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5.4.1. Tensão Superficial e Concentração Micelar Crítica (CMC)

Conforme mostrado na Figura 4 (D), acompanhou-se a variação da tensão superficial do meio de cultivo livre de células em função do tempo de fermentação. Os valores da TS das amostras tomadas do meio de cultivo livre de células no início da fermentação (0 h) e no tempo de 48 horas de fermentação são apresentados na Tabela 15.

Tabela 15 - Tensão superficial (TS) do meio de cultivo livre de células no início das fermentações realizadas para produção de biossurfactantes pelo micro-organismo B. subtilis ICA56 e após 48 horas de ensaio.

Tempo (h) TS (mN/m) SD

0 65,75 0,70

48* 26,44 0,10

Nota: * resultado da menor tensão obtida nos cultivos realizados no tempo de 48 horas.

A redução de tensão superficial é um importante parâmetro a ser acompanhado durante ensaios fermentativos que visam produzir biossurfactantes, visto que é um dos fatores mais indicativos de sua produção. Observa-se na Tabela 5.6 uma redução de 60% da tensão superficial do meio fermentado livre de células em relação ao meio de cultivo no tempo zero. Esta relevante redução na tensão superficial coloca em evidência a produção de agentes de superfície durante a fermentação.Decesaro e colaboradores (2013), ao estudarem a produção de biossurfactantes por uma linhagem de Bacillus isolada de solo contaminado com óleo diesel, obtiveram um valor de tensão superficial do meio de cultivo livre de células de 35,67 mN/m. Os autores deste trabalho constataram redução da tensão superficial na ordem de 33%. Na Tabela 16 apresentam-se os resultados de CMC e de tensão superficial obtidos a 25, 45 e 65 ºC do biossurfactante bruto (BS que apenas passou pelo tratamento de precipitação ácida e posteriormente liofilizado). Os testes foram conduzidos em triplicata. Observa-se que os valores de CMC variam entre 0,02 g/L (25 ºC) e 0,03 g/L (65 ºC), indicando um leve aumento com a temperatura. A CMC do biossurfactante bruto sofre influência significativa da temperatura (verificado mediante análise estatística - ANOVA). Há uma diminuição do valor da TS com a temperatura (de 33,56 mN/m para 31,95 mN/m). De

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acordo com Brady e Humiston (1981), este decréscimo da tensão superficial é devido ao aumento da energia cinética das moléculas e a redução das forças interativas intermoleculares.

Tabela 16 - Valores de CMC e Tensão Superficial (TS) obtidos para o biossurfactante produzido por B. subtilis

ICA56. Valores com letras diferentes na mesma coluna apresentam diferença significativa (p < 0,05).

T ( ºC) CMC (g/L) TS (mN/m)

25 0,0173a ± 0,002 33,56a ± 0,38

45 0,0231b ± 0,001 33,05b ± 0,81

65 0,0310c ± 0,008 31,95c ± 0,31

Os resultados de CMC obtidos neste trabalho estão de acordo com os trabalhos publicados na literatura, com variação dos valores de tensão superficial na avaliação da CMC de biossurfactantes obtidos a partir de Bacillus sp. entre 11 e 40 mN/m (BARROS et al., 2007, ZEIRAK & NITSCHKE, 2010; ALTMAJER VAZ et al., 2012). Sousa e colaboradores (2012) reletaram CMC da surfactina padrão (Sigma Aldrich - pureza ≥ 98%) de 7 - 20 μmol/L e para o biossurfactante produzido por B. subtilis LAMI009 e B. subtilis LAMI005 de 32,4 mg.L-1 e 28,0 mg.L-1, respectivamente, a temperatura ambiente, em torno de 25 ºC. Barros e colaboradores (2007) ao estudarem a surfactina e suas propriedades químicas, tecnológicas e funcionais para aplicações em alimentos, relatam CMC de 19,0 mg.L-1. Altmajer Vaz e colaboradores (2012) obtiveram valores de CMC de 40 mg/L a 20 ºC ao estudarem o desempenho de um biotensoativo produzido por uma linhagem de Bacillus subtilis isolada a partir de amostras de óleo bruto, em comparação com surfactantes químicos comerciais, avaliados à temperatura ambiente. Liu e colaboradores (2013) em estudo com cepas produtoras de biossurfactante isoladas de campo petrolífero de águas residuais obtiveram valores de concentração micelar crítica (CMC) de 21,8 mg/L. As diferenças nos valores de CMC relatadas pelos diferentes autores podem ser atribuídas aos diferentes graus de purezas do biossurfactantes estudados, já que a presença de sais e/ou produtos do metabolismo celular afeta a determinação da CMC (SAMSON et al., 1990), portanto vale ainda ressaltar que o lipopeptídeo utilizado no presente trabalho não é puro e, ainda assim, os resultados de CMC são satisfatórios. De acordo Rosen (1989) e Lima (2007), existem duas classes de materiais que afetam as concentrações micelares críticas, sendo a classe 1, por incorporação na micela e a classe 2 pela modificação da interações solvente-micela ou solvente-surfactante.

Considerando que a CMC encontrada a 25 ºC foi de 17,30 ± 0,01 mg.L-1, cabe destacar que, embora os valores de CMC dos lipopeptídeos estejam de acordo com os estudos relatados na literatura, são considerados baixos quando comparados aos surfactantes sintéticos

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aniônicos (ALTMAJER VAZ et al., 2012). Por exemplo, ao comparar os valores de CMC do biossurfactante produzido com um surfactante aniônico comumente utilizado na indústria, o dodecil sulfato de sódio (SDS) que apresenta uma CMC de 2333 mg.L-1 (TAVARES, 1997), percebe-se a importância do investimento em estudos na produção dos biossurfactantes. O surfactante químico dodecil sulfato de sódio (SDS) apresenta uma CMC cerca de 135 vezes mais que a do biossurfactante produzido por B. subtilis ICA56.

