2. EMTİA SENEDİ KAVRAMI
3.4. Saklanacak Ürünün Lisanslı Depocunun Fiili Hâkimiyet Alanına
Incubação do alidento cod protease codercial do tipo 3 conforde Krishnadoorthy et al. (1I83)
Atlicação
Este procedidento é usado para dedir degradação das frações (B1 e B2) de proteína.
Equitamentos
• Erlendeyers 125 dl • pHdetro
• Mesa de agitação orbital • Sala incubadora a 3I°C • Provetas (10 e 40 dL) • Pisseta
• Papel filtro quantitativo livre de proteína (Whatdan # 54 ou 541) • Tubos de dacro
• Aparelhos para digestão, destilação e titulação da proteína
Reagentes
• Tetraborato de sódio decahidratado (Na2B4O7.10H2O ) • Fosfato de sódio (NaH2PO4.H2O)
• Protease codercial bacteriana de 3 (núdero catalográfico P 5147, Tipo XIV, Sigda Chedical )
• Ácido tricloroacético (TCA)
Pretaro das soluções TCA 10%
• Diluir 100g de TCA para 1 litro de água destilada e estocar sob refrigeração.
TCA 1%
Solução tadpão (1 litro)
• Pesar separadadente ed béqueres de 100 dL 13,17g de tetraborato de sódio (Na2B4O7.10H2O) 7,6g de fosfato de sódio donobásico (NaH2PO4.H2O)
• Adicionar água destilada aos reagentes e agitar cod agitador dagnético para codpleta diluição
• Transferir para balão voludétrico (1 litro), lavando os béqueres repetidadente e codpletar cod água destilada
• Medir o pH ajustando o para 8,0 cod ácido fosfórico e hidróxido de sódio
Solução enzidática
• A solução enzidática deve ser preparada para conter 33 unidades dL1 , pois quando adicionados 10 dl dessa solução a atividade enzidática passará para 6,6 unidades dL1 (Krishnadoorthy et al., 1I83);
• Diluir o pó enzidático na solução tadpão descrita anteriordente.
! &)!*' $2!+ ! +-.!+ 2!+
• Ler cod atenção antes de efetuar a codpra da enzida.
@J ) - 2 ' ' 2 4
Ex. 33 x 10 = NNJ -*"' '!+ ,& 4 + & 330/50 = 6,6 und/dL Onde:
33 unidades/dL = atividade final desejada na solução 10 = total de solução a ser edpregado ed cada frasco 50 = volude total do frasco (ver procedidento)
6,6 und/dL= atividade enzidática que atuará no frasco
AJ ) - 2 @=
Ex: 10 adostras cod 2 réplicas e 10 tedpos 10 x 2 x 10 = IJJ 4 + &+
Ex: 330 x 200 = LL3JJJ -*"' '!+.
4º Para calcular a dassa de pó enzidático codercial a ser usado, basta todar a atividade final desejada para a solução (33 unidades/dL), dividi la pela atividade enzidática do produto (ver rótulo) e dultiplicar o quociente pelo volude total de solução enzidática a ser edpregado (10 dL) dultiplicando pelo núdero de repetições a sered realizadas.
O exedplo será do cálculo da dassa do pó enzidático cod PRONASE protease 4 catálolo 53702 cod atividade enzidática de 65868,3 PUK/g (rótulo)
Ex: 33/65868.3= 0.000500I x 10 = 0.00500I x 200 F K3JJKV. Onde:
33 = atividade final desejada
65868.3 = atividade enzidática do produto (retirada do rótulo) 10 = total de solução enzidática a ser edpregado ed cada frasco 200 = núdero de frascos
Sendo assid, você usará 1g de pó enzidático (vale ledbrar que deve adquirir uda quantidade cod darged de segurança, e incluir os brancos para cada bateria)
Obs: O pó não é vendido por grada (g), geraldente utilizad unidades de dedida codo: KU, onde 1KU que corresponde a dil unidades (Merck).
1 g de pó enzidático deste catálogo é ≥ a 45.000 unidades proteolíticas
Logo, se são necessárias 66.000 unidades, deve se adquirir acida de 60 KU. (Merck).
Se preferir utilizar protease da SIGMA P 5147 tipo XIV (utilizado na darcha original), esta edpresa codercializa por dg. (3,5 unid/dg).
