Rind ve Zahid

Nesta seção serão apresentados e discutidos os resultados dos métodos de caracterização utilizados para observação da morfologia dos imunossensores construídos.

5.1.1 Microscopia eletrônica de varredura

Primeiramente, realizou-se o estudo da superfície do substrato de vidro (BK7) recoberto com Cr/Au com o intuito de observar a homogeneidade da superfície e estudar o efeito do processo de limpeza sobre a mesma. A Figura 5.1 representa as imagens obtidas por MEV antes e depois do tratamento com etanol.

A Figura 5.1a corresponde ao substrato sem lavagem. A cobertura do substrato foi bem realizada mas observa-se que a lavagem realmente é necessária antes do uso e aplicação em imunossensores devido a presença de materiais orgânicos e outras substâncias contaminantes, cuja presença afetaria a formação posterior da SAM, consequentemente reduzindo a área recoberta e a disponibilidade de anticorpos, influenciando na sensibilidade do imunossensor. Por outro lado, fica clara a homogeneidade da Figura 5.1b, que representa o substrato após a lavagem com etanol. A diferença antes e depois do tratamento mostra claramente a eficiência do processo de lavagem, que retira com sucesso a maioria dos contaminantes.

5.1.2 Microscopia de força atômica

A técnica de AFM, diferentemente da MEV, permite a observação de superfícies em uma resolução mais acurada, de modo que é possível analisar as alterações passo a passo do processo de imobilização através da comparação do valor quadrático médio (RMS, do inglês root mean square) correspondente.

Figura 5.2 – Imagens de AFM correspondente aos passos de imobilização: (a) substrato recoberto com Au, (b) Au-Cisteamina, (c) Au-Cisteamina-GA e (d) Au-Cisteamina-GA-Ab.

A Figura 5.2 apresenta as imagens de AFM obtidas. Observa-se que a superfície do substrato recoberto com Cr-Au possui diversas granulações, devido ao processo de vaporização do Au, com altura média de 12 nm. A Figura 5.2a mostra apenas a cobertura com Cr-Au, com um RMSAu de 3.2 nm. A próxima etapa (Figura 5.2b), formação de SAM de cisteamina, apresenta um RMSAu-Cis de 3 nm, ou seja, não há grande alterações devido ao pequeno tamanho na molécula, como esperado, assim como a ligação com GA (Figura 5.2c), que possui um RMSAu-Cis-GA de 3.2 nm.

Por outro lado, a presença do anticorpo (Figura 5.2d) faz com que RMSAu-Cis-Ga-Ab seja 5.2 nm, ou seja, o aumento no valor médio indica a presença do anticorpo no eletrodo.

5.1.3 Microscopia confocal de fluorescência de varredura a laser

Utilizou-se LSCM com o objetivo de analisar a cobertura dos substratos com o anticorpo e ainda estudar o melhor método de imobilização deste, comparando as técnicas de dipping e dropping. Primeiramente, seguindo o protocolo descrito na seção 4.6.3.1, é preciso verificar a eficiência do procedimento de marcação do anticorpo, neste caso a IgY, com FITC, utilizando-se a Equação 4.3. Após a diálise, mede-se o espectro de absorção da solução, do qual são obtidos os valores de absorbância dos picos correspondentes ao anticorpo em 280 nm e da FITC em 495 nm. Substituindo os valores obtidos na Equação 4.3, e sabendo-se que o valor do coeficiente de extinção ( ) da IgY é 1,33 (101), ligeiramente inferior que a IgG, cujo é 1.4 (102), obtemos o valor para a razão molar F/P de 0.96, como mostra as Equações 5.1 e 5.2:

_{[ ]}

Esse valor se encontra próximo do limite superior (Molar F/P = 1), porém dentro do intervalo desejado, mostrando que o protocolo utilizado promoveu com sucesso a marcação IgY-FITC.

Devido ao tamanho dos anticorpos, há facilidade na formação de grandes aglomerados proteicos em solução, que são prejudiciais no processo de imobilização, pois dificultam a difusão das moléculas de Ab para o filme, causando até certa perda de atividade, devido a indisponibilidade dos sítios de ligação ao Ag (103-104). Assim, optamos por fazer a diálise diretamente com a solução diluída (0.2 mg.mL-1), na concentração utilizada para a imobilização, a fim de a evitar esta aglomeração, já presente em soluções de 1 mg.mL-1 (observado em microscopia confocal de varredura, não mostrado). A Figura 5.3a mostra as

moléculas de Ab em solução. Observa-se que a imagem espectral (1024 x 1024 pixels, onde cada pixel corresponde a um espectro) apresenta grande homogeneidade, sem a presença de aglomerados, ideal para a realização do procedimento de imobilização.

Figura 5.3 – Imagens de LSCM (a) da solução de anticorpo a 0.2 mg.mL-1_{, (b) do substrato recoberto com} cisteamina e dos filmes preparados através da imobilização de anticorpo utilizando (c) dipping e (d) dropping.

