DNA izolasyonu 123

Bitkilerin moleküler düzeyde tanımlanması amacıyla kullanılan tüm moleküler teknikler DNA izolasyonuna dayanır. Bu tekniklerin doğru, hassas ve tekrarlanabilir

sonuçlar vermesi gerek yaş, gerek kuru gerekse fosil yapraklardan DNA’nın uygun miktar ve kalitede izole edilmesine bağlıdır (Puchooa ve Khoyratty, 2004; Deshmukh ve ark., 2007; Joshi ve ark., 2004). Ancak bitkilerde bulunan yüksek polisakkarit miktarı DNA izolasyonlarını zorlaştırmaktadır. Çünkü polisakkaritler izolasyon esnasında DNA sarmalına yapışarak DNA ile birlikte çökmekte ve çözünmesini engellemektedirler (Kaufman ve ark., 1999). Bunun yanında polisakkaritler moleküler analizlerde kullanılan pek çok enzimi inaktive ederek DNA’nın enzimlerce işlenmesini engellemektedir. Ginkgo biloba yapraklarına antioksidan özellik sağlayan birçok ikincil metabolit (polifenol, flavonoid ve tanen) yine polisakkaritler gibi başarılı bir DNA izolasyonu engelleyerek enzim aktivitelerini inhibe etmektedir (Michaelis ve ark., 2008; Wulff ve ark., 2002). Bununla birlikte bu yapılar elde edilen DNA’nın saklanması sırasında zamanla DNA’yı degrade etmektedirler (Asif ve Cannon, 2005). Bu nedenle izolasyonda tüm bu bileşikleri kimyasal olarak bağlayarak DNA’yı bu yapılardan saf bir şekilde ayıran ve ayırıken de DNA’nın biyokimyasal yapısına zarar vermeyen reaktifler kullanılmalıdır. Bitkilerden kaliteli ve saf bir DNA izolasyonu için uygulanan metotlar bitki türüne ya da yaprak, meyve ve tohum gibi bitkilerin doku tiplerine bağlıdır. Ayrıca DNA izolasyonu örneğin yaş, kuru ve fosil olması gibi yaprağın yaşına da bağlıdır. Başarılı bir DNA izolasyonunun ölçütü DNA’nın çeşitli restriksiyon enzimleriyle kesilmesi, polimeraz zincir reaksiyonuyla çoğaltılması ya da ligazlarla etkileşime girebilmesi ile kontrol edilebilir (Manen ve ark., 2005). Bitkinin türüne göre izolasyonlarda kullanılan kimyasallar da hem miktar hem de yapı olarak farklılık gösterir. DNA izolasyonunda kullanılan kimyasallardan CTAB (setiltriamonyum bromid), SDS’le (sodyum dodesilsülfat) birlikte hücre duvarını parçalandıktan sonra DNA’nın seçici olarak hücredeki organellerinden ayrılmasını sağlarken, PVP (polivinil propilen), DNA izolasyonu esnasında hücre çekirdeğinden ayrılan ve hücrenin diğer yapıları ile bir arada bulunan polifenolik yapıları kimyasal olarak bağlar (Angeles ve ark., 2005). β-merkaptoetanol protein yapılarındaki disülfit bağlarını kırarak proteinlerin DNA’dan ayrılmasını kolaylaştırır. EDTA hücre içinde bulunan DNA nükleazların kofaktörü olan Mg+2 ile kompleks oluşturarak enzimleri inhibe eder. Sezyum klorit ise DNA’yı temizlemek amacıyla kullanılmaktadır (Çalışkan, 2005). Ginkgo biloba ve Ekinezya gibi yüksek fenolik bileşiminden dolayı antioksidan özellik gösteren bitkilerden bu fenolik yapılarından PVP ile uzaklaştırılması şarttır. Aksi takdirde DNA’yı saklama esnasında fenolikler degrade ederek DNA kaybına sebep olurlar. Bununla birlikte DNA izolasyonu sonrasında genomu tanımlamaya yarayan moleküler

tekniklerden polimeraz zincir reaksiyonunun temel bileşeni Taq DNA Polimeraz ile HindIII, EcoR1 ve MspI gibi DNA’yı belirli dizilerinden keserek türler arası polimorfizmi tanımlayan restriksiyon endonükleazları inhibe eder. Eğer bitki fenolik yapılarca zengin bir tür değilse PVP kullanımına gerek yoktur. Yine yüksek polisakkarit yapılı bitkilerden DNA izolasyonunda CTAB kullanımı oldukça yaygındır. Yapılan bazı çalışmalarda CTAB metotu ile gerek çam, meşe, kayın ağacı gibi çok yıllık bitkilerde gerekse semiz otu, lahanagiller, gül yaprakları gibi tek yada iki yıllık bitkilerde saf, kaliteli ve yüksek miktarda DNA elde edildiği kanıtlanmıştır (Michiels ve ark., 2003; Jitu ve Kr, 2008).

