Polimeraz zincir reaksiyonuna dayalı markırlar 44

Polimeraz zincir reaksiyonu hücrede doğal DNA sentez mekanizmasının temel elementelerini kullanarak DNA’yı laboratuvar şartlarında bir test tüpünün içerisinde kopyalar. Bu nedenle PCR “DNA fotokopicisi” olarak da tabir edilir. Canlı bir hücrede genomun tamamının kopyalanmasına replikasyon adı verilir. Hücrede replikasyonun meydana gelmesi için çok sayıda farklı proteinden oluşan komplike bir sistem gerekmektedir.

Replikasyonda DNA’nın kendisinden yeni bir çift zincirli DNA oluşturması sırasında tek bir zincirine komplementer olarak adenine karşılık timin ve guanine karşılık daima sitozin çiftleşir. Ancak bu çiftleşmenin meydana gelmesi için ökaryotlarda öncelikle çift bağlı DNA molekülünün Topoizomeraz enzimleri tarafından açılıp bir çift tek zincir haline gelmesi gerekmektedir. Bununla birlikte bu açılma esnasında tekrar birleşmeyi önlemek için birkaç protein tek bir DNA zincirine bağlanarak DNA zincirlerini stabil hale getirir. Bu amaçla Helikaz proteini DNA çift zincirini A-T (çift bağ) ve G-C (üçlü bağ) arasındaki H bağlarını ATP’den enerji alarak kırar ve çift zinciri aralar. SSB (Single Strand Binding) proteinleri ise tek DNA zincirine bağlanarak zincire kararlılık kazandırır ve diğer zincirle birleşmesini önler. Bundan sonra açılan DNA zincirinin çeşitli bölgelerine komplementer RNA polimeraz enzimi tarafından sentezlenen 10-15 nükleotidlik DNA destek polimeri bağlanır. Ardından replikasyon mekanizmasında DNA zincirin uzaması aşaması başlar. DNA’nın biyosentezinde rol alan DNA Polimeraz III enzimi destek

polimerinin bağlandığı yerden itibaren kalıp DNA zincirine komplementer olarak nükleotidleri 5’-3’ yönünde fosfodiester bağlarıyla birbirlerine bağlamaya başlar. Diğer destek polimerinin bağlandığı bölgeye geldiğinde ise sentez durarak DNA Polimeraz III enzimi görevini Ligaz enzimine bırakır. Ancak bundan önce sentezi başlatan ve urasil nükleotidi içiren destek polimerleri DNA Polimeraz I enziminin ekzonükleaz aktivitesiyle nükleotidlerin tek tek sökülmesi ile uzaklaştırılır. Yerine tekrar komplementer DNA nükleotidleri takılır. Son aşamada ise okazaki birimleri arasındaki çentikler ökaryotlarda ATP eşliğinde Ligaz enzimi tarafından kapatılır. Oluşan yeni DNA zincirlerinden DNA semikonservatif olarak çoğalmaya devam eder (Tüzün, 2002; Klug ve Cummings, 2000; Cooper ve Hausman, 2006).

DNA Polimeraz III’ün imidazol halkasındaki azot, zincirin ucundaki nükleotidin 3’-OH ucundan H+ iyonunu kopararak nükleotidin nükleofilik gücünü diğer bir serbest nükleotidin fosfat ucuna bağlanması için artırır. Ancak zincirin ucundaki nükleotidin nükleofilik gücünün artması serbest bir nükleotid ile fosfodiester bağını oluşturması için yeterli değildir. Bu ekzotermik reaksiyonun gerçekleşmesi için gereken enerji 1 mol ATP’den sağlanır (Şekil 3.3) (Tüzün, 2002).

Polimeraz---N : + H-O-3’ Polimeraz---NH+ + -: O-3’

İmidazol halkasındaki azot Nükleofilik gücü zayıf Nükleofilik gücü yüksek

Replikasyonun her bir reaksiyon aşamasında:

dNTP + (dNMP)n → (dNMP)n+1 + P~P ΔG=-3.5 kcal/mol

Gerekli ilave enerji pirofosfatın hidrolizinden açığa çıkan enerjiden sağanır.

