Doğal antioksidanların en önemlileri fenoller, polifenoller ve bunların türevleridir. Fenolik bileşikler; kimyasal yapıları basit bileşiklerden yüksek polimerleşmiş maddelere kadar çeşitlenebilen bitkisel maddelerdir (Winkel-Shirley, 2001). Bu bileşiklerin pek çoğu bitkilerin ikincil metabolitleri olup bitkilerde bazı enzim katalizli reaksiyonlarla üretilirler. Ancak bu doğal antioksidanların bitkilerdeki varlığı bitkiden bitkiye farklılık göstermektedir. Bitkinin genomik yapısına bağlı olarak sentezlenen enzimler ile doğrudan ilişkili olan antioksidan yapılar genomdaki değişikler nedeniyle yapı ve miktarlarında değişiklik gösterirler. Örneğin, fenil alanin, fenil alanin liyaz (PAL) enzimi tarafından sinnamik aside, sinnamik asit ise bitki metabolizmasında sinnamik asit-4-hidroksilaz (C4H) tarafından
hidroksillenerek p-kumarik aside dönüştürülür (Winkel-Shirley, 2001). Tüm bu
enzimler antioksidan özellik gösteren ikincil metabolitlerin biyosentezinde yer alırlar. Flavonoid metabolizması olarak adlandırılan bu metabolik yolda daha pek çok enzim yer alır. Bitkilerin genomik yapılarına bağlı olarak bu flavonoid yolun enzimlerinin sentezi bitkiden bitkiye değişir. Buna bağlı olarak bu enzimlerin substratları olan fenolik yapılar varsa bile eğer enzim yoksa bir başka fenolik yapıya dönüşümü gerçekleşemez. Bu nedenle fenolik yapılar da bitkiden bitkiye farklı dağılım gösteririrler. Bu farklılık ise antioksidan aktivite düzeyinde tanımlanabilir (Winkel-Shirley, 2001). Sentezlenen fenolik yapıya bağlı olarak bitkiler oksijen konsantrasyonunu düşürebilir veya singlet oksijeni inaktif hale getirebilirler. Hidroksil radikalleri gibi birincil radikalleri inhibe ederek zincir reaksiyonlarının başlamasını önlerler ya da metal iyon katalizörlerini bağlarlar (Gulcin, 2008).
Antioksidanlar bitkisel bazı gıdalarda doğal olarak bulundukları gibi, gıda sanayisinde ürünlerin kalitesini korumak ve besinsel değerlerini muhafaza etmek amacıyla sonradan eklenirler. Besinlerin acılaşmasını ve çürümesini geciktirici özelliğe sahiptirler. Özellikle yağlarda, havadaki oksijenin sebep olduğu otooksidasyonu yavaşlatmak için kullanılmaktadırlar. Böylece yağların, tadını, kokusunu, rengini yani kalitesini ve raf ömrünü uzatırlar. Antioksidanlar ortamda çok az miktarda bulunsalar bile etkin olan maddelerdir.
Bitkilerde sentezlenen bu doğal antioksidanların çoğu fenolik bileşikler ve bunların oksijenle substitue olmuş halleridir. Doğal antioksidanların temel bileşeni olan basit fenolikler benzen halkasının orto, para ya da meta konumlarına hidroksil grubunun bağlanması ile oluşmaktadırlar. Basit fenolik maddeler bu konumlardaki substitue gruplara bağlı olarak çeşitlilik gösterirler (Andersen ve Markham, 2006). Basit fenolik yapıların dışındaki polifenolikler ise fenolik yapıların polimerleşmesi sonucu oluşurlar. Harborne ve Simmonds, 1964’te moleküldeki karbon sayılarına bağlı olarak bu bileşikleri sınıflandırmıştır (Andersen ve Markham, 2006) (Çizelge 2.4).
Çizelge 2.4. Bitkilerde bulunan fenolik bileşiklerin sınıflandırılması
Yapı Sınıf C6 Basit fenolikler
C6-C1 Fenolik asitler ve türevleri
C6-C2 Asetofenonlar ve fenilasetikasitler C6-C3 Sinnamik asit, sinnamik aldehit ve Sinnamil alkoller
C6-C3 Kumarinler, izokumariler ve kromonlar Kalşonlar, auronlar, hidrokalşonlar Flavanlar Flavonlar C15 Flavononlar Flavonoller Antosiyanidinler Antosiyaninler C30 Biflavoniller
C6-C1-C6 , C6-C2-C6 Benzofenonlar, ksantonlar, stilbenler C6, C10, C14 Kininler
C18 Betasiyaninler
Lignanlar, neolignanlar Dimerler ya da oligomerler Ligninler Polimerler
Tanninler Oligomerler ya da polimerler Filobafenler Polimerler OH OH O OH OH O OH O H OH OH O OH (a) (b) (c)
Şekil 2.3 (a) p-hidroksibenzoik asit, (b) gallik asit, (c) protokateşik asitin molekül yapıları
OH OH O OH OH OH O OMe OH OH O OMe (d) (e) (f)
Şekil 2.3 (d) salisilik asit, (e) vanilik asit, (f) vanilinin molekül yapıları
OH O OH O OH O H (a) (b)
Şekil 2.4 (a) 2-hidroksiasetofenon (b) 2-hidroksifenilasetik asitin molekül yapıları
Bitkilerde bulunan en basit fenolik yapılı bileşikler fenolik asitlerdir. Bir fenole bir karboksilik asit grubunun bağlanmasıyla oluşan yapılara örnek olarak p- hidroksibenzoik asit (Şekil 2.3.a), gallik asit (Şekil 2.3.b), protokateşik asit (Şekil 2.3.c), salisilik asit (Şekil 2.3.d) ve vanilik asit (Şekil 2.3.e) gibi bileşikler verilebilir. Bununla birlikte vanilin (Şekil 2.3.f) gibi fenol halkasının üzerinde karboksil grubu yerine aldehit taşıyan hidroksibenzoik asit aldehitler de mevcuttur (Andersen ve Markham, 2006).
