PNRSV izolatlarının filogenetik ilişkinin belirlenmesi

MODELO DE HIPERTENSÃO PULMONAR INDUZIDO POR

MONOCROTALINA

Os animais do grupo MCT apresentaram um grande aumento na intensidade de fluorescência basal (327 ± 20%), produzida pela oxidação do DHE em cortes transversais de artérias pulmonar isolada de ratos. Este resultado caracteriza o aumento do estresse oxidativo no tecido vascular pulmonar.

A intensidade do sinal de fluorescência basal foi diminuída de forma acentuada ao longo de toda a parede da artéria pulmonar de ratos MCT tratados com a FAFCS na dose de 50 mg/kg (90 ± 16%) e 100 mg/kg (85 ± 10%), bem como para os animais MCT tratados com sildenafil 50 mg/kg (114 ± 16%), quando comparados ao grupo MCT (327 ± 20%) (Gráfico 7). Não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos MCT tratados com a FAFCS e sildenafil.

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Gráfico 7: O tratamento com FAFCS previne o aumento da produção de ROS em artéria pulmonar de rato com HP. Os cortes transversais de artéria pulmonar dos grupos controle, MCT, MCT + FAFCS (50 e 100 mg/kg) e MCT + sildenafil foram expostos ao corante fluorescente, DHE, durante 30 min à 37ºC.

(a) Imagens representativas de microscopia de fluorescência (b) Dados correspondentes de 8

Discussão

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6 DISCUSSÃO

As plantas medicinais têm sido fontes de recursos terapêuticos para o tratamento de um amplo espectro de doenças há milhares de anos (CRAGG ;NEWMAN, 2013). O reconhecimento científico de muitas espécies de plantas tem revelado a presença de componentes fitoquímicos com atividades farmacológicas importantes (CAVALCANTI et al., 2013). Cissampelos sympodialis Eichl. (Menispermaceae) é uma espécie de planta tradicionalmente utilizada no Nordeste do Brasil e estudos farmacológicos têm revelado ações biológicas bastante promissoras para a planta e seus derivados.

O presente trabalho foi desenvolvido com a finalidade de avaliar o potencial da FAFCS em prevenir e/ou melhorar disfunção cardiopulmonar promovida pelo modelo de HP induzido pela MCT. Inicialmente foi avaliado o efeito agudo da FAFCS em anéis de artéria pulmonar de ratos saudáveis, no qual foi evidenciado que o efeito vasorrelaxante da FAFCS é mediado de maneira independente da presença do endotélio vascular. Além disso, foi constatado que o tratamento oral com a FAFCS preveniu a instalação da HP induzida por MCT em diferentes doses, bem como melhorou a responsividade vascular ao restaurar a resposta vasoconstrictora e vasodilatadora alteradas neste modelo. Esse estudo também demonstrou que esses efeitos benéficos induzidos pela FAFCS envolvem a redução do estresse oxidativo nos vasos pulmonares.

A ação farmacológica de compostos vasodilatadores é principalmente mediada por um efeito direto sobre o músculo liso vascular ou um efeito indireto, via liberação de fatores relaxantes derivados do endotélio vascular (GURNEY, 1994; BARNES ;LIU, 1995). Esta camada única de células apresenta papel importante no controle do tônus vascular pulmonar e da PAP por meio da liberação de substâncias vasoativas. Estas substâncias agem nas células do músculo liso vascular, causando contração ou relaxamento, e a liberação de fatores que podem influenciar o crescimento e a diferenciação de células na parede dos vasos (BARNES ;LIU, 1995).

As células endoteliais, em resposta a uma variedade de estímulos fisiológicos, tais como: a bradicinina; acetilcolina; histamina; substância P; estresse de

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cisalhamento, entre outros, liberam substâncias vasodilatadoras, incluindo: PGI2, NO

e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) (BARNES; LIU, 1995; SERBAN; NILIUS; VANHOUTTE, 2010). Diante destes dados, foi avaliado o efeito agudo da FAFCS em anéis de artéria pulmonar para investigar a influência do endotélio funcional na resposta vasorrelaxante induzida pela FAFCS. Para tanto, foram realizados experimentos in vitro, nos quais o endotélio foi mecanicamente removido e as respostas relaxantes da fração em estudo foram comparadas na presença e na ausência do endotélio vascular.

O efeito vasorrelaxante da FAFCS mostrou-se equipotente, com relação aos

valores de eficácia e CE50, nos anéis de artéria pulmonar, na presença e na

ausência do endotélio funcional. Este efeito evidencia que a vasodilatação promovida pela FAFCS ocorre de maneira independente dos fatores relaxantes derivados do endotélio. Adicionalmente, sugere-se que a fração em estudo exerce seu efeito diretamente no músculo liso vascular.

