Serolojik Tanı

1.9.2.1. İndirekt Floresan Antikor Testi (IFAT) ve Enzim Bağımlı Immunosorbent Testi (ELISA)

Theileriosise karşı kontrol programlarının etkili olabilmesi için doğru epidemiyolojik verilerin elde edilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Gerçek epidemiyolojik verilerin elde edilebilmesi ise etkili tanı metotlarının varlığı ile mümkün olabilmektedir. Tanı metotlarının geliştirilmesi amacıyla Theileria’nın kompleks yaşam döngüsü içerisinde

37 yer alan omurgalı konakdaki farklı gelişim safhaları incelenmiştir. Farklı hücre ve dokularda gelişen bu aşamalar, farklı konak tanıma sistemleri ve immun cevap mekanizmaları oluşturmaktadır. Theileria’nın sporozoit, şizont, merozoit ve piroplasm safhaları konak hücre tarafından tanınmaktadır. Fakat yalnızca sporozoit ve merozoitler ekstrasellüler koruyucu humoral yanıttan etkilenmektedir. Sporozoitler enfekte kenelerin inokulasyon sayısı ile sınırlı olarak konağa aktarılmakta ve kısa bir süre içerisinde dolaşımda kalmaktadır. Bu nedenle sporozoit aşamasında immun cevabın ve koruyucu bağışıklığın gelişimi neredeyse mümkün olmamaktadır. Bu da bağışıklığın parazitin yaşam döngüsünün diğer aşamalarında oluştuğunu düşündürmektedir. Sporozoit ve merozoitin aksine lenfositlerdeki makroşizont ve eritrositlerdeki piroplasm safhaları hücre içinde gelişmektedir. Dolayısıyla bu safhalara karşı humoral yanıtın tespiti ve tanınması onların antijenleri ile mümkün olmaktadır. Parazitin gelişim safhalarındaki antijenlerine karşı humoral yanıtın tanınması ve algılanması ise tanı testinde kullanılan antijene ve saflığına bağlı olarak oluşmaktadır (Brown ve ark 1994).

IFA testi şimdiye kadar sığırlarda Theileria enfeksiyonlarına karşı oluşan antikorları tespit etmekte başarılı bir şekilde kullanılmıştır (Burridge ve Kimber 1973). Ayrıca IFA testinin, Giemsa boyama yöntemi ile piroplasmların mikroskobik olarak tespit edilmesine oranla çok daha duyarlı bir yöntem olduğu çalışmalarda bildirilmiştir (Dhar ve Guatam 1977, Darghouth ve ark 1996). Ancak IFA testinde sonuçların subjektif olarak değerlendirilmesi ve Theileria türleri arasında çapraz reaksiyonların gözlenmesi test için önemli bir problem teşkil etmektedir. Ayrıca geniş çaplı epidemiyolojik çalışmalarda akıcı ve kolay uygulanabilir olmaması dezavantajlarıdır (Kiltz ve ark. 1986, Burridge ve ark. 1974). IFA testine nazaran ELISA’nın pek çok avantajı bulunmaktadır. Standardize edilebilir, ucuz ve kolay uygulanabilen bir testtir. Sonuçların objektif olarak değerlendirilmesi ve çok sayıda örneğin incelenebilmesi nedeniyle epidemiyolojik araştırmaların gereksinimlerini karşılayan bir testtir.

Bugüne kadar Theileria annulata’ya karşı gelişen antikorların belirlenebilmesi amacıyla ELISA testleri geliştirilmeye çalışılmıştır. Bu testlerde saflaştırılmış piroplasm ya da makroşizontlardan direkt olarak hazırlanan antijenler kullanılmıştır. Fakat şimdiye kadar, geliştirilen bu testlerin sensivitesi ve spesifitesi tam olarak incelenememiştir (Manuja ve ark 2000). Ayrıca parazit ham materyalinden saflaştırılan antijenlerin

38 standardizasyonu zor olmakla birlikte parazitin çoğaltılabilmesi için deneysel hayvanlara ihtiyaç duyulmaktadır. Son yıllarda bu problemler çeşitli rekombinant parazit antijenlerinin tespit edilmesi ile aşılmaya çalışılmıştır. Parazitin yaşam döngüsü içerisinde çeşitli doku ve hücrelerde geçen, farklı gelişim safhalarına karşı oluşan antijenler tespit edilerek, ELISA’da kullanım alanı bulmuştur. Şimdiye kadar tespit edilen rekombinant antijenler; sporozoit yüzey antijeni SPAG-1, merozoit rhoptri antijeni Tamr-1, merozoit ve piroplasm yüzey antijeni Tams-1, TamtHSP70, T. annulata yüzey antijeni TaSP, şizont yüzey antijeni TaD, şizont proteini TaSE, mitokondriyal HSP70’dir (Williamson 1989, Hall ve ark 1992, Shiels ve ark 1994, Shiels ve ark 1995, Schnittger ve ark 2000, Schnittger ve ark 2002, Schneider ve ark 2004, Schneider ve ark 2007). Tams-1’in duyarlılığı ve özgüllüğü yapılan bir çalışmada iki grafik alıcı-çalışma özelliği (ROC) kullanılarak araştırılmıştır. TG-ROC analizi, ELISA için optimal ‘cutoff’ değerini tespit etmek için yapılmıştır. TG-TG-ROC analizinde ELISA’nın doğruluğunu belirleyebilmek ve maksimum duyarlılık, özgüllük elde edebilmek için referans olarak IFA testi kullanılmıştır. Çalışma sonucunda enfeksiyon sonrası 3 aya kadar IFA testinin daha duyarlı ve spesifik olduğu; 3 aydan sonraki dönemde ise IFAT’ın yanı sıra ELISA testinin de duyarlı ve spesifik olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca Tams 1 ELISA testinin, tropikal theileriosisin epidemiyolojisinin belirlenmesinde potansiyel bir test olduğu bildirilmiştir (Gubbels 2000). SPAG-1 rekombinant antijeninin indirekt ELISA’da kullanıldığı çalışmada doğal enfekte hayvanlarda bu antijene karşı oluşan antikor miktarının tanı için yeterli düzeyde olmadığı görülmüştür. Ancak re-enfeksiyon sonrası ya da tekrar eden kene enfestasyonu sonucu hayvanlarda yeterli düzeyde antikor oluştuğu bildirilmiştir (Williamson 1994). T. annulata yüzey proteini TaSP geni, sporozoit ve şizont safhalarında parazit genomu ve transkripsiyonu içinde tek bir kopyası bulunmaktadır. Muhtemelen 36 kDa moleküler ağırlığa sahip TaSP, yaklaşık 315 amino asit proteini kodlamaktadır (Bakheit ve ark 2004). Saha şartlarında sığırlarda T. annulata enfeksiyonunun tanısında indirekt TaSP ELISA’nın kullanışlı bir tanı testi olduğu bildirilmiştir (Salih ve ark 2005).