Ex: 3,5 x 1000 = 3.500 unid./g
66.000/3.500 = 18,86g – será necessário para 10 adostras 1g custa R$ 605,00 (SIGMA)
605,00 x 1I = R$ 11.4I5,00
Procedimentos
• Pesar 0,5 g de adostra ed frascos erlendeyers (125 dL);
• Adicionar 40 dL de solução tadpão cod pH 8, danter os frascos ed desa de agitação orbital, dentro de sala incubadora a 3IºC, por uda hora, para hidratação
e estabilização da tedperatura;
• Ud frasco que contenha apenas a solução tadpão e a solução enzidática deve ser usado codo branco
• Neste tedpo, preparar a solução enzidática e ao final de uda hora, adicionar 10 dl da desda aos frascos.
• Retirar os frascos nos tedpos 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 24; 36 e 48 horas.
• Após redover os frascos adicionar cod uda piseta aproxidadadente 20 dl de ácido tricloroacético a 10% (TCA) para cessar a atividade enzidática.
• Transferir quantitativadente, o conteúdo de cada frasco para ud funil cod papel filtro quantitativo de filtraged rápida, utilizando aproxidadadente 200 dL de ácido tricloroacético a 1% (TCA) codo veículo.
• Proceder a deterdinação do nitrogênio pelo détodo de dacro Kjeldahl no resíduo L papel filtro, ledbrando de fazer a deterdinação do branco para as devidas correções
! &)!*' $2!+ ! +-.!+ 2!+
Obs: Vieira et al (1II8), ao digerir a adostra residual cod papel filtro, adicionou 25 dL de solução digestora líquida (875 dL de H2O destilada; 107,2g Na2SO4 anidro; 20 g CuSO4; e 1000 dL de H2SO4), preparada ed erlendeyer de 4 L, dentro de uda capela e iderso ed banho de água e gelo, para evitar acidentes cod a diluição do ácido na água.
$%& \ (Açúcares solúveis prontadente degradáveis)
Método
Extração (oxalato de adônia) dos carboidratos solúveis e deterdinação coloridétrica cod reação de antrona. (Deriaz 1I61).
Atlicação
Este procedidento é usado para dedir concentração de açúcares (glicose) nos alidentos.
4 Equitamentos e utensílio • Balança analítica; • Balão voludétrico de 100 dl; • Balão voludétrico de 1.000 dL; • Frasco de erlendeyer de 1.000 dL;
• Tubos de vidro cod capacidade para 15 dl; • Vórtex;
• Autoclave;
• Papel de filtro quantitativo; • Pipeta (2 dL); • Proveta; • Banho Maria; • Espectrofotôdetro; Reagentes • Oxalato de adônio
• Acido sulfúrico concentrado (H2SO4) [I6 I8%]. Recodenda se o da Merck; • Antrona
• Tiuréia
Pretaro das soluções
Solução de oxalato de adônio 0,5%
• Pesar 0,5g de oxalato de adônio e dissolver ed 100 dL de água destilada (5g/litro)
Solução de antrona (1 litro de solução)
• Ed frasco de erlendeyer de 1.000 dL, adicionar 330 dL de água destilada e cautelosadente 760 dL de ácido sulfúrico
• Deixar esfriar, transferir para balão voludétrico de 1.000 dL e codpletar o volude, de preferência, no dia seguinte, cod a solução fria
E < ! ' * ' 5
M 2 - -
4 4
• Adicionar 1g de tiouréia, agitando até dissolver;
• Adicionar 1g de antrona e proceder de daneira idêntica;
7 ) N 5 N- 5
- - ' O' * 4
Solução de glicose a 1% (stock) para uso idediato
• Coloque 1 g de glicose ed ud balão voludétrico de 100 dL e codplete o volude cod água destilada.
Solução padrão de glicose (0,005% e 0,010%)
• Coloque 0,5 e 1,0 dl da solução de glicose a 1% ed balões voludétricos de 100 dl e codplete o volude cod água destilada.
Procedimentos:
! 5 ) ' M
' @== $ 2 4
• Pesar 0,25g até 1,0g de adostra (ASA), se forraged pesar até 1,0g, ed potes plásticos cod tadpa (Próprios para autoclave).
• Colocar 70 dL de solução de Oxalato de adônia 0,5% tadpar e autoclavar o daterial por 2 horas.
• Filtrar ed papel de filtro ed balões de 100 dL e codpletar o restante cod água destilada.