Çeşitli reaktifler kullanmanın yanında hücre duvarını parçalama ve organelleri uzaklaştırma gibi işlemler de fiziksel etkide kullanılmaktadır. Özellikle bitki eksplantını kuru buz içinde sıvı azotla dondurarak ya da sıcak tamponla havanda ezerek yapılan işlemlerde hücre içi madde ve organeller uzaklaştırılabilir. Ancak hücre içi sıvılar bu ezme esnasında müsilaj bir yapı oluştururlar. Bu yapı santrifüjleme ile uzaklaştırılabilir (Hanania ve ark., 2004). Bu işlemden sonra fenol-kloroform ekstraksiyonu ve jel filtrasyonu gibi saflaştırma işlemleri gerekmektedir. Yapılan son çalışmalar ve üretilen kitler, DNA’nın magnetik beadler üzerine immobilizasyonunu sağlayarak DNA’nın diğer biyokimyasal yapılardan hızlı bir şekilde ayrılmasını sağlar (Xu ve ark., 2005). DNA’nın oluşturduğu sarmal yapıda bulunan histon proteinlerini ayırmada fenol- kloroform ekstraksiyonundan faydalanılmaktadır (Skujiene ve Soroka, 2003). Bu organik çözücüye geçen DNA ise soğuk izopropanolle çöktürülerek saflaştırılır. Elde edilen DNA’ya etil alkol yıkaması yapılarak saflığı artırılır (Hill-Ambroz ve ark., 2002). Biyokimyasal yapıların uzaklaştırılmasında zaman zaman Proteinaz K, lizozim ve RNAaz gibi enzimlerden de faydalanılır (Puchooa ve Khoyratty, 2004). Ancak tüm bu fiziksel işlemler esnasında DNA yapısında kırılmalar meydana gelebilir. Bu kırıklar daha sonra DNA’ya uygulanacak moleküler tekniklerden elde edilen sonuçları değiştirmektedir (Fu ve ark., 2004).

Bu çalışmada Ginkgo biloba’nın taze, kurutulmuş ve birkaç yıllık kuru yapraklarından DNA izolasyonu, tüm bu izolasyon şartları baz alınarak manuel olarak ve son yıllarda kullanımı oldukça fazla olan magnetik yapılara dayalı kitlerle otomatik olarak gerçekleştirilmiştir.

Manuel DNA izolasyon metotu:

Bu çalışmada tür içi ya da türler arası gen polimorfizmini belirlemek amacıyla gerçekleştirilen RAPD-PCR analizi için uygun miktar ve saflıkta DNA elde edebilmek amacıyla Doyle ve Doyle (1987;1990) yöntemi bazı modifikasyonlar yapılarak kullanılmıştır. Pek çok farklı bitki türüne uygulanan CTAB metotu ile yaş yapraktan, fosil yaprağa, bitki tohumundan çiçek kısmına kadar bitkilerin pek çok kısmından DNA izolasyonu başarılı bir şekilde gerçekleştirilmektedir (Michiels ve ark., 2003). Yöntemde yapılan değişiklikler, elde edilen DNA miktarının korunarak, PCR aşamasında enzim aktivitesini engelleyen ikincil bileşiklerin ve kimyasalların temizlenmesi amacıyla yapılmıştır. İkincil bileşikler özellikle Ginkgo biloba gibi antioksidan özellik gösteren ve bitkisel ilaç olarak kullanılan bitkilerde yüksek miktarda bulunmaktadır (Pirttilä ve ark., 2001; Deshmukh ve ark., 2007). Bu nedenle PVP Ginkgo biloba’nın yapısında bulunan kateşin, kaffeik asit, rutin ve kuersetin gibi miktarları HPLC analizi ile de belirlenmiş ve DNA ekstraksiyonunu olumsuz yönde etkileyen fenolik bileşiklerin uzaklaştırılmasında kullanılmıştır. SDS hücre duvarını parçalanması ve CTAB polisakkaritelerin DNA’dan ayrılmasını sağlamıştır. β- merkaptoetanol proteinlerin disülfit bağlarını kırarak DNA’dan ayrılmalarını kolaylaştırmıştır. 2 aşamalı yürütülen izolasyonda 2. aşama DNA saflığını artırmak amacıyla gerçekleştirilmiştir. RNAaz ise DNA ile birlikte izole edilen hücrenin bir diğer nükleik asidi olan RNA’nın parçalanması amacıyla kullanılmıştır. Yine izolasyon esnasında gerçekleştirilen fenol-kloroform ekstraksiyonu DNA’nın proteinlerden özellikle de histon proteinlerinden tamamiyle ayrılması için proteinlerin denature olmalarını sağlamıştır. Son aşamada gerçekleştirilen alkol yıkaması ise gerek hücreden gelen gerekse izolasyon esnasında kullanılan reaktif ya da enzim çözeltilerinden gelen kirlilikleri ya da safsızlıkları giderme amacıyla yapılmıştır. Elde edilen saf DNA Tris- EDTA tamponunda çözülerek sonraki aşamalar için kullanıma hazır hale getirilmiştir. DNA çözeltileri -20oC’de saklanmıştır (Mbogori ve ark., 2006).

