A aplicação de biocatalisadores na indústria é objeto de muitas investigações, devido à alta atividade catalítica em comparação com os catalisadores convencionais, e ao fato de atuarem com alta eficiência em condições reacionais bastante suaves (DALLA-VECCHIA et al., 2004). Muitos processos industriais que empregam biocatalisadores necessitam que estes estejam presentes em graus de pureza elevados. A implementação do uso de enzimas na indústria pode ser dificultada devido aos problemas na purificação, tais como, separação dos debris celulares e elevado número de procedimentos necessários para a recuperação e purificação da proteína alvo. A purificação desejada depende geralmente do número de etapas envolvidas no processo e do uso a que se refere o produto final (LIMA, 2001).
O interesse crescente por processos de purificação de biomoléculas deve-se principalmente ao desenvolvimento da biotecnologia e à demanda das indústrias farmacêutica e química por produtos com alto grau de pureza. A complexidade de um processo de purificação depende da aplicação final da molécula que se pretende purificar, de suas características físico- químicas e também das características das impurezas presentes no meio. (PESSOA JÚNIOR; KILIKIAN, 2005).
Em um processo de purificação de proteínas o objetivo é separar a proteína de interesse a partir de um material biológico (celular) ou a partir de um bioprodutos, isolando-a de todo o material não proteico e de todas as outras proteínas. A remoção seletiva das proteínas contaminantes é a parte mais difícil de um processo de purificação, porque, muitas proteínas são semelhantes com relação às propriedades químicas e físicas. Em um caso ideal, onde foi possível remover as proteínas contaminantes, sem qualquer perda da proteína de interesse, claramente a quantidade total de proteína irá diminuir, enquanto a atividade biológica (o qual define a concentração específica da proteína de interesse) irá permanecer inalterada (DENNISON, 2003).
A recuperação e purificação de produtos biotecnológicos produzidos por células microbianas ou células de animais é um processo complexo, devido à baixa concentração da biomolécula no meio, que exige sempre concentração, e às variadas características dos cultivos empregados, da biomolécula de interesse e dos contaminantes presentes. (PESSOA JÚNIOR; KILIKIAN, 2005)
Para viabilizar a aplicação de enzimas em aplicações industriais são necessárias técnicas eficientes para o isolamento a partir de uma cultura de produção microbiana ou extratos vegetais/animais para satisfazer o grau de pureza desejado para o produto final. Processos tradicionais de purificação de proteínas compreendem tipicamente várias etapas com diferentes técnicas de concentração e purificação. Aumentar o número de operações de separação para melhorar o grau de pureza traz a redução da atividade da enzima em cada passo, pois será necessariamente acompanhado de alguma perda em cada passo, com aumento do custo do processo e consequentemente do produto final. A recuperação torna-se cada vez mais importante conforme o valor do produto purificado aumenta. Desta forma, existe necessidade de se obter alternativas eficientes para a purificação de enzimas com seletividade suficiente, recuperação máxima, alta preservação da atividade enzimática além de baixo custo. (LINKE; BERGER, 2011; LIMA, 2001).
A complexidade do processo de purificação depende da aplicação final da molécula que se pretende purificar e do grau de pureza necessário para essa aplicação, de suas características físico-químicas e também das características e concentração de impurezas. Para produtos como compostos orgânicos e algumas enzimas industriais cuja aplicação não requer alta pureza podem ser usados procedimentos mais simples de purificação com número reduzido de etapas. Produtos farmacêuticos, geralmente, são os que requerem maior grau de pureza, portanto um processo de purificação mais complexo deverá ser utilizado, sendo que seu custo pode chegar a 80% do custo final do produto (PESSOA JÚNIOR; KILIKIAN, 2005).
A escolha de um processo de purificação depende também da molécula alvo e da fonte de obtenção desta molécula. As características da molécula devem ser levadas em consideração, visando à manutenção de sua estrutura molecular e sua estabilidade nas diversas condições operacionais e procedimentos utilizados para sua purificação (ARRUDA, 1999).
