8. PAPILLOCHECK ® PROSEDÜR
8.2 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
PCR, son derece küçük DNA miktarlarını tespit edebilen çok hassas bir yöntemdir. Reaksiyon kontaminasyonunu önlemek için özel önlemlere uyulmalıdır (bkz. Bölüm 7). HotStarTaq® Polimeraz ve Ursail-N-Glikosilaz gerekir ancak PapilloCheck® test kiti ile birlikte verilmez ve ayrı olarak satın alınmalıdır (bkz. Bölüm 2).
8.2.1 Termal döngüleyici kurulumu
PapilloCheck® test kiti aşağıdaki termal döngüleyicilerle valide edilmiştir:
• GeneAmp® PCR sistem 9700 (Uygulamalı Biyosistemler)
• Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler).
PapilloCheck® PCR'nin termal döngüleyici programı Tablo 2'de özetlenmektedir.
Tablo 2: PapilloCheck® PCR'nin termal döngüleyici programı Süre Sıcaklık °C Döngü sayısı
20 dk. 37 ºC 1
15 dk 95 ºC 1
30 sn.
25 sn.
45 sn.
95 ºC 55 ºC
72 ºC 40
30 sn.
45 sn. 95 ºC
72 ºC 15
Tutun 10 °C
Ayrıca her termal döngüleyici için aşağıdaki işlem parametreleri ayarlanmalıdır. Bu parametrelerin nasıl ayarlanması gerektiğinin açıklaması için ilgili termal döngüleyicinin Kullanım Kılavuzuna bakınız.
GeneAmp® PCR sistem 9700 (Uygulamalı Biyosistemler)
Reaksiyon hacmini 26 µl'ye, rampa hızını “9600”e ayarlayın ve 103 °C kapak sıcaklığını kullanın.
Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyici (Uygulamalı Biyosistemler)
PapilloCheck® PCR programına girmek için Veriti™ 96-Kuyucuklu Termal Döngüleyicinin Dönüştürme
!
PapilloCheck® test kiti Qiagen tarafından üretilen HotStarTaq® Polimeraz ve Fermentas tarafından üretilen Urasil-N-Glikosilaz kullanılarak (Bölüm 2’de yer alan sipariş verme bilgilerine bakınız) valide edilmiştir.Belirlenen performansı elde etmek için bu enzimlerin kullanılması zorunludur.
!
Belirlenen performansın elde edilmesi için yukarıda belirtilen termal döngüleyicilerden birinin kullanılması kesinlikle şarttır.8.2.2 Urasil-N-Glikosilaz (UNG) uygulaması
PapilloCheck® PCR MasterMix, PapilloCheck® PCR sırasında amplifikasyon ürünlerine dahil edilen dUTP içerir ve PCR ürünlerini UNG ile bozunmaya duyarlı hale getirir. UNG, PCR ürününü deoksiuridilat kalıntısının dahil edildiği bölgelerde ayırır. Ayrık PCR ürünleri sonraki bir reaksiyonda amplifiye edilmez. Bu nedenle UNG uygulaması, önceki PCR kontaminasyonlarından taşınma kontaminasyonunu gidermek için kullanılabilir.
➠ PCR kalitesinde suda Urasil-N-Glikosilazı 1:200 seyreltin. Her PapilloCheck® PCR reaksiyon kurulumu için yeni bir UNG seyreltmesi kullanın (bkz. Bölüm 8.2.3). Seyreltilmiş UNG'yi yeniden kullanmayın.
➠ 2 saniye süresince vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya yukarı ve aşağı doğru birçok kez pipetleyerek UNG seyreltmeyi karıştırın.
Urasil-N-Glikosilaz orijinal konsantrasyonu 1 U/µl'dir. Sonuç olarak, seyreltmenin konsantrasyonu 0,005 U/µl'dir.
➠ Bu seyreltmeden 1 µl her bir PapilloCheck® PCR reaksiyonuna ekleyin (bkz. Bölüm 8.2.3, Tablo 3).
Bu miktar, PCR taşınma kontaminasyonunu gidermek için yeterlidir. PCR performansı üzerinde olumsuz bir etkisi olabileceğinden ve PapilloCheck®hassasiyetinin azalması ile sonuçlanabileceğinden daha yüksek konsantre edilmiş UNG solüsyonu kullanmayın.
Genel olarak UNG uygulaması için PCR reaksiyon karışımı 37 °C'de 20 dakika süreyle inkübe edilir.
Daha sonra, UNG 95 °C'de 15 dakika süreyle ek inkübasyon adımı ile etkisizleştirilir. Bu iki adım PapilloCheck® PCR'ye zaten dahil edilmiştir ve termal döngüleyici programının ilk iki adımına karşılık gelir (bkz. Tablo 2). İkinci adımda (95 °C'de 15 dakika) Urasil-N-Glikosilaz'ın etkisizleştirilmesi ve HotStarTaq® Polimeraz etkinleştirmesi gerçekleşir.