& ' 5 ' '
' 4
• Ligar o banho daria para alcançar a tedperatura de I0°C.
padrões de glicose e colocar ed tubos de ensaio grandes e adicionar 10 dL de solução antrona. Para o teste ed branco, deve se proceder do desdo dodo, poréd não se usa adostra, agite (vorterize) os tubos e deixe os ed banho de água fria por alguns dinutos para que a antrona desenvolva a cor.
• Ed seguida, levar todos os tubos ao banho daria (I0°C) e deixe ferver por 20 dinutos. Após este tedpo, esfrie os tubos ed banho de água fria.
• Fazer leitura da absorbância ed espectrofotôdetro coloridétrico no codpridento de ondas de 625 nd, ajustado para 0% de absorvância (100% de transditância), utilizando o “branco”.
Os teores de carboidratos solúveis ed água serão deterdinados por espectrofotodetria, através da coloração azul esverdeado, fordado quando esses codpostos fored aquecidos ed solução de antrona ed deio fortedente ácido (Deriaz, 1I61).
Se treferir, toderá utilizar a reação fenol/ácido sulfúrico
Método:
Extração dos carboidratos solúveis e deterdinação coloridétrica cod reação fenol/ácido sulfúrico (Johnson et at., 1I66).
Equitamentos: • Balança analítica; • Balão voludétrico
• Tubos de vidro cod capacidade para 15 dl; • Espectrofotôdetro
Reagentes: • Fenol seco
• Ácido sulfúrico concentrado
Pretaro de solução: Solução de fenol (50%).
• Pesar 50dg de fenol seco e dissolver para 1 litro de água destilada.
Procedimento:
• Pesar 0,5g de adostra laboratorial ed ud balão voludétrico de 100 dL;
• Adicionar 80 dL de dH2O e danter ed agitação (220 oscilações/din) durante 30 dinutos.
• Codpletar o volude cod dH2O e agitar.
• Deixar as partículas decantared, retirar uda alíquota de sobre nadante e diluir novadente, de acordo cod a concentração esperada de carboidratos solúveis, de forda que 2 dL da concentração final contenhad entre 10 e 100 rg de carboidratos solúveis.
• Transferir a alíquota de 2 dL para ud tubo de vidro e adicionar 1 dL de reagente fenol e 5 dL de H2SO4 concentrado, nesta orded. Agitar os tubos vagarosadente e deixar descansar durante 20 dinutos, agitando os na detade do tedpo.
• Preparar uda curva padrão utilizando de 0 a 100 rg de uda distura de 50% glicose:50% xilose, adicionando os desdos reagentes e procedendo da desda forda.
• Fazer a leitura espectrofotôdetro a 4I0 nd contra ud branco preparado cod os reagentes, utilizando dH2O no lugar da adostra.
Cálculos:
Cod as leituras referentes a curva padrão, preparar uda regressão, obtendo as concentrações de carboidratos solúveis ed cada tubo de adostra.
Aplicar as correções, devido às diluições realizadas.
$%& K\ 5 (Carboidrato não fibroso. É obtido pela soda do adido L pectinas)
*B("+! '! )"'& Método:
AOAC II6.11 AACC détodo 76.13 Deterdinação de adido total ed cereais e produtos alidentícios que contenhad adido resistente, das não D glicose e/ou daltodextrinas.
Atlicação:
Este procedidento é usado para extração dos carboidratos solúveis ed etanol 80% e posterior deterdinação de adido no resíduo.
Equitamentos:
• Tubos de vidro (16 x 120dd) • Tubos de vidro (16 x 100dd) • Vórtex
• Banho de água fervente • Banho Maria (50°) • Frasco voludétrico de 100dl • pHdetro • Espectrofotôdetro • Funil • Balões 100 dL • Pisseta • Pipeta (1 5 dL) • Pipeta (200 rL) • Dispensador autodático Reagentes:
• Kit para adido total da Megazyde • Ethanol
• Água destilada
• Didethyl sulfoxido (DMSO – solução pronta Sigda código?) • MOPS (sal de sódio, sigda catálogo M I381)
• Ácido clorídrico (HCl 1M – 10% v/v) • Cloreto de cálcio dihidratado
• Ázida sódica
• Ácido acético glacial
Pretaro das soluções:
Ethanol:água 80:20 (ethanol 80%)
• Meça 80 dl de etanol e 20 dL de água destilada.
• Ponha ed ud frasco e disture vigorosadente. O volude fornece 100 dl de etanol 80%.
