Serbest Zamanın Kavramsal Çerçevesi

Dentre as técnicas disponíveis atualmente, a que envolve microssatélites tem sido muito utilizada em estudos de genética de populações de espécies silvestres, face

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à robustez, confiabilidade, praticidade operacional (Ferreira & Grattapaglia, 1996), e por serem os marcadores mais informativos geneticamente (Grattapaglia, 1999).

O desenvolvimento da técnica de marcadores microsatélites expandiu os estudos de genética evolucionária para muitas espécies, que nas últimas duas décadas do século XX, era acessada basicamente por isoenzimas (Lewontin, 1991).

Microssatélites consistem em sequências repetidas em série em número variável encontradas nos genomas de plantas, adjacentes a sequências de cópia únicas, apresentando um alto nível de polimorfismo, com alelos possuindo um número variável de repetições básicas (Akkaya et al., 1992; Thomas & Scott, 1993; Morgante & Olivieri, 1993).

São marcadores baseados em sequência curtas (1 a 6 bases) repetidas (Litt & Lutty, 1989), e estão sendo utilizados como marcadores para um ou vários locos (Akkaya et al., 1992; Thomas & Scott, 1993; Morgante & Olivieri, 1993).

Para amplificar uma ilha de microssatélite utiliza-se um par de primers, que são seqüências únicas de oligonucleotídeos, homólogos às regiões flanqueadoras dos microssatélites (Litt & Lutty, 1989). Assim é possível obter uma amplificação específica da região que contém a sequência repetida, e o polimorfismo entre bandas será decorrente dos números diferentes de elementos simples repetidos. Cada segmento diferente de DNA representa um alelo daquele loco específico (Ferreira & Grattapaglia, 1996).

Os microssatélites são co-dominantes, ou seja, ambos os alelos de um indivíduo heterozigoto são visualizados no gel, bem como, multialélicos e suficientemente estáveis para serem utilizados em análises genéticas, sendo ideal para aplicação em genética e evolução de populações naturais (Slatkin, 1995), especialmente em espécies arbóreas altamente heterozigóticas, como já vem sendo demonstrado tanto para espécies tropicais (Chase et al., 1996; Ferreira & Grattapaglia, 1996), como temperadas (Steinkellner et al., 1997a). Os microsatélites apresentam vantagens sobre os métodos clássicos de genética quantitativa na análise da estrutura genética de populações, como: a herança genética das características detectadas (bandas no gel) podem ser facilmente demonstradas; a maioria dos locos são

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codominantes e as frequencias alélicas podem ser calculadas diretamente sem a necessidade de cruzamentos genéticos; as estimativas da variabilidade genética poder ser comparadas diretamente entre populações ou espécies e um conjunto de locos pode ser acessado usando-se pequena quantidade de material.

A utilização de marcadores microssatélites, pela sua neutralidade apresenta como principal vantagem a possibilidade de caracterização de forças evolutivas, sem a influência da seleção, permitindo uma maior compreensão do comportamento das populações naturais, em termos de deriva genética e migração.

Em plantas, os sítios microssatélites encontram-se amplamente distribuídos mais ou menos aleatoriamente por todo o genoma, com uma frequência de um a cada 50 mil pares de base, permitindo a mais completa cobertura de qualquer genoma eucarioto. Sua presença foi comprovada em 34 espécies vegetais, sendo que o elemento mais comumente repetido é o di-nucleotídeo AT (Morgante & Olivieri, 1993). Trabalhando com cinco espécies arbóreas e o milho, Condit & Hubbell (1991) foram os primeiros a documentar a presença de microssatélites em plantas.

Apesar da importância dos marcadores microsatélites para estudos de evolução e conservação genética, Hedrick (1999) relaciona três pontos que merecem ser levados em consideração com dados dessa natureza. A heterozigosidade tende a ser alta dentro das populações, o que acaba produzindo baixa diferenciação entre elas. Como esses locos são extremamente sensíveis à redução do tamanho populacional, em um curto espaço de tempo, podem gerar elevadas distâncias genéticas. Em terceiro, por serem marcadores neutros, diferenças estatísticas significantes podem não estar correlacionadas com diferenças biológicas expressivas, tanto por falta de correlação entre locos adaptativos e locos altamente variáveis, como também, pelo poder estatístico intrínseco desse locos, que é muito elevado.

Atualmente, microssatélites estão sendo empregados para a construção de mapas genéticos em cultivos anuais de importância econômica como soja, arroz e trigo (Akkaya et al., 1992; Rongwen et al., 1995; Zhao & Kochert, 1993; Roder et al., 1995), além de espécies florestais como pinus (Smith & Devey, 1994), fruteiras como citrus (Kijas et al., 1995) e banana (Jarret et al., 1993).

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A utilização de marcadores microssatélites em Theobroma restringe-se ao cacau, onde tem sido empregado para entender a origem e domesticação da espécie (Lanaud et al., 1999), assim como, para elaboração de mapas genéticos (Lanaud et al., 1999; Risterucci et al., 1997), e caracterização de germoplasma (Motamayor et al., 2001).

Um dos grandes entraves para utilização desses marcadores é o grande volume de trabalho necessário para o desenvolvimento de primers específicos para os

loci de microssatélites de cada espécie. Porém, tem sido observado que ocorre

conservação de sítios microssatélites entre espécies relacionadas. É possível, portanto, aproveitar primers, denominados heterólogos, que foram desenvolvidos para uma espécie e emprega-los nas demais espécies do gênero (Ferreira & Grattapaglia, 1996).

Em levantamento com várias espécies realizado por Peakall et al., (1998) foi observado que, dentro do mesmo gênero, 50 à 100% dos locos mantinham-se conservados, apesar de que nem todos eram informativos (20 à 100% polimórficos). Em algumas espécies, porém, essa transferência é pouco efetiva, como relatado por Butcher et al., (2000) para Acacia mangium. Os autores atribuem à baixa transferibilidade observada, o grau de divergência evolucionária entre as diferentes seções e subgêneros, pois existe uma tendência geral em plantas de decrescer a amplificação e decrescer o polimorfismo, com o aumento da distância evolucionária em relação a espécie fonte, conforme também foi observado em Brassica (Lagercrantz et al., 1996), Eucalyptus sensu lato (Byrne et al., 1996), Quercus (Steinkellner et al., 1997b) e Leguminosae (Dayanandan et al., 1997).

No caso do gênero Theobroma, até o presente momento já foram isolados, sequenciados e avaliados mais de 49 pares de primers, pelo grupo do CIRAD, em Montpellier – França. Foi verificado que primers desenhados para cacau amplificavam várias outras espécies do gênero, inclusive o cupuaçuzeiro (Lanaud et al., 1999).

Alves et al., (2001) verificaram que primers heterólogos desenvolvidos para cacau foram eficientes na identificação e caracterização de acessos de cupuaçuzeiro.

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