Atualmente existe um grande número de alternativas para incorporar, ao menos, parte da flexibilidade do receptor revisadas nos últimos anos por Teodoro e Kavraki [TEO03], Totrov e Abagyan [TOT08], Cozzini et al. [COZ08], Wong [WON08], Alonso et al. [ALO06] e, mais re- centemente, por B-Rao et al. [BRA09] e Yuriev et al. [YUR10]. Muitos avanços nos programas de docagem molecular publicados no ano de 2009 têm especificamente endereçado a questão da flexibilidade dos receptores [YUR10].
Os diferentes autores das revisões sobre o assunto classificam as abordagens de diferentes ma- neiras. Para Teodoro e Kavraki [TEO03] as abordagens podem ser agrupadas conforme mostra a Figura 2.3:
Figura 2.3: Representação esquemática das diferentes abordagens para incorporação da flexibilidade do receptor em simulações de docagem molecular de acordo com [TEO03].
2.3.1 Soft Docking
Segundo Alonso et al. [ALO06], a primeira solução chamada Soft Docking lida com a flexibi- lidade de maneira simples e indireta. Nessa abordagem, um pequeno grau de sobreposição entre o ligante e o receptor é permitido através de interações de van der Walls suavizadas [JIA91]. Isso permite, por exemplo, que um determinado ligante possa se encaixar em um sítio de ligação onde supostamente só uma molécula menor poderia. Segundo B-Rao et al. [BRA09] a maior desvantagem dessa abordagem é que somente movimentos nas cadeias laterais podem ser analisados mas não na cadeia principal ou outras mudanças mais significativas. Entretanto, Soft Docking tem a vantagem de ser computacionalmente eficiente e de fácil interpretação, sendo por isso também explorado em trabalhos como o de Ferrari et al. [FER04].
2.3.2 Mobilidade do Sítio Ativo do Receptor
Segundo Wong [WON08] o primeiro método a incorporar explicitamente a flexibilidade do re- ceptor em simulações de docagem foi o método apresentado por Leach [LEA94]. Nessa abordagem, durante a docagem molecular são explorados os graus de liberdade conformacionais das cadeias laterais de alguns resíduos do sítio ativo do receptor, enquanto sua cadeia principal é mantida rígida. Uma extensão desse trabalho é apresentada em [LEA98] onde o espaço conformacional de toda a proteína é explorado.
poração da flexibilidade do receptor em docagem molecular se utilizam da inclusão da mobilidade das cadeias laterais do sítio ativo do receptor como, por exemplo: Schnecke e Kuhn [SCH00] apresentam o algoritmo SLIDE em que um fragmento do ligante é inicialmente posicionado, seguido pela adição de outros fragmentos. Após, conflitos entre o ligante e o receptor são resolvidos por rotações em partes do ligante e nas cadeias laterais do receptor; Shaffer e Verkhivker [SCH98] descrevem um algoritmo que utiliza uma biblioteca de rotâmeros para executar uma busca otimizada de todas as possibilidades de combinações de conformações das cadeias laterais do sítio ativo do receptor.
Apostolakis et al. [APO98] apresenta uma abordagem que utiliza uma conformação do receptor na qual um ligante é posicionado aleatoriamente em seu sítio ativo e a energia do complexo é minimizada para remover eventuais sobreposições. Isto é repetido 1000 vezes, gerando uma estrutura diferente do sítio ativo a cada execução. Os melhores resultados são submetidos a um refinamento da minimização de energia. Dessa forma, o conjunto de conformações do sítio ativo representa parte da flexibilidade do receptor.
Mais recentemente, o programa AutoDock4 [MOR09] passou a modelar completamente a fle- xibilidade de certas porções da proteína. Isto é realizado a partir de cadeias laterais do receptor selecionadas pelo usuário que serão tratadas como flexíveis durante a simulação de docagem mole- cular, utilizando os mesmos métodos aplicados pelo AutoDock4 para tratar a flexibilidade do ligante. Outro trabalho mais recente, que incorpora a flexibilidade do receptor ao processo de docagem a partir da mobilidade do sítio ativo do receptor, é o algoritmo MADAMM [CER09]. Em MADAMM, a proteína é flexibilizada utilizando-se uma biblioteca de rotâmeros de cadeias laterais de aminoácidos. MADAMM aumenta a capacidade do algoritmo de docagem introduzindo essa flexibilidade das cadeias laterais selecionadas pelo usuário através de um processo de docagem com múltiplos estágios incluindo uma etapa de modelagem molecular. Neste trabalho foi demonstrado que a orientação de resíduos particulares do receptor tem uma influência crucial na forma como receptor-ligante interagem durante a docagem molecular. Segundo B-Rao et al. [BRA09], a maior desvantagem desse método é que o mesmo somente considera mudanças conformacionais nas cadeias laterais.
2.3.3 Métodos de Simulação Molecular Modificados
Para simular o processo de ligação receptor-ligante o mais detalhado possível e evitar limitações de outras abordagens de modelo de flexibilidade, algumas metodologias se utilizam dos métodos de simulação pela DM, muitas vezes, em etapas pós-docagem [TEO03]. A principal vantagem da representação por DM em estudos de docagem é que essa se mostra muito acurada e pode explicitamente modelar todos os graus de liberdade do receptor. Infelizmente essas metodologias apresentam custos computacionais muito altos [TEO03]. O detalhamento deste tipo de técnica está fora do escopo deste trabalho.