12
5 PapilloCheck® ürününü satın aldığınızda ürünle birlikte ABD Patent Numaraları 5,035,996; 5,683,896;
5,945,313; 6,287,823 ve 6,518,026 altında sınırlı bir lisans ve ilgili yabancı patentler gelir.
6 Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reac-tions, Gene, 93, 125-128, 1990.
!
PapilloCheck® test kiti Fermentas tarafından üretilen Urasil-N-Glikosilaz kullanılarak valide edilmiştir (bkz.Bölüm 2). Belirlenen performansı elde etmek için bu enzimin kullanılması zorunludur.
!
PapilloCheck® PCR’nin dahil edilen UNG sistemi yalnızca önceki PCR reaksiyonlarından PCR ürünleri ile taşınma kontaminasyonlarını giderir. Numune hazırlama, DNA izolasyonu veya PCR şablon ekleme sırasında meydana gelenler gibi diğer kontaminasyonlar giderilemez. Bu nedenle Bölüm 7’de tanımlanan kontaminasyonunun önlenmesi için talimatların ve özel önlemlerin izlenmesi hala gereklidir.8.2.3 PCR reaksiyon kurulumu
HotStarTaq® Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz hariç olmak üzere PapilloCheck® PCR MasterMix, PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için gerekli olan tüm bileşenleri zaten içermektedir (PCR tamponu, MgCl2, dNTP'ler, primerler, PCR kontrol şablonu).
Reaksiyon karışımının kurulumu, reaksiyon kontaminasyonunu önlemek için en uygun bir biçimde PCR ocağı gibi korunan bir ortamda gerçekleştirilir.
➠ Reaksiyon karışımını (PapilloCheck® PCR MasterMix, HotStarTaq® Polimeraz ve Urasil-N-Glikosilaz'dan oluşur) Tablo 3'te belirtildiği gibi gerekli PCR miktarı için hazırlayın.
Çoklu numuneleri analizi etmek için reaksiyon karışımı bir seri halinde hazırlanmalıdır (tüm analizler için gerekli olan miktarda). Pipetleme sırasında hacim varyasyonlarını düzenlemek için reaksiyonların sayısının her çip için (n) 1 arttırılması (=n+1) önerilir, örn: 12 numunenin test edilmesi gerekiyorsa 13 amplifikasyon reaksiyonu için bir reaksiyon karşımı hazırlayın (bkz. Tablo 3). Bir çipin reaksiyonları için her zaman bir MasterMix flakonu kullanın.
➠ 2 saniye süresince vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya yukarı ve aşağı doğru birçok kez pipetleyerek reaksiyon karışımını iyice karıştırın.
➠ Her bir PCR reaksiyonu için reaksiyon karışımının 21 µl'sini pipetleyerek 0,2 ml'lik, ince duvarlı PCR reaksiyon tüpüne alikuotlara bölün.
Şablon DNA'yı reaksiyon karışımının kurulumundan ayrı bir çalışma alanına ekleyin (bkz. Bölüm 7.2).
➠ Her bir PCR reaksiyonuna 5 µl DNA ekstraktı ekleyin ve 2 saniye süreyle vorteks uygulayarak ve sonrasında aşağı bükerek veya birçok kez yukarı ve aşağı doğru pipetleyerek karıştırın. Bir PCR reaksiyonunun toplam hacmi 26 µl'dir.
➠ Reaksiyon tüplerini termal döngüleyiciye yerleştirin ve Bölüm 8.2.1'de tanımlanan termal döngüleyiciyi kullanarak PCR reaksiyonunu başlatın (Tablo 2).
!
PapilloCheck® test kiti Qiagen tarafından üretilen HotStarTaq® Polimeraz kullanılarak valide edilmiştir (bkz.Bölüm 2). Belirlenen performansı elde etmek için bu enzimin kullanılması zorunludur.
!
PapilloCheck® PCR MasterMix’in her serisi için bir negatif kontrolün dahil edilmesi önerilir. Negatif kontrol olarak uygun DNA izolasyon kitinin DNA elüsyon tamponu veya PCR kalitesinde su kullanılabilir.!
PCR tamamlandıktan sonra amplifikasyon ürünleri hibridizasyon için hemen kullanılmalı veya bir hafta süreyle -20 °C’de saklanmalıdır.Tablo 3: PapilloCheck® PCR reaksiyonunun kurulumu
1 reaksiyon 13 reaksiyon
(1 çip) 26 reaksiyon
(2 çip) 39 reaksiyon
(3 çip) 52 reaksiyon (4 çip)
PapilloCheck®
PCR MasterMix 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl
HotStarTaq® Polimeraz
(5 U/µl) 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl
Urasil-N-Glikosilaz (1:200 seyreltme,
0,005 U/µl) 1 µl 13µl 26 µl 39 µl 52 µl
Numune DNA eklenmeden önce
toplam hacim 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl
Rahim boynu numunesinden DNA
ekstraktı (DNA şablonu) 5 µl
Reaksiyon başına toplam
hacim 26 µl