Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)

DNA izolasyonundan sonra mtDNA’nın CO1 (Sitokrom oksidaz alt ünite 1) ve nDNA’nın APOB (Apolipoprotein B) olmak üzere iki gen bölgesi uygun primerlerin kullanıldığı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) yöntemi ile çoğaltılmıştır. PZR ile, saflaştırılmış olan DNA molekülünün seçilen bir bölgesinin hücre dışı koşullarda çoğaltılması sağlanır. PZR işleminde, distile su (dH2O), özgün oligonükleotidler (primerler), deoksinükleotid trifosfatlar (dNTP), Taq DNA polimeraz enzimi, MgCl2, tampon çözelti (Tris-HCl) ve çalışılacak örneğin kalıp DNA’sı gibi bileşenler kullanılır.

Denatürasyon, bağlanma ve uzama olmak üzere 3 basamaktan oluşan bir döngüsel reaksiyonun 25-40 defa tekrar etmesi ile kalıp DNA dizisinden milyonlarca yeni kopya meydana gelir.

İlk basamak olan denatürasyon aşamasında DNA molekülünün iki ipliğini bir arada tutan hidrojen bağları kırılır. Bu olay sıcaklık 92-95 °C’ye yükseltilip 1-2 dakika tutularak gerçekleşir. Eğer gerekli görülürse 5-10 dakikalık bir ön denatürasyon aşaması uygulanabilir. Bağlanma aşamasında ise, primerlerin bağlanması için uygun sıcaklık olan 37-56 °C’ye kadar azaltılır ve primerlerin denatüre olmuş DNA ipliklerine bağlanması sağlanır. Uzama aşamasında sıcaklık Taq polimeraz enziminin çalışması için en uygun sıcaklığa 72 °C’ye yükseltilerek ortamda serbest halde bulunan deoksinükleotid trifosfatların kalıp DNA ipliklerine bağlanması sağlanır ve bu döngü 25-30 kez tekrarlanır. Ayrıca, daha fazla DNA kopyası elde edebilmek için döngü süreci bitince yine uzama ile aynı sıcaklıkta son uzama gerçekleştirilebilir.

Sonuçta istenilen başlangıç DNA molekülünün çok sayıda kopyası elde edilmiş olur. Bu aşamalardaki sıcaklık değerleri, kullanılan primer ve malzemelere bağlı olarak optimize edilebilir.

3.2.1 PZR bileşenleri

PZR işleminde karışım ortamını oluşturmak için distile su kullanılmıştır. MgCl2 ise denatürasyon aşamasında açılan zinciri primerlerle doldurmakta, PZR ile elde edilen DNA’nın spesifikliğini, primer ile dimerleşmeyi, enzimin aktifliğini etkilemektedir.

MgCl2 derişiminin az olduğu PZR karışımında, Taq DNA Polimeraz’dan alınan verimi

düşürebilirken, yüksek olduğu durumlarda ise spesifik olmayan bölgelerin çoğalmasına sebebiyet verebilir (Innis ve Gelfand 1990, Hadidi vd. 1995).

Tris-HCl / KCl tamponu, karışıma ilave edildiğinde, bağlanma işleminin daha rahat gerçekleştirilmesine olanak sağlayan kimyasal görevi görmektedir (Innis ve Gelfand 1990, Demeke ve Adams 1992, Henson ve French 1993).

Deoksinükleotittrifosfat (dNTP) bileşenleri (Adenin, Guanin, Sitozin, Timin) ise, karışımda homojen miktarlarda dağılış gösterdiği durumlarda başarılı sonuçlar almak mümkün olabilmektedir. Bir PZR karışımında, yüksek dNTP derişimi, elde edilen PZR ürünlerdeki DNA dizilerinin istenmeyen bölgelerde çoğalmasına sebebiyet verebilmektedir. Bahsedilen durum itibariyle, mümkün olduğunca düşük derişime sahip dNTP karışımı kullanmak, PZR’nin özgüllüğü ile doğru bölge çoğaltılma hassasiyetini arttırır.Primerler, çoğaltılacak bölgeye özgü sentezlenen veya var olan nükleotit dizilerinden oluşan kimyasal materyallerdir. Primerlerin, reaksiyona hazır olan DNA zincirlerine yapışması için ihtiyaç duyduğu sıcaklık ve zaman aralığı, primerlerin derişimi, elde edilmesi beklenen DNA’nın uzunluğu ve kullanılan bazların dizilimine göre farklılıklar gösterir. Primerlerin açılan DNA’ya bağlanma işlemi sırasında sıcaklığın artırılması DNA’nın seçiciliğini artırmaktadır. Böylece, primerlerin istenmeyen bölgelere bağlanması ve yanlış DNA dizilerinin elde edilmesinin önüne geçilmektedir. Sıcaklığın azaltılması, primerlerin yanlış bölgeleri çoğaltmasına ve çoğaltılan DNA dizilerinde hatalı baz bağlanmalarının artmasına neden olmaktadır (Innisve Gelfand 1990, Dieffenbach vd.1993, Kwok vd. 1994).