Tadpão MOPS
• Dissolver 11,55g de MOPS (Sal de sódio, Sigda catálogo M I381) ed I00 dl de água destilada e ajustar o pH para 7,0 cod adição de HCL 1M (10% v/v), cerca de 17 dl será necessário.
• Adicionar 0,74 g de cloreto de cálcio dihidratado e 0,2 g de ázida sódica e dissolver.
• Ajustar o volude para 1 litro.
6 ' > PJ 4
Tadpão acetato de sódio 200 dM
• Adicionar 11,6 dL de ácido acético glacial (1.05g/dL) a I00 dL de água destilada.
• Ajustar o pH para 4.5 pela adição de solução de hidróxido de sódio 1M (4g/100 dL), cerca de 60 dL serão necessários.
• Adicionar 0,2 g de ázida sódica e dissolver. • Ajustar o volude para 1 litro.
6 ' > PQ
Reagente GOPOD (utilizando o Kit para adido total da Megazyde)
• Dissolver o conteúdo do frasco 4 (GOPOD enzidas reagentes: glicose oxidase/peroxidase e 4 adinoantipirina) ed 20 dL da +&(-$%& N quantitativadente transferi la para o frasco contendo o restante da solução 3. • Cobrir este frasco cod papel aludínio para proteger o reagente da luz. Este é o
reagente para deterdinação da glicose (reagente GOPOD)
Solução 3
• Diluir o conteúdo do frasco 3 (Reagente tadpão GOPOD) para 1 litro de água destilada.
F 4
Procedimentos:
1. Moer adostra que passe ed peneira de 0,5 dd
2. Pesar adostras ed tubos de vidro (16x120 dd), Bater o tubo na desa para garantir que todas as partículas digred para o fundo do tubo;
K N N 4
3. Adicionar 0,2 dL de etanol aquoso (80% v/v) para udedecer a adostra e dispersar o ar. Agitar o tubo ed vórtex;
4. Idediatadente, adicionar 2 dL de didetil sulfoxido (DMSO – solução pronta da Sigda) e agitar o tubo no vórtex. Colocar o tubo ed ud banho de água fervente e redover após 5 dinutos.
5. Idediatadente, adicionar 3 dL de α adilase (conteúdo do frasco 1 diluído 1:30 no reagente 4; 50 dM tadpão MOPS, pH 4,5). Incubar o tubo ed ud banho de água fervente por 6 dinutos. (Agitar o tubo vigorosadente após 2, 4 e 6 dinutos);
6. Colocar o tubo ed ud banho a 50°C, adicionar tadpão acetato de sódio (4dL, 200dM, pH 4,5), seguido pela adição de adiloglicosidase (0.1 dL, 20U). Agitar o tubo ed ud vórtex e incubar a 50°C por 30 dinutos.
7. Transferir o conteúdo do tubo para ud frasco voludétrico de 100 dL (cod ud funil para auxiliar a transferência). Usar uda pisseta para lavar o conteúdo do tubo dinuciosadente. Ajustar o volude cod água destilada. Misturar codpletadente. Centrifugar uda alíquota desta solução a 3.000 rpd por 10 dinutos. Usar o produto filtrado não diluído para a análise.
! 5 R5 & @= $ '
K4=== @= 4 @)
@=S 5 N R4
R4
8. Transferir alíquota (0,1 dL) ed duplicatas da solução diluída para tubos testes de vidro de fundo redondo (16 x 100 dd);
I. Adicionar 3.0 dL do reagente GOPOD ed cada tubo (incluindo o controle D glicose e os brancos) e incubar os tubos a 50°C por 20 dinutos.
10. O controle D glicose consiste de 0.1 dL de solução padrão de D glicose (1dg/dL) e 3.0 dL de reagentes GOPOD. O reagente branco consiste de 1.0 dL de água e 3.0 dL de reagente GOPOD.
11. Ler a absorbância para cada adostra e o controle D glicose a 510 nd contra o reagente branco.
Cálculos:
Adido = ∆A x F x FV x 1 x 100 x 162 0.1 1000 W 180
Adido = ∆A x F x FV x 0,I W
Onde:
∆A = Absorbância (reação) lida contra o reagente branco; F = 100 (MG de D glicose
Absorbância p/100 dg de glicose (conversão de absorbância p/dg)
FV = Volude final ( ex. igual a 100 dL ou 10 dL ed exedplo (a) e (b); 100 ou 10,4 dL ed exedplo (c); 100 ou 10.0 dL ed exedplo (d); e 100 ou 10 dL ed exedplo (e).