Devido à grande diversidade de produtos biotecnológicos e suas diferentes características não há processos de purificação de aplicação geral. No entanto, a purificação pode ser dividida em quatro etapas genéricas: separação de células e seus fragmentos do meio de cultura (clarificação); concentração e/ou purificação de baixa resolução; purificação de alta
resolução e operações para armazenamento final do produto (polimento) (PESSOA JÚNIOR; KILIKIAN, 2005). A Figura 2.3 apresenta um fluxograma genérico do processo de purificação.
Figura 2.3 - Etapas de um processo genérico de purificação de biomoléculas
Fonte: Adaptado de Pessoa Júnior; Kilikian, 2005.
A clarificação remove os sólidos suspensos resultando na redução da turbidez do meio. Para produtos intracelulares é necessário efetuar o rompimento celular sob o aglomerado de células obtidas após a clarificação do meio de cultivo. Os produtos intracelulares liberados em solução tornam o processo de purificação mais difícil quando comparado a processos onde a molécula alvo é secretada para o meio. O rompimento celular ocasiona o aumento da viscosidade do meio, resultante da liberação de nucleotídeos, e a molécula alvo é liberada juntamente com todas as outras moléculas intracelulares, o que amplia a diversidade dos contaminantes (PESSOA JÚNIOR; KILIKIAN, 2005).
O Quadro 2.3 apresenta as operações unitárias empregadas nos processos de purificação viáveis em escala industrial, a etapa à qual pertencem e o princípio de separação da biomolécula alvo (PESSOA JÚNIOR; KILIKIAN, 2005).
Quadro 2.3 - Operações Unitárias do processo de purificação de produtos biotecnológicos Etapa do processo Operações unitárias Princípios
Clarificação
Filtração convencional Tamanho de partículas
Centrifugação Tamanho e densidade de
partículas
Filtração tangencial (membranas) Tamanho de partículas Floculação Hidrofobicidade de partículas
Rompimento de células
Homogeneização Cisalhamento
Ultra-som Cisalhamento
Moagem de moinho de bolas Cisalhamento Rompimento químico ou
enzimático
Hidrólise, solubilização ou desidratação de moléculas que compõem a parede ou a membrana celular
Purificação de baixa resolução
Precipitação Solubilidade
Ultrafiltração (membranas) Massa molar e raio hidrodinâmico de moléculas
Extração em sistemas de duas
fases líquidas Solubilidade, massa molar
Purificação de alta resolução
Cromatografia de troca -iônica Tipo e densidade de carga na superfície da biomolécula
Cromatografia de afinidade (biológica ou química)
Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção)
Cromatografia de imunoafinidade Sítios específicos da superfície de uma proteína (adsorção, antígeno/anticorpo) Cromatografia de interação hidrofóbica Hidrofobicidade Cromatografia de exclusão molecular Massa molar
Membranas adsortivas Massa molar e características para adsorção ou sítios específicos da superfície de uma proteína
Tratamentos finais
Cristalização Solubilidade e características de equilíbrio líquido-sólido
Liofilização Características de equilíbrio líquido-sólido
Secagem Características de equilíbrio
líquido-sólido Fonte: Adaptado de Pessoa Júnior; Kilikian, 2005.
As operações de concentração e/ou purificação de baixa resolução compreendem a separação da molécula alvo, por exemplo, uma proteína, em relação às moléculas com características físico-químicas significativamente diferentes, como água, íons, aminoácidos, ácidos nucleicos, polissacarídeos e lipídeos. Em processos de purificação de média resolução, a molécula alvo pode ser também ser separada de algumas proteínas com características físico-
químicas distintas. A purificação de alta resolução compreende a separação de classes de moléculas com características físico-químicas semelhantes, no caso, portanto, separação da proteína alvo de outras proteínas similares.