Çizelge 6.13. Ginkgo biloba DNA’larının miktar ve saflık dereceleri

Orijin Türler

Manuel metot (CTAB) Otomatik metot (EZ1) DNA miktarı μgmL-1 _A 260/280 A260/230 A320 DNA miktarı μgmL-1 _A 260/280 A260/230 A320 Türkiye Taze 780 1,89 2,30 0,001 1150 1,95 2,20 0,000 Kurutulmuş 775 1,86 2,42 0,001 1112 1,74 2,25 0,001 Kuru 710 1,74 2,53 0,003 934 1,80 2,31 0,002 Almanya Taze 790 1,81 2,35 0,001 1062 1,81 2,25 0,000

Bu çalışmada kullanılan Qiagen izolasyon kiti de 20 dakika gibi kısa bir sürede DNA’nın silika beadlere tutunması sağlanarak saf bir şekilde izole edilmiştir. Bu metotla hem yaş hem kurutulmuş ve hem de kuru bitki yaprağından yüksek kalite ve konsantrasyonda DNA izolasyonu gerçekleştirilmiş ve sonraki DNA’nın sonraki moleküler tekniklerle işlenmesini sağlamıştır. Metot yalnızca hücre duvarının parçalanarak DNA ve diğer hücre içi organellerin tampona geçişini sağlayan ön aşamasında bitkinin yaşına göre protokol farklılıkları göstermiştir. Bu amaçla kuru yaprakların kitin G2 adlı tamponunda 65oC’deki inkübasyon süresi yaş ve kurutulmuş Ginkgo biloba yapraklardan daha uzun sürmüştür. Yaş ve kurutulmuş yaprak 65oC’de 16 saat ve kuru yapraksa 24 saat tamponla inkübe edilmiştir.

DNA konsantrasyonu ve saflığının belirlenmesi:

DNA konsantrasyon ve saflığının belirlenmesinde spektrofotometrik bir metot kullanılmıştır. Nükleotidlerin heterosiklik halkaları 260 nm dalga boyunda maksimum absorbans vermektedir. Lambert Beer yasasına göre nükleik asitlerin (DNA ve RNA) konsantrasyonundaki artışla doğru orantılı olarak 260 nm’de vermiş oldukları absorbsiyon artmaktadır. DNA miktarı aşağıdaki eşitlikten absorbsiyona bağlı olarak hesaplanmıştır. Buna göre;

DNA (μgmL-1) = 260 nm'deki Absorbans x sulandırma oranı x 50

Absorbansın 1 değeri çift iplikli DNA için 50 μgmL-1, tek iplikli DNA veya RNA için 40 μgmL-1 ve oligonükleotidler için 20 μgmL-1'ye karşılık gelmektedir. Her bir bitkiden izole edilen DNA miktarı Çizelge 6.13’te verilmiştir. DNA miktarları 780- 1150 μgmL-1arasında bulunmuştur. Her bir DNA RAPD-PCR reaksiyonları için 50 ng’a seyreltilmiştir.