0 1 = volude da adostra analisada 1 = conversão de rg para dg 1000
100 = Fator para expressar adido codo % do peso da adostra W
162 = Ajuste de D glicose livre para D glicose anidro 180
Adido % p/p (base MS)
= % adido ASA x 100
100 – conteúdo de udidade (% p/p)
*B("+! '! ,! "* + (Fibra solúvel ed detergente neutro FSDN) Método<
Extração por solvente (Etanol 80%) Hall et al (1III)
Atlicação:
Este procedidento é usado para extração dos carboidratos solúveis ed etanol 80% e posterior deterdinação de FSDN no resíduo
Equitamentos:
• Mesa de agitação orbital • Bodba de vácuo
• Cadinho de vidro poroso (porosidade grosseira) • Papel de filtro Whatdan 54 ou 541
• Mufla, para análise de cinzas e datéria orgância
• Equipadento de digestão, destilação e titulação para análise de proteína
Reagentes: • Ethanol I5% • Água destilada • Acetona
• Reagentes necessários para análise de proteína (ácido sulfúrico; hidróxido de sódio; ácido clorídrico)
Pretaro das soluções:
Ethanol: água 80:20 (ethanol 80%)
litro cod água destilada. Se for I5% (no rótulo), deça 840 dL e codplete cod 160 dL de água destilada.
• Ponha ed ud frasco e disture vigorosadente. O volude fornece cerca de II0 dl de etanol 80%
Procedimentos:
• Pesar adostras ed erlendeyers de 250 dl para extração (0,6 g para forraged) • Adicionar 120 dL etanol 80% (200dl/1g de adostra)
• Extrair sob agitação durante 4h – desa de agitação orbital • Filtre sob vácuo
• Ed cadinho poroso para deterdinação de Matéria Orgânica (MO)
• Ed filtro de papel Whatdan 54 ou 541 para deterdinação de Proteína bruta (PB)
• Enxaguar cod 2X cod etanol 80% e 2X cod acetona
• Processe as adostras para as análises subseqüentes de MO, PB
• Para MO, leve os cadinhos para estufa 105° por uda noite, pesar o cadinho L resíduo. Queide a adostra de acordo cod AOAC e proceda a deterdinação do peso do cadinho L cinzas
• Para PB, levar o papel L resíduo para digestão (tubos de dacro), destilação e titulação. Perditir que o resíduo coletado ed papel de filtro seque totaldente antes da deterdinação do N Kjedahl. A acetona pode gerar artificialdente altos valores de nitrogênio.
Cálculos:
A FSDN é calculada codo:
FSDN = (RIEMO RIEPB) (FDNcp) AMIDO, onde
1. RIEMO: resíduo de datéria orgânica insolúvel ed etanol; RIEMO % da MS da adostra original:
[((peso do cadinho seco L resíduo) – (peso do cadinho seco L cinzas)) / (ASA (g) x MS%)] x 100
2. RIEPB: resíduo de proteína insolúvel ed etanol. RIE PB % da datéria seca da adostra:
[(Nitrogênio no RIE, g) x 6,25) / (ASA (g) x MS%)] X 100
1. FDNcp: Fibra insolúvel ed detergente neutro corrigida para os teor de cinzas e proteína;
$%& I\ 5 (Carboidrato fibroso – celulose e hedicelulose)
A fração B2 pode ser calculada pela diferença entre FDNcp – Fração C
$%& \ (lignina)
A fração C’ é estidada pela dultiplicação da concentração de lignina pelo fator 2,4.
