para o imunodiagnóstico da infecção por este vírus.

Atualmente, predomina no imunodiagnóstico da bronquite infecciosa, o uso do método indireto de ELISA, o qual emprega, como antígeno adsorvido à fase sólida, ou suspensões de partículas íntegras do VBI purificadas por ultra-centrifugação, ou, com menor freqüência, preparações da nucleoproteína recombinante inteira, ou em fragmentos, provenientes de amostras de referência do VBI, especialmente as estirpes GRAY, M41, H120 e H52. As maiores vantagens que são destacadas para a escolha de se utilizar a proteína N recombinante do VBI são, além do fato de simplificar o preparo do antígeno viral para esse ensaio sorológico, as propriedades imunoquímicas dessa proteína, com destaque para a sua elevada imunogenicidade e a sua maior conservação, acarretando uma maior reatividade cruzada com anticorpos de amostras séricas de aves infectadas com diferentes variantes do VBI, as quais, com frequência, estão circulando nos plantéis avícolas de diversas partes do mundo, inclusive, por vezes rompendo a barreira imunitária específica induzida pelas vacinas comerciais

A tecnologia do DNA recombinante proporciona a possibilidade de desenvolvimento de novas estratégias para a produção de proteínas recombinantes em sistemas hospedeiros heterólogos, que, depois de caracterizadas imunoquímicamente, tornam-se viáveis para serem usadas no desenvolvimento e aplicação, de forma efetiva,

do método indireto de ELISA, destinado à detecção e/ou mensuração de anticorpos anti-VBI específicos.

Dentro desse enfoque principal, o presente trabalho teve um direcionamento, no sentido de contribuir com o diagnóstico da bronquite infecciosa em aves, através da clonagem e produção da proteína N recombinante tanto da estirpe de referência vacinal como de um isolado variante de campo no Brasil, de forma a tornar disponíveis e mais acessíveis os antígenos para serem usados em técnicas de imunodiagnóstico atualmente que são mais frequentemente usadas para a detecção de anticorpos anti- virais específicos dos isótipos IgG e especialmente IgM, produzidos por aves suspeitas de infecção pelo VBI. Ainda e por considerar que a proteína N, como foi destacado antes, é altamente imunogênica e mantém mais conservada a sua composição de aminoácidos e, consequentemente, os seus principais epítopos, tanto os de células B como T, participando, assim, mais ativamente da indução de mecanismos de imunidade de proteção ao desafio com o VBI, também foi investigada, nesse estudo, a atividade imuno-protetora dessa proteína recombinante em galinhas, que depois de imunizadas e re-imunizadas foram submetidas ao desafio com estirpe virulenta do VBI, tendo sido demonstrado que, apesar dessa proteína ser capaz de estimular a produção de altos níveis de anticorpos, não houve a indução de proteção contra uma dose infectante mais elevada feito com a estirpe virulenta homóloga e, ademais, ficou evidenciado que há um elevado grau de imunogenicidade e capacidade de reatividade cruzada com anticorpos produzidos contra a proteína N recombinante do VBI.

Em conclusão, a proteína N recombinante do VBI produzida em E. coli possui elevada imunogenicidade, comprovada em nosso estudo pela sua capacidade de reagir fortemente com anticorpos induzidos pela infecção com diferentes estirpes desse vírus, ou pela vacinação contra esse mesmo vírus e que estão presentes em um número relevante de amostras séricas obtidas de aves mantidas em criações comerciais, tendo um grande potencial de ser aplicada de forma mais eficaz em técnicas de imunodiagnóstico da BI, como o ELISA e o Western-blotting. E, ainda, embora não tenha sido confirmada a atividade imuno-protetora dessa proteína recombinante, quando a mesma foi usada na imunização experimental contra o VBI, a sua

imunogenicidade foi em parte demonstrada, já que níveis elevados de anticorpos foram induzidos nas aves experimentalmente imunizadas com preparações dessa proteína recombinante, sendo necessário, então, que sejam testados novos protocolos de imunização combinados com vacinas contra a BI existentes, bem como com doses menores de vírus-desafio, a fim de se dimensionar melhor o papel dessa proteína estrutural do VBI nos mecanismos de proteção que atuam no organismo hospedeiro das aves.