A contratilidade e proliferação das células musculares lisas vasculares desempenham papel significativo no desenvolvimento do remodelamento vascular pulmonar e, consequentemente, na patogênese da HP (JEFFERY ;WANSTALL, 2001; CHETTIMADA et al., 2012). A utilização de intervenções farmacológicas que melhorem disfunção arterial pulmonar pode atuar como alternativas terapêuticas na prevenção ou reversão dos mecanismos que desencadeiam à HP (KOLETTIS et al., 2007; KAMEZAKI et al., 2008). Nesse contexto, C sympodialis constitui uma alternativa a ser estudada quanto a seus benefícios frente à prevenção e reversão da HP, devido suas ações anteriormente demonstradas por Magalhães (2010).

Neste trabalho, foi avaliado ação da FAFCS sobre disfunção vascular pulmonar promovida pelo modelo de HP induzido pela MCT. Este modelo é uma ferramenta útil na investigação da fisiopatologia da HP e tem contribuído para desenvolvimento de alvos terapêuticos para o tratamento da HP devido a sua similaridade com a doença em humanos (KOLETTIS et al., 2007; KAMEZAKI et al., 2008).

Ao ser avaliado os parâmetros hemodinâmicos, após 28 dias da administração subcutânea da MCT (60 mg/kg), o grupo que recebeu apenas salina (MCT) apresentou aumento da PAP, confirmando o quadro de HP. Este resultado

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corrobora com dados da literatura, que mostram que uma única injeção subcutânea de MCT na dose de 60 mg/kg leva ao desenvolvimento progressivo da HP ao final de 28 dias de tratamento (DUMITRASCU et al., 2011; PRICE et al., 2011; VEIT et al., 2013).

O tratamento oral com FAFCS preveniu o desenvolvimento da HP em ambas as doses avaliadas (50 mg/kg e 100 mg/kg). Entretanto, a dose de 100 mg/kg da fração foi mais eficiente em reduzir os valores de PAP dos ratos com HP, quando comparado ao efeito da FAFCS na dose de 50 mg/kg. Além disso, o efeito da FAFCS na dose de 100 mg/kg foi semelhante ao efeito do sildenafil, um inibidor de PDE-5 usado no tratamento da hipertensão pulmonar em humanos (SINGH et al., 2006; RUBIN et al., 2011). O sildenafil também apresenta efeito estabelecido em prevenir o desenvolvimento da HP em modelos de hipertensão induzida pela monocrotalina (SCHERMULY et al., 2004; LIU;LIU ;GUAN, 2007).

Resultados similares aos encontrados neste estudo também foram observados por MAGALHÃES (2010), que avaliou o efeito de administração oral de FAFCS apenas na dose de 100 mg/kg, demonstrando a redução da PAP em ratos com HP induzida por MCT de maneira similar ao sildenafil. Neste mesmo estudo, também foi evidenciado que o tratamento combinado (FAFCS + Sildenafil) não induziu efeito adicional em reduzir os valores de PAP.

Nos animais tratados com MCT, o aumento da resistência vascular pulmonar e elevação da PAP causam a hipertrofia ventricular devido à sobrecarga de trabalho (BOGAARD et al., 2009; ZAPATA-SUDO et al., 2012). Corroborando com estes dados, esse estudo constatou a hipertrofia ventricular nos animais que receberam MCT e salina via oral. Esse efeito foi observado devido ao aumento significativo da relação VD/ VE+S nesses animais, considerada o parâmetro utilizado para avaliar a hipertrofia do VD.

Já nos animais tratados com FAFCS na dose de 50 mg/kg e 100 mg/kg a hipertrofia ventricular direita foi igualmente reduzida em ambas às doses, não apresentando diferenças estatísticas entre os grupos e seus controles saudaáveis. Além disso, o grau de hipertrofia ventricular nos grupos tratados com FAFCS em ambas as doses não apresentou diferença estatística com o grupo tratado apenas com sildenafil. Este resultado sugere que a redução da hipertrofia ventricular pode

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estar associada à prevenção do aumento da PAP e, portanto, à redução da sobrecarga de pressão imposta ao VD.

Neste trabalho também foi demonstrado que os animais que receberam a injeção de MCT para indução da HP apresentaram alterações na reatividade vascular das artérias pulmonares. Essas alterações foram observadas pelo prejuízo na resposta vascular pulmonar a estímulos vasoconstritores e vasodilatadores devido à pneumotoxicidade provocada pela MCT.