. Fenonlar, C6-C2 bileşikleridir. Doğada nadiren bulunan 2-hidroksiasetofenon (Şekil 2.4.a) ve 2-hidroksifenilasetik asit (Şekil 2.4.b) gibi bileşikler fenon bileşiklerine örnek olarak verilebilir. C6-C3 iskeletinde altı farklı molekül bulunur. Bu yapılardan en az üçü tüm bitkilerde bulunur. Bunlar sinnamik asit (Şekil 2.5.a), p- kumarik asit (Şekil 2.5.b), kaffeik asit (Şekil 2.5.c), ferulik asit (Şekil 2.5.d), 5- hidroksiferulik asit (2.5.e) ve sinapik asittir (Şekil 2.5.f). Sinnamik asidin esterleri
şeker esterleri olarakta bulunur. Örneğin, sinapoli esterlerden Brassicaceae ailesindeki UV ışığı absorplayan sinapoli malat, yapraklarda ve sinapoli kolin ise köklerde bulunur (Ruegger ve Chapple, 2001). Flavonoidler, bitkilerde doğal yollardan oluşan fenolik yapılardan 15 karbonlu olanlardır. Doğal olarak bitkilerin gövde, tohum, yaprak, kabuk, çiçek ve köklerinin epidermal hücrelerinde glikozidik (glikozitler) ya da glikozit olmayan (aglikan) formda bulunurlar (Andersen ve Markham, 2006). OH O O OH OH OH O OH OH (a) (b) (c) OH O OH OMe OH O OH O H OMe OH O OH OMe MeO (d) (e) (f)
Şekil 2.5 (a) sinnamik asit (b) p-koumarik asit, (c) kafeik asit, (d) ferulik asit, (e) 5-
hidroksiferulik asit, (f) sinapik asitin molekül yapıları
Flavonoidler, C6-C3-C6 temel yapısında iki aromatik halka ve üçüncü bir
aromatik halka ya da alifatik gruptan oluşur. Bu halka ya da alifatik grupların her biri bir numaralandırma sistemiyle numaralandırılarak A, B ve C olarak adlandırılır. Bu karbon atomlarının A ve C halkaları için normal rakamlar kullanılırken, B halkası
için “üslü” rakamlar kullanılır. A halkası üç tane malonil-CoA molekülünden B halkası ise p-kumaril-CoA’dan oluşmaktadır. Pek çok flavonoidin A halkası hem meta-dihidroksi hem de meta-trihidroksiden oluşmaktadır. Flavonoidlerde A halkasının meta-hidroksil gruplarından biri 6 halkalı heterosiklik yapıya oksijeni katar. Bu yapılar piran, pirilyum ya da piron halkalarıdır. B halkası ise mono- hidroksi, orto-dihidroksi, ya da vic-trihidroksidir. B halkasında sustituent olarak metileterler bulunur (Andersen ve Markham, 2006). İki fenil halkanın difenilpropan zinciri ile birleşmesi sonucu oluşan flavonoidlerin fenil halkalarının propan zincirine farklı pozisyonlardan bağlanması nedeniyle flavonoidler alt sınıflara ayrılır (Rice- Evans ve ark., 1997).
Çiçeklerde bulunan sarı pigmentler butein ve benzeri kalşonlardır. Ploridzin (piloretin-2′-O-D-glukosit) kırmızı elmanın yapraklarında bulunan bir dihidrokalşondur ve antitümor aktivite gösterdiği bilinmektedir (Nelson ve Falk, 1993). Auronlar, meta-hidroksi gruplarının α-karbon ile reaksiyonu sonucu meydana gelen yapılardır. Genel olarak kalşonların halkalaşması sonucu oluşurlar. Auronlar da çiçeklerde bulunan sarı pigmentlerdir. Flavanonlar, yapılarında bir keton grubu içerirken doymamış bir karbon-karbon bağı ihtiva etmezler. Temel flavanon iskeletinin keton grubunu alması, onu bir "-on" yapmaktadır. A ve B halkalarının substitue olması ile naringenin oluşturarak flavonların analoglarını oluştururlar (Şekil 2.6 ve 2.7). Çoğu flavanon turunçgillerde glikosit olarak; örneğin, hesperitin (aglikon) ve hesperidin (glikozit) olarak naringeninle birlikte bulunurlar (Halliwel ve Gutteridge, 1990; Hudson, 1990; Andersen ve Markham, 2006).