2.3.4 Formas Alternativas de Representar a Flexibilidade do Receptor
Nos artigos de revisão [TEO03, TOT08, COZ08, WON08, ALO06, BRA09] além das técnicas classificadas em alguma das categorias de acordo com Teodoro e Kavraki [TEO03] há diversas metodologias que não se enquadram em nenhum dos outros 4 grupos.
Um exemplo é a técnica inovadora apresentada por Zhao e Sanner [ZHA07], o software FLIPDock (Flexible Ligand Protein Docking). Esse software permite a execução automática de docagem molecular considerando ligantes e sítios ativos do receptor como flexíveis descrevendo os mesmos por meio de Flexibility Tree (FT), uma estrutura de dados que codifica o subespaço conformacional de moléculas biológicas utilizando um pequeno número de variáveis e reduzindo muito o custo computacional de modelar moléculas flexíveis. A FT é utilizada para descrever tanto ligantes quanto receptores. Segundo Zhao e Sanner [ZHA07] a maior vantagem do FLIPDock é sua versatilidade para a descrição com a FT das moléculas envolvidas e a combinação com métodos de busca e como as funções de escore. Assim é possível que novas funções possam ser incorporadas a qualquer momento ao programa. O FLIPDock também permite ao usuário controlar a alocação de recursos computacionais para a representação de movimentos específicos.
2.3.5 Utilização de Múltiplas Estruturas do Receptor
Além dos métodos apresentados acima, que utilizam somente uma conformação do receptor, há um grande número de abordagens para incorporação da flexibilidade do receptor na docagem molecular que utilizam um conjunto de conformações do mesmo. Esse conjunto de conformações pode ser determinado experimentalmente por difração de raios X ou por NMR ou gerados por métodos computacionais como simulações utilizando DM.
2.3.5.1 Combinação de Múltiplas Estruturas do Receptor em Grids
Muitos trabalhos focam na descrição da flexibilidade do receptor através da combinação de um conjunto de estruturas em grids. Geralmente esses grids representam uma média das estruturas. Knegtel et al. [KNE97] foram os pioneiros nessa abordagem na qual condensaram as estruturas do receptor em um grid simples com o objetivo de reduzir o tempo de execução da docagem molecular. Eles avaliaram duas diferentes maneiras de combinar muitas estruturas determinadas experimentalmente em uma representação média: uma considerando a média de energia de interação entre receptor-ligante e outro baseado na variação de posição dos átomos do receptor. Osterberg
et al. [OST02] oferecem uma representação discreta do sítio ativo do receptor através do cálculo de grids de três maneiras diferentes: um grid médio que corresponde a uma média simples ponto-a-
ponto dos valores de todos os grids que representam as estruturas; um grid mínimo que considera o valor mínimo entre todos os grids e por último um grid ponderado pela energia envolvida, quanto mais negativa a energia, maior o peso do ponto no grid médio. Broughton [BRO00] também utiliza grids para representar a flexibilidade do receptor, entretanto as estruturas são obtidas de uma simulação pela DM.
Ao invés de combinar diferentes estruturas em um grid simples, o programa FlexE [CLA01] cria uma descrição única para a proteína alvo. As características estruturais mais conservadas são sobrepostas em uma estrutura média rígida. Para as regiões que variam, são consideradas explicitamente diferentes estruturas mantidas como um conjunto que é explorado combinatoriamente durante a docagem.
Mais recentemente, Bottegoni et al. [BOT09] têm trabalhado no desenvolvimento do 4D-
Docking, um novo protocolo para execução de docagem molecular, em que a conformação do
receptor é a quarta dimensão. Neste protocolo, múltiplos grids representam múltiplas conformações e cada uma destas é considerada como uma variável na otimização global. Essa abordagem se mostrou bastante eficiente para a modelagem da flexibilidade de receptores em docagem molecular, reduzindo o tempo de execução desse tipo de experimento e mantendo a acurácia.
2.3.5.2 Execução de uma Série de Simulações de Docagem Utilizando Diferentes Estruturas do Receptor
Segundo Alonso et al. [ALO06], a abordagem mais abrangente para a inclusão da flexibilidade de receptores consiste em executar simulações de docagem molecular do ligante contra cada estrutura de um conjunto de estruturas do receptor geradas por simulação pela DM. Lin et al. [LIN02,LIN03] apresentam o método chamado RCS - Relaxed Complex Scheme para acomodar a flexibilidade do receptor na busca pela conformação receptor-ligante mais correta. Primeiro os autores executaram uma simulação pela DM do receptor sem o ligante e então docaram ligantes às estruturas geradas durante a simulação pela DM. Após, aplicaram o RCS para encontrar a conformação receptor- ligante mais correta. Mais recentemente, no trabalho apresentado por Amaro et al. [AMA08], os autores apresentam melhorias no método RCS incluindo uma redução prévia do conjunto de conformações do receptor, buscando um conjunto menor, porém representativo (os trabalhos de [LIN02, LIN03, AMA08] serão melhor detalhados no Capítulo de Trabalhos Relacionados).
Entre todas as metodologias que foram brevemente apresentadas neste trabalho, optamos por considerar a flexibilidade do receptor utilizando a combinação de docagem molecular com resultados de simulação por DM. Como explicado na Introdução desta Tese, foi adotado o termo modelo FFR (Fully-Flexible Receptor) para essa metodologia. Este consiste na execução de uma sequência de simulações de docagem molecular, em cada uma é empregada uma conformação diferente da trajetória da DM. Apesar dessa metodologia aumentar a chance de se encontrar um receptor em um estado conformacional correto para acomodar um ligante em particular [ALO06], ela tem como maior desvantagem o tempo necessário para executar cada diferente simulação de docagem receptor- ligante [TOT08, COZ08, WON08, HUA06].