5.4.2. Ângulo de Contato (AC) e Tensão Interfacial (TI)

Realizou-se avaliação do ângulo de contato e tensão interfacial a partir de soluções do biotensoativo.

A Tabela 17 apresenta os resultados das medidas de ângulo de contato para três concentrações (10, 20 e 60 mg/L) do biossurfactante produzido por B. subtilis ICA 56. Mediante Analise de Variância (ANOVA) verifica-se que os valores de AC obtidos com a concentração de 10 mg/L de biossurfactante são equivalentes ao da água ultra-pura (MilliQ), posto que não se detectam diferenças significativas . Já para os valores de ângulo de contato obtidos com concentrações de 10 e 20mg/L de biotensoativo, obtem-se diferenças significativas no AC em função da concentração ensaiada. Finalmente, não existem diferenças significativas entre os resultados de ângulo de contato obtidos com soluções de biosurfactante de 20 e 60 mg/L.

Tabela 17 - Resultados obtidos para ângulo de contado realizado a 25 ºC usando diferentes concentrações de biossurfactante bruto produzido por B. subtilis ICA56.

C (mg/L) AC (º)

0 103,91 ± 1,54

10 104,37 ± 4,31

20 89,20 ± 5,52

60 92,07 ± 1,55

Os dados mostram uma pequena diminuição nos valores de ângulo de contato com o aumento da concentração do biossurfactante. A 25 ºC, os valores de AC obtidos com a concentração de 10 mg/L de biossurfactante são praticamente equivalentes ao da água ultra

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pura (MilliQ), no entanto essa concentração corresponde a metade da CMC do biossurfactante a 25 ºC.

A medida do ângulo de contato de uma gota sobre uma superfície é indicativo da capacidade de molhamento de uma superfície por dita solução. Quanto menor que 90°, pode- se considerar que a superfície é hidrofílica, porém se os ângulos forem maiores que 90°, caracterizam-se superfícies hidrofóbicas (MOITA NETO, 2006; YUAN & LEE, 2013). No caso da água, se a superfície de deposição for hidrófoba (com ceras), o contato será menor, a gota será esférica e o ângulo de contato será maior. Entretanto, se a superfície for mais hidrófila, a gota se espalhará, podendo até formar um filme uniforme (IOST & RAETANO, 2010). Estudos de molhabilidade geralmente envolvem a medição de ângulos de contato, os dados primários, indicam o grau de molhagem, quando um sólido e líquido interagem. Zeirak e Nitschke (2010) estudaram as mudanças na hidrofobicidade em superfícies tratadas com surfactina. Segundo os autores, a surfactina causa alterações no ângulo de contato de 82 º para cerca de 76 º, indicando que a superfície tornou-se menos hidrófoba quando previamente tratada com soluções de surfactina. Rodrigues e colaboradores (2006) também afirmaram que essas mudanças na hidrofobicidade em superfícies repercutem em uma diminuição substancial da adesão de bactérias, sendo este comportamento especialmente interessante para aplicações em áreas médicas.

Na Figura 15 apresentam-se os resultados de tensão interfacial (IFT) entre as soluções de biossurfactante (0, 1/2 CMC, CMC, 3x CMC) e dodecano a diferentes temperaturas (25, 45 e 65 ºC). A Análise de Variância (ANOVA) de duas vias indica que a concentração de biosurfactante afeta de forma significativa a tensão interfacial, sendo esta influência igualmente detectável a concentrações superiores a CMC. Por outro lado, de acordo com ANOVA, a temperatura (intervalo de 25 a 65 ºC) não exerce um efeito significativo sobre IFT.

Conforme o esperado, nos ensaios controle realizados com água destilada, obtém- se uma redução clara de IFT com o aumento de temperatura (Figura 15), efeito não observado em presença de biosurfactante. Neste sentido, Rosen (2004) destaca que o aumento de temperatura afeta a adsorção do agente de superfície nas interfases ar-líquido e líquido- líquido, podendo alterar a capacidade de diminuição da tensão interfacial por parte do tensoativo.

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Figura 15 - Valores de tensão interfacial (TI) obtidos a diferentes temperaturas e concentrações de biosurfactante bruto liofilizado produzido por B. subtilis ICA 56.

Resultados semelhantes ao obtidos neste trabalho foram relatados por outros pesquisadores. Deleu e colaboradores. (1999) obtiveram valores de tensão interfacial para soluções de 100 mg/L de surfactina frente a dodecano de 5 mN/m. Do mesmo modo, Pereira e colaboradores (2013) em estudos sobre produção de biossurfactantes por diferentes linhagens de Bacillus subtilis obtiveram resultados de tensão interfacial em torno de 5,0 mN/m ao utilizarem concentração de 1,0 g/L da solução de biossurfactante, enquanto para concentrações em torno de 20 mg/L, os resultados são semelhantes aos encontrados no presente estudo. Al-Bahry e colaboradores. (2013) realizaram medidas de IFT de soluções de biosurfactantes produzidos por Bacillus subtilis a diferentes temperaturas (40 a 100ºC), obtendo o mesmo comportamento observado neste trabalho.