Taq Polimeraz enzimi, jeotermal bölgelerde bulunan, termofil bir bakteri türü olan Thermus aquaticus’tan elde edilmiştir. Yüksek dereceli sıcaklıklarda dahi aktivitesini sürdürebilir yapıda bir enzim olması sebebiyle, PZR işlemlerinde farklı karışımlar halinde ya da saf halde bulunabilmektedir. PZR’de ihtiyaç duyulan enzim miktarı, örneklerden izole edilen kalıp DNA veya çoğaltılmak istenen bölge primerine göre farklılıklar gösterebilmektedir (Innisve Gelfand 1990, Erlich vd. 1991,Yang vd. 1992).

Bu çalışmada sitokrom oksidaz alt ünite 1 ve apolipoprotein b bölgesini dizilemek için oluşturulan klasik PZR reaksiyonunda kullanılacak primerler Çizelge 3.4’de verilmiştir.

Çizelge 3.4 Polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan primer listesi

5’ CCAGCAAAATTTTCTTTTACTTCAA 3’ Jiang vd. 1998

CO1->

LCO1490

5' GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3’ Vrijenhoek 1994

CO1->

HCO2198

5' TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 3' Vrijenhoek 1994

3.2.2 Klasik PZR Uygulaması

Örneklerden izole edilen DNA’nın çoğaltılarak, sekans cihazları tarafından dizileme yapılmasıyla, örneğin veri setininin elde edilmesi için kullanılan yöntemlerden biridir.

İlk olarak, kalıp DNA içeren -20°C’lik dolapta bekleyen örnekler çözülmesi için ependorf raklarına alınarak laminar flow kabine koyulur. Daha sonra PZR bileşenleri olan, dH2O (Distile su), MgCl2, Taq tampon çözeltisi, dNTP, primerler (ileri ve geri), Taq polimeraz enzimi PZR rakı içerisinde laminar flow kabine çözünmeye bırakılır.

PZR tüpleri tek tek, kalıp DNA örneklerine ait olan numaralarla numaralandırılır.

PZR bileşenleri, gerekli hacimde bir karışım oluşturmak için sırayla mikropipet ile ependorf tüpüne boşaltılmış ve pipetaj yapılarak, homojen karışmaları sağlanmıştır.

Karışım hazırlandıktan sonra vortex cihazı vasıtasıyla bir süre hafifçe döndürülmüştür.

Ependorf tüpteki karışım, eşit miktarda olacak şekilde PZR tüplerine paylaştırılmıştır.

Üzerinde, örneğe ait numarayı taşıyan PZR tüpleri karışım ile doldurulduktan sonra üzerilerine, numarada belirtilen örneğin kalıp DNA’sı ilave edilerek reaksiyon işlemi için hazır hale getirilmiştir.

Kimyasalları ve DNA materyalleri homojen karışan örnekler daha sonra termal döngü cihazının kuyucuklarına yerleştirilmiştir. Bu yerleştirilme esnasında kapakların kapalı olunduğundan emin olunmalıdır. PZR işlemi için termal döngü cihazına yerleştirilen

örnekler (Şekil 3.5), döngüler için optimum olan koşullar (Çizelge 3.5) sayesinde çoğaltılmış ve elektroforez işlemine tabi tutulmuştur.

Çizelge 3.5 CO1 ve APOB gen bölgesi optimum koşulları

Aşamalar CO1 APOB

Ön Denatürasyon 95ºC’de 5 dakika 94ºC’de 3 dakika

Denatürasyon 95ºC’de 1 dakika 94ºC’de 30 saniye

Bağlanma 47º-51ºC’de 1 dakika 45ºC – 51ºC’de 30 saniye

Uzama 72ºC’de 1 dakika 72ºC’de 30 saniye

Son Uzama 72ºC’de 10 dakika 72ºC’de 5 dakika

Şekil 3.5 PZR işlemi için termal döngü cihazına yerleştirilen örnekler