pirofosfataz

genom bölgelerinin çoğaltılması da yapılmaktadır. Dolayısıyla primerin spesifik olmaması DNA’nın rasgele çoğaltılmasını sağlamaktadır. Böylece çok sayıda DNA fragmenti elde edilmektedir. Tüm bu fragmentlere bakılarak üretimi yapılan DNA parçalarının bazı genotiplerde üretilip bazılarında üretilmediği gözlenmektedir. Bu işlem dağılım gösteren bir populasyona yapıldığında, ebeveynlere ait üretim motiflerine bakılarak döllerin analizi gerçekleştirilir (Welsh ve McClelland, 1990). Sonuç olarak, tek bir primerle PCR tekniğiyle çoğaltılmış bu DNA parçacıkları, elektroforez tekniğiyle agaroz jelde birbirinden ayrılırlar. Jel üzerinde elektriksel ortamda molekül büyüklüklerine göre ayrılan DNA parçacıkları daha sonra etidyum bromür ile boyanarak ultraviyole ışık altında görünür hale getirilir (Williams ve ark., 1990; Scott ve ark., 1992; Morgan ve ark., 1993; Rothuizen ve Wolferen, 1994). RAPD-PCR yöntemiyle elde edilen ve agaroz jelden elde edilen görüntüye RAPD profili adı verilir. Polimorfizm ise ilgili bantların bireylerde “var” ya da “yok” olma durumlarına göre belirlenir.

RAPD-PCR yöntemin en büyük avantajı, analiz edilecek olan organizmaya ait biyokimyasal ya da DNA dizi bilgisine ihtiyaç duyulmaksızın çok sayıda lokusun kısa sürede analiz edilmesidir. Kısa oligonükleotidlerin spesifik koşullar altında farklı birçok genomdan tekrarlanabilir çoğaltımların gerçekleştirebilmesi mümkün olduğundan, hemen hemen tüm organizmaların nanogram düzeyindeki genomik DNA’ları kullanılarak doğrudan polimorfizm belirleyecek evrensel primer panelleri oluşturmak mümkündür (Yeşbek, 2007). RAPD yönteminin diğer avantajları ise düşük miktarda DNA’ya ihtiyaç duyması, çabuk sonuç vermesi ve ucuz olmasıdır. Bununla birlikte polimorfizm oranının yüksek olması filogenetik haritalama için otomasyon programlarına uygulanabilirliğini sağlar. Ancak tekniğin bazı dezavantajları vardır. Bunlardan en önemlisi güvenilirliğinin sınırlı olmasıdır. Farklı laboratuvarlarda, farklı araştırmacıların elinde ve hatta bir ısısal döngü cihazından diğerine farklı sonuçlar elde edilebilmektedir. Bu dezavantajların bertaraf edilebilmesi için çalışmaların standart koşullarda yapılmasına özen gösterilmesi gerekmektedir.

RAPD markırları birçok amaçla kullanılmaktadır. Genetik haritaların oluşturulması, çeşitli amaçlarla yapılan sistematik, filogeni ve populasyon genetiği çalışmaları, bazı özel gen bölgelerini kontrol eden yerlerin tanımlanması, tohumların test edilmesi, varyasyon/hat tanımlanması, markır yardımlı seçilim ve bitki ıslahı

geliştirilmiştir. AFLP tekniği genomik DNA’nın restriksiyon enzimleri ile kesildikten sonra restriksiyon parçalarının seçici PCR ile çoğaltılması yöntemine dayanan bir tekniktir (Vos, 1995; Huys, 1996). Teknik üç basamaktan oluşmaktadır. İlk basamak, DNA’nın restriksiyon enzimleri ile kesilmesidir. Böylece aktif olan kesim uçlarına oligonükleotid adaptörler eklenir. Restriksiyon parçaları uygun primerler kullanılarak PCR ile çoğaltılmaktadır. Sonuç olarak oluşan bu yapışkan uçlara bağlanan primerlere komplementer olarak eşleşen oligonükleotid diziler kullanılır ve böylece PCR’da bu parçalar çoğaltılmış olur (Wang ve ark., 2006).

Bu metot kullanılarak, nükleotid dizisi bilinmeden restriksiyon parça kümeleri PCR ile çoğaltılarak görüntülenebilir (Şekil 3.9). Bu metot yüksek sayıda restriksiyon parçasının aynı anda özgül olarak çoğaltılmasına olanak sağlar. Aynı anda analiz edilebilir parça sayısı tespit edilen sistemin çözülebilirligine bağlıdır. Tipik olarak 50–100 restriksiyon fragmenti çoğaltılır ve denatüre poliakrilamit jellerde tespit edilir. Teknik DNA polimorfizmin tespiti için oldukça güçlüdür. Genellikle birbirine yakın türlerin karakter analizlerinde kullanılan AFLP sonuçları, günümüzde birbirine çok yakın akraba türlerinin tespiti, türlerin tanımlanması ve ayrımı, starter kültür analizleri, gıdalarda bozulmalara ve gastrointestinal enfeksiyonlara neden olan önemli mikroorganizmaların karakterizasyonlarında da kullanılmaktadır. Tür ve alt tür seviyesinde ayrım sağlayan bu tekniğin diğer DNA tiplendirme metotlarına kıyasla çok geniş bir alanı taraması, az miktarda işgücüne gereksinim duyması, tekniğin hızlı ve sonuçların kolay yorumlanabilmesinin analiz için az miktarda DNA gerektirmesi ile beraber ulaşılan bilginin oldukça fazla olması gibi avantajlarından dolayı kullanımı gün geçtikçe artmaktadır.