O H OH OH O O
A
C
B
7 8 9 10 5 6 1 4 3 2 1' 2' 3' 4' 5' 6'Flavanoller, genel olarak dihidroflavonoller olarak bilinirler ve çoğunlukla taninlerle birlikte bulunurlar. Önemli bir flavonol olan taksifolin, dihidrokuersitin olarak bilinir (Şekil 2.8). Flavonlar, doymamış bir karbon-karbon bağı ve bir keton grubu ihtiva eder. Doğada en çok bulunan flavonlar kaempferol (5,7,4′ hidroksiflavon), kuersetin (5,7,3′,4′ hidroksiflavon), ve mirisetin (5,7,3′,4′,5′ hidroksiflavon)’dir. Çoğu, tıbbi bitkide ve pek çok sebze ve meyvede yaygın olarak bulunur. Diğer bir flavon ise kırmızı biberde bulunan luteolindir. Biflavoniller, C30 iskeletine sahiptirler. Apigenin ya da metilenmiş türevleri flavonların dimerleridirler. Bu gruba ait yalnızca birkaç bileşik vardır. Bunlardan en önemlisi Ginkgo biloba’da bulunan ginkgetindir.. O O H O OH OH
Şekil 2.7. Naringeninin molekül yapısı
O O H O OH OH OH OH
Şekil 2.8 Dihidrokuersitinin molekül yapısı
Antosiyanidin ve Antosiyaninler, flavan çekirdeğine çok benzerler. Bir farkı; üzerindeki oksijenin pozitif yüklü olması ve karbon halkasında ikili bağın olmasıdır. –OH gruplarının, şeker gruplarının ve diğer fonksiyonel grupların sayısına ve pozisyonlarının değiskenliğine göre çok farklı türde antosiyanidin ve antosiyanin vardır. Bunların bazılarına başka flavonoid moleküllerinin de bağlı olması nedeniyle
oldukça komplike yapıya sahiptirler. Proantosiyanidinler, önemli antioksidanlardan olup bu grup flavanoller olarak bilinen antosiyanidin polimerleridir. Asitle parçalandığında proantosiyanidinler, siyanidin gibi antosiyanidinler verirler.
3. GENETİK MARKIR
Moleküler markır (belirteç) ile genomda herhangi bir gen bölgesi ya da gen bölgesi ile ilişkili biyolojik etkisi olmayan ve sonraki nesillere aktarılan DNA parçası temsil edilmektedir (Bovenhuis ve Meuwissen, 1996). Moleküler markır yöntemleri DNA molekülündeki polimorfik bölgelerin saptanması prensibine dayanır. Moleküler markırlar görünür özelliklere dayanan morfolojik markırlardan ve genlerin ürünü olan proteinlere dayanan biyokimyasal markırlardan farklı olarak DNA düzeyindeki analizlerle saptandıklarından dolayı DNA markırları olarak bilinirler. DNA markırları aynı veya farklı türlere ait bireyler arasındaki farklılıkları ortaya koyabilirler ancak (polimorfik DNA markır) genotipler arasındaki farklılıkları ayırt edemeyebilirler (monomorfik DNA markır).
Bu markırlar DNA molekülündeki polimorfik bölgelerin çoğaltımındaki farklılığı saptamak amacıyla çeşitli tipteki primerlerin ve PCR yönteminin kullanımına dayanır. Ancak nükleik aside dayalı genetik markırların belirlenebilmesi için öncelikle markır olarak kullanılacak biyolojik materyalin hücreden saflaştırılması gerekmektedir. Saflaştırılan DNA, protein ya da enzim daha sonraki aşamalarda amaca göre çeşitli yöntemler uygulanarak analiz edilir. Böylece nesilden nesile aktarılan genlerin mutasyon, modifikasyon ya da doğal seleksiyon nedeniyle zaman içerisinde uğradığı değişikliklerin yol açtığı tür ayrımlarının ve filogenetik akrabalıklarının tanımlanarak türlerin taksonomik olarak sınıflandırılması ile soyağacı analizleri ve bağlantı haritalarının tanımlanması yapılabilir. Çünkü kromozom üzerinde yer gösteren küçük bir DNA parçası, gen veya genin bir parçası ya da genler arasındaki bir DNA dizilimi bir tür içerisindeki bireyler arasında farklılık gösterir. Bu farklılık yalnızca genom düzeyinde kalmaz. Transkripsiyon ve translasyon mekanizmalarında meydana gelen değişikliklerle RNA ve protein ekspresyonlarında değişikliklere dolayısıyla morfolojik karakterlerde değişikliklere neden olur. Bu nedenle protein, enzim ya da morfolojik özellikler de genetik markırlar olarak ifade edilir. 1900 yılının başlarında geliştirilmeye başlanan moleküler markırlar (Welsh ve McClelland, 1990; Williams ve ark., 1990) polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) geliştirilmesinden sonra büyük bir ivme kazanmıştır (Şekil 3.1).