Bu tanı testlerinin yanı sıra, daha önce enfekte olmuş ya da enfekte olduğundan şüphelenilen hayvanların taşıyıcılık durumunu belirlemede geleneksel olarak kullanılan iki farklı tanı yöntemi bulunmaktadır. İlk yöntemde periferal kan mononükleer hücrelerinin (PBM) izolasyonu ile makroşizontla enfekte hücre kültürlerinin belirlenmesi amaçlanmaktadır. Doku kültüründe Theileria makroşizontları ile enfekte lökositlerin in

39 vitro ortamda çoğalması sağlanarak enfeksiyonun varlığı belirlenmektedir (Sharma ve Brown 1981). Xenodiagnoz adı verilen ikinci yöntem ise duyarlı bir hayvanda deneysel kene enfeksiyonu oluşturularak yapılmaktadır. Enfekte olduğu şüphelenilen hayvan üzerinden beslenen keneler doyup, düştükten sonra gömlek değiştirerek sporozoit aşamasında tükrük bezlerinde paraziti barındırmaktadır. Bu keneler tekrar duyarlı bir hayvan üzerinde beslendiğinde, enfeksiyonu duyarlı hayvana nakledip nakletmediği belirlenerek tanı konmaktadır (Sergent 1945, Brown ve ark 1994). Bu iki yöntem zaman alması, zahmetli olması ve duyarlılıklarının olmaması nedeni ile pratikte kullanılmamaktadır.

1.9.2.2. Lateral Flow İmmunukromatografik Test

Lateral flow immunoassay, veteriner, tıbbi, gıda, tarım, çevre ve endüstriyel alanda kullanılan önemli bir tanı yöntemidir. Malaria (Mills ve ark 1999), cryptosporidiosis (Chan ve ark. 2000), leishmaniasis (Reithinger ve ark 2002), toxoplasmosis (Huang ve ark. 2004a), coccidiosis (Liao ve ark 2005), babesiosis (Huang ve ark 2004b, Kim ve ark 2007, Kim ve ark 2008) ve trypanasomiasis (Houghton ve ark. 2009) gibi birçok protozoan hastalıklarının serolojik tanısında immunokromatografik testler geliştirilmiştir. Günümüze kadar tropikal theileriosisin tanısında IFAT, indirekt ELISA ve cELISA’nın kullanıldığı çok sayıda çalışma bildirilmiştir (Burridge ve Kimber 1973, Dhar ve Guatam 1977, Darghouth ve ark 1996, Gubbels ve ark 2000, Bakheit ve ark 2004, Renneker ve ark 2008). Kompleks bir prosedüre sahip IFA testinde, çapraz reaksiyon problemlerinin görülmesinin yanı sıra pahalı laboratuar ekipmanları ve deneyimli elemana ihtiyaç duyulmaktadır (Burridge ve ark 1974). ELISA, laboratuar ortamında geniş çaplı epidemiyolojik çalışmalar için hem spesifik hem de kullanışlı bir testtir (Bakheit ve ark 2004, Renneker ve ark 2008). Fakat sahada hızlı tanı elde edilmesi açısından uygun değildir. Son yıllarda T. annulata enfeksiyonlarının serolojik tanısında hızlı bir immunokromatografik strip testi geliştirilmiştir. cELISA testi ile T. annulata spesifik antikorlarının tespitinde immunodominant antijen olarak geçerliliği kabul edilen TaSP proteinin kullanıldığı, T. annulata- Lateral Flow Device (Ta-LFD) oldukça basit ve kullanışlı bir testtir (Renneker ve ark 2008, Renneker ve ark 2009; Abdo ve ark 2010). Diğer serolojik testlerle

40 karşılaştırıldığında hızlı sonuç alınması, deneyimli eleman ve ekipman gerektirmemesi ve sahada pratik olarak kullanılması açısından avantajlıdır. Ta-LFD ile yapılan bir çalışmada T. annulata ile deneysel enfekte hayvanların serumunda tespit edilen antikorlarla diğer bovine patojenler (T. parva, B. bigemina, B. bovis, Anaplasma marginale ve Trypanasoma brucei) arasında çapraz reaksiyon gözlenmemiştir. Aynı çalışmada Ta-LFD’nin duyarlılığı ve özgüllüğü referans test olarak IFAT ile karşılaştırıldığında % 96.3 ve % 87.5; indirekt ELISA ile karşılaştırıldığında % 98.7 ve % 81.8; competitive ELISA ile karşılaştırıldığında % 100 ve % 47.6 olarak tespit edilmiştir (Abdo ve ark 2010).