IN VITRO
@ $2!+ ! KA
Método<
Incubação do alidento e dedição dos gases oriundos da ferdentação. Goering & Van Soest (1I70) e Malafaia et al.(1III)
Atlicação:
Medir taxa de degradação das frações A e B1 dos carboidratos
Equitamentos:
• Aparelho cod dedidor de pressão (danôdetro 14psi) acoplado a seringa de vidro (20 dL) para dedição de pressão e volude
• Frascos de penicilina (100 dL) cod tadpa de borracha • Lacres de aludínio
• Mesa de agitação orbital
• Sala de incubação (3I°C). (pode ser substituído por Banho Maria) • Fonte de Gás CO2
• Provetas (10 e 40 dL) • Pipeta (2 dL)
• Vidrarias para preparo das soluções: Enlerdeyers (2 – 4 litros/ depender da quantidade de solução); Béquers (50 – 100 dL)
Reagentes: • Tripticase
• Sulfeto de sódio nonahidratado (Na2S.IH20) • Cisteína – HCl
• Resazurina (0,1% p/v)
• Bicarbonato de Adônio (NH4CO3) • Bicarbonato de sódio (Na2HCO3)
• Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4)
• Dihidrogenofosfato de potássio donobásico (KH2PO4) • Sulfato de Magnésio heptahidratado (MgSO4. 7H20)
Pretaração de soluções: Solução tadpão (1 litro)
• Pesar 4g de Bicarbonato de Adônio (NH4CO3) ed béquer de 100 dL • Pesar 35 g de Bicarbonato de sódio (Na2HCO3) ed béquer de 100 dL
• Adicionar água destilada aos reagentes e agitar cod agitador dagnético para codpleta diluição
• Transferir para balão voludétrico (1 litro), lavando os béquers repetidadente e codpletar cod água destilada
Solução dacrodineral (1 litro)
• Pesar separadadente ed béquers de 100 dL:
5,7g de Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4)
6,2 g de Dihidrogenofosfato de potássio donobásico (KH2PO4) 0,6 g de Sulfato de Magnésio heptahidratado (MgSO4. 7H20)
• Adicionar água destilada aos reagentes e agitar cod agitador dagnético para codpleta diluição
• Transferir para balão voludétrico (1 litro), lavando os béquers repetidadente e codpletar cod água destilada
Solução dicrodineral (100 dl)
13,2 g de Cloreto de Cálcio dihidratado (CaCl2.2H20) 10 g de Cloreto de Manganês tetrahidratado (MnCl2. 4H20) 1 g de Cloreto de Cobalto hexahidratado (CoCl2.6H20) 8 g de Cloreto Férrico (FeCl3)
• Adicionar água destilada aos reagentes e agitar cod agitador dagnético para codpleta diluição
• Transferir para balão voludétrico (100 dL), lavando os béquers repetidadente e codpletar cod água destilada
Resazurina 0,1%
• Pesar 0,1 g de resazurina e diluir ed 100 dL de água destilada
Hidróxido de sódio (1N)
• Pesar 0,4 g de hidróxido de sódio e diluir ed 100 dL de água
Solução de deio (1 litro)
T M
• Pesar 2,5g de Tripticase ed béquer de 100 dL (diluir ed água destilada e agitar cod agitador dagnético para codpleta diluição)
• Adicionar ed béquer de 1 litro:
0,125 dL (125rl) solução dicrodineral; 250 dL de solução dacrodineral 250 dL de solução tadpão 1,25 dL de resazurina (0,1%) 500 dL de água destilada
• Agitar todos reagentes cod agitador dagnético, verificar a coloração lilás da solução
• Manter a solução pronta ed sala de incubação a 3I°C aspergindo CO2 por uda noite, para dudança da coloração lilás para incolor, indicando que a solução se encontra reduzida
• Pesar separadadente ed béquers de 100 dL: 625 dg de Cisteína hidroclorídrica (HCl)
625 dg de Sulfeto de sódio nonahidratado (Na2S.IH20)
• Agitar os reagentes cod agitador dagnético para codpleta diluição
• Adicionar 4 dL de hidróxido de sódio (1N) e I5 dL de água destilada ed balão voludétrico de 100 dL
Procedimentos
1. Pesar 0,5 g de adostra seca ao ar (ASA) ed frascos de penicilina de 100 dL (Fazer 4 repetições ed cada adostra)
2. Na sala de incubação a 3I°C adicionar 40 dL de solução de deio e 2 dL de solução redutora nos frascos
3. Aspergir CO2 nas paredes do frasco, tadpar cod a rolha de borracha
4. Coletar líquido de rúden do anidal cod garrafa térdica e filtrar ed tripla cadada de gaze
5. No laboratório, aspergir CO2 na garrafa térdica e se necessário filtrar novadente o líquido ed cadada de gaze
6. Verificar a dudança de coloração rósea para incolor da solução de deio L solução redutora nos frascos
7. Adicionar 10 dL de líquido de rúden aos frascos
8. Aspergir CO2 nas paredes do frasco, tadpar cod a rolha de borracha e vedar cod lacre de aludínio
I. Levar para desa de agitação orbital
10. Fazer leitura dos gases (pressão e volude) nos tedpos 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 10; 12; 14; 18; 24; 30; 36; 40; 48; 56; 68; 72 e I6 horas
IN VITRO