ISSRs (Tekrarlanan basit baz dizilimi arası): Teknik, 5’ ve 3’ ucunda bulunan kısa, tekrarlanan DNA zincirlerini primer (SSR primerleri) olarak kullanan ve PCR tekniğine dayanan bir yöntemdir (Zietkiewicz ve ark., 1994; Cingilli ve ark., 2005). Bu yöntemle genom üzerinde birbirine yakın olan SSR’ler arasındaki DNA dizileri çoğaltılır ve ortaya çıkan fragmentlerin uzunlukları karşılaştırılır. Teknikte hedef genomik DNA 3' ucundan birkaç tane farklı baz içeren mikrosatellit markırları ile çoğaltılmaktadır (Şekil 3.10). 3' ucunda primer olarak 2 ile 4 arasında değişen farklı veya aynı nükleotidlerin basit olarak tekrarlarından oluşan DNA zincirleri kullanılarak ISSR markırı elde etmek mümkündür. Bunlar, çoğunlukla dominant

arasında yüksek oranda korunmuş olmalarından dolayı, genellikle orta düzeyde polimorfizm gözlenebilmektedir. Ürünler arasında büyüklük farkının gözlenmediği durumlarda yine aynı restriksiyon enzimleri kullanılarak polimorfizm saptanabilmektedir (Talbert ve ark., 1994). STS yöntemi RFLP’ye göre daha kolay, daha ucuz ve hızlıdır. Çoğunlukla kodominant özellikte markır üretmektedir. Bununla birlikte RAPD yönteminde olduğu gibi az miktarda DNA gerektirir ve otomasyona uygundur. Ancak polimorfizm oranının orta seviyede olması tekniğin en önemli dezavantajlarındandır (Walton, 1993). Ayrıca ilgili RFLP probunun nükleik asit dizilişinin bilinmesini ve buna göre bir primer geliştirilmesini gerektirir.

SNP (Tek nükleotid polimorfizmi): SNP’ler en yaygın olarak görülen DNA polimorfizmleridir. İnsanlarda yaklaşık üç milyon SNP olduğu bilinmektedir (Russell, 2001). Buğday genomunda bu sayı her 1/370 bç ile 1/540 bç arasındadır (Procunier ve ark., 2003; Somers ve ark., 2003). Bazı populasyon ya da populasyonlardaki normal bireylerde bulunan ve genomik DNA üzerinde farklı dizi alternatifleri (allel) olarak tanımlanan tek nükleotid değişiklikleridir. Bu allel frekansının dağılımı en az %1 ve daha büyüktür (Brookes, 1999). Bazı araştırmacılar tek nükleotid substitüsyonlarını yaygın olarak SNP adı altında sınıflandırsa da, SNP’ler tek nükleotid insersiyon ya da delesyonları değildir. Teorik olarak her bir nükleotid pozisyonunda dört allel (dört farklı nükleotid oldugu için) bulunabilir (Şekil 3.11), ancak pratikte kural olarak sadece iki allel vardır (Brookes, 1999). Başka bir deyişle SNP markırları, eşit olmayan (unequal) nükleotid transisyon (A-G, T-C) ve transversiyonları (A-C, A-T, G-C, G-T) olarak tanımlanan biallelik markırlardır. Multiallelik markırların aksine biallelik olan SNP markırları tamamen otomatize edilebilir ve DNA’nın mikroarraylara uygulanması ile aynı anda birkaç bin SNP analizi yapılabilir. Modern tekniklerin kullanılmasıyla, SNP analizlerinin etkinliği diğer DNA analiz yöntemlerine göre birkaç misli artırılmış olur (Khlestkina ve Salina, 2006).

cDNA’lar mRNA’lardan elde edildikleri için belirli şartlarda ya da gelişimin farklı aşamalarında ifade edilen genlerin incelenmesine olanak sağlar. EST’ler, fonksiyonel genlerin segmentleridir. EST’ler yeni genlerin keşfi, genom haritalanması, genomik sekanslardaki kodlayıcı bölgelerin tanımlanması, gen ekspresyonu ve regülasyonu ile ilgili veri elde edilmesi için hızlı ve ucuz bir yol sunarlar.