Procurou-se também avaliar a cobertura do filme, através da análise da cobertura com cisteamina. Como a molécula de cisteamina é muito pequena (MM = 77.15 g.mol-1), não seria viável a diálise após a reação com FITC. Foi realizado então a tiolização da superfície de Au normalmente com cisteamina, e depois o dipping, ou seja, o substrato Au-Cis foi mergulhado em uma solução de FITC por cerca de 2 horas, lavado extensivamente com água e então

armazenado em água até o uso. Como a cisteamina possui grupos de aminas primárias expostas, espera-se que ocorra a reação formando Cis-FITC diretamente no substrato.

A Figura 5.3b mostra a fluorescência da cobertura da superfície do substrato, indicando que a SAM foi formada homogeneamente, como esperado, devido ao grande tempo de imersão na solução de cisteamina (24 horas). Desta forma, é correto assumir que a superfície apresenta excelente distribuição de sítios disponíveis para imobilização do anticorpo.

Nesta última etapa estudou-se dois métodos de imobilização, visando obter o método que apresentasse uma maior cobertura, mas sem uma densidade muito alta de proteína por área, já que no caso de imunossensores, é necessário um certo espaçamento entre as moléculas imobilizadas para obter um sinal com menor ruído e maior especificidade (105).

A superfície Au-Cis-GA foi deixada exposta a solução de IgY pelo mesmo período de tempo (1 hora) em ambos os casos (dipping e dropping). A Figura 5.3c/d representa a comparação entre os métodos, respectivamente. Observa-se que embora o dipping promova a ligação do Ab à superfície, é nítida a quantidade inferior de moléculas presentes. O método de dropping apresenta uma quantidade de ligação bem mais elevada, e apesar de apresentar algumas regiões de aglomeração, a cobertura se deu de modo a promover uma ligação espaçada entre as moléculas, que pode ser observada na Figura 5.4.

A partir de um corte transversal na imagem, é possível obter a intensidade da fluorescência na região do corte. A intensidade para o dropping chega até o dobro da intensidade para o dipping, e também pode ser observado através do valor médio, sendo ̅ _{e ̅ , em unidades arbitrárias (u.a.). Entre os picos existem regiões de} fluorescência nula, que chegam até 5 µm na Figura 5.4a e são um pouco menores na Figura 5.4b, afirmando que existe uma maior cobertura superficial pelas moléculas de Ab-FITC.

0 40 80 120 0 2 4 6 8 10 In te nsi da de (u .a .) Distância (m)

(a)

(b)

Figura 5.4 – Intensidades correspondentes ao corte transversal da imagem de fluorescência do método de imobilização por (a) dipping e (b) dropping.

5.1.4 Espectroscopia de impedância eletroquímica

A EIS foi utilizada com o objetivo de observar as variações da impedância dos filmes no decorrer das etapas de imobilização para construção do imunossensor, de forma a caracterizar a ligação entre a molécula e a superfície do substrato. Uma medida típica apresenta um semi-círculo, cujas dimensões são proporcionais aos valores das impedâncias resistivas no eixo das abscissas e capacitivas nos eixos das ordenadas.

A Figura 5.5a apresenta os resultados obtidos para as diferentes superfícies discutidas na seção 5.1.3. A curva em preto representa apenas a superfície limpa do substrato de Au que apresenta um pequeno arco, ou seja, por ser um condutor, idealmente a resistência é nula, no entanto para casos reais sabe-se que qualquer superfície - mesmo que condutora - apresenta certa impedância capacitiva e resistiva.

A curva em vermelho, por sua vez, representa o primeiro passo do processo de imobilização, ou seja, a tiolização com cisteamina. Um efeito curioso é observado: a predominância do efeito difusivo sobre o resistivo. Isso acontece devido a monocamada carregada de cisteamina em solução (grupos NH3+), que provoca a rápida difusão dos íons Fe(CN)6-3/-4, inibindo os efeitos resistivo e capacitivo na interface (106-107).

Os passos seguintes, adição de GA (azul), Ab (verde) e Ag (rosa) apresentam sucessivos aumentos de impedância da superfície, como esperado. Além disso, é interessante notar que o aumento é mais expressivo na adição do anticorpo, devido ao seu tamanho comparado às outras moléculas, e também da proteína NS1.

Para corroborar os dados experimentais, fez-se um modelo de circuito equivalente, apresentado na Figura 5.5b, coincidente com o sistema do eletrodo em contato com a solução, adaptado do modelo de Ferreira et al. (107). No circuito, RS corresponde a resistência da solução (KCl 0.1M), RCT é a resistência correspondente a transferência de carga da oxidação e redução do Fe(CN)6-3/-4, C1 é a capacitância da dupla-camada, C2 é capacitância da difusão e Rdif a resistência de difusão.

0 100 200 300 400 0 100 200 300 Au Au-Cis Au-Cis-GA Au-Cis-GA-Ab Au-Cis-GA-Ab-Ag Z ima g Zreal

(a)

Figura 5.5 – (a) Representação das etapas de imobilização através de EIS e (b) modelo de circuito equivalente representando os dados experimentais correspondentes ao sistema Au-Cis-GA-Ab.