A análise da curva concentração-resposta para FEN em anéis de artéria pulmonar mostrou que a resposta contrátil da musculatura lisa vascular ao agonista

α1-adrenégico está reduzida no grupo com HP, grupo MCT. Esse resultado está de

acordo com relatos da literatura, que também mostram a diminuição da resposta contrátil máxima a agentes contracturantes como FEN, noradrenalina, ATII e KCl, após a injeção de MCT (ALTIERE;OLSON ;GILLESPIE, 1986; MAM et al., 2010).

A capacidade reduzida de gerar contração em resposta a agentes contráteis também foi observada por Mam (2010) após 28 dias da administração de MTC. Período suficiente para serem observadas alterações estruturais da parede vascular pulmonar, associadas ao remodelamento vascular, como crescimento e proliferação das células musculares lisas, aumento da produção de colágeno e elastina, bem como diminuição da complacência do vaso (ALTIERE;OLSON ;GILLESPIE, 1986; JEFFERY ;WANSTALL, 2001; MAM et al., 2010).

O tratamento com FAFCS na dose de 50 mg/kg e 100 mg/kg induziu maior resposta contrátil a FEN quando comparado com o grupo MCT, apresentando valores de eficácia comparável aos grupos controle e ao grupo tratado com sildenafil. Esses dados indicam que a fração em estudo reverteu às disfunções vasculares responsáveis pela diminuição da contratilidade.

Outra marcante característica do modelo experimental de HP induzida por MCT é a acentuada disfunção endotelial, caracterizada principalmente pela redução da vasodilatação dependente de endotélio. Esse efeito é observado devido à produção deficiente de NO, em função do desacoplamento da eNOS e diminuição da expressão dessa enzima após o tratamento com MCT. (ALTIERE;OLSON ;GILLESPIE, 1986; CSISZAR et al., 2009; CHUNG et al., 2010; MAM et al., 2010; TABIMA;FRIZZELL ;GLADWIN, 2012; ZAPATA-SUDO et al., 2012).

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Neste estudo, foi observado redução significativa da vasodilatação dependente de endotélio induzida pela ACh, em anéis de artéria pulmonar de ratos com HP, quando comparado com o grupo controle, demonstrando que a MCT causou disfunção endotelial e redução da produção de NO pelo endotélio. No entanto, o tratamento com FAFCS em ambas as doses ou sildenafil não foram eficazes em restabelecer a resposta vasorrelaxante estimulada pela ACh, indicando que ambos tratamentos não revertem a disfunção endotelial induzido pela MCT.

Além de induzir disfunção endotelial, a administração única de MCT também pode causar alterações em mecanismos e vias envolvidas diretamente no relaxamento das células musculares lisas de artéria pulmonar. Foi descrito por Mam (2010) que a resposta relaxante induzida pelo NPS, um doador espontâneo de NO, foi reduzida em animais tratados apenas com MCT. Esse efeito foi relacionado com prejuízo da via de sinalização NO-GMPc-PKG na célula muscular, devido diminuição da expressão da PKG ou aumento da expressão da PDE-5 após tratamento com MCT (CHUNG et al., 2010). O presente estudo também constatou que resposta relaxante máxima ao NPS foi significativamente reduzida nos animais MCT em relação ao grupo controle, demonstrando que nos animais com HP a resposta relaxante muscular lisa também está prejudicada.

O tratamento com FAFCS (50 e 100 mg/kg/dia) melhorou a resposta vasorrelaxante ao NPS, quando comparado com o grupo MCT, de tal forma que os valores de eficácia foram comparáveis ao grupo controle saudável, sugerindo que o tratamento com a fração protege contra a disfunção das células musculares lisas provocada pela MCT e melhora a sensibilidade da via NO-cGMP-PKG. Tal fato é corroborado pela similaridade de respostas da fração com o sildenafil, que é um inibidor específico da PDE-5, enzima expressa abundantemente no tecido arterial pulmonar (MURRAY;MACLEAN ;PYNE, 2002).

Esses dados levam a hipótese de que o tratamento com FAFCS pode está modulando negativamente a atividade de PDE-5 e dessa forma melhorando a sensibilidade da via de sinalização NO-cGMP-PKG ao NPS em anéis de artéria pulmonar de ratos com HP induzida por MCT. Esta resposta pode ser atribuída aos efeitos já descritos para a fração, os quais demonstram efeito inibitório de PDEs específicas para o cGMP e cAMP e aumento dos níveis de nucleotídeos cíclicos

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(cAMP e cGMP) em célula muscular lisa de traqueia (THOMAS et al., 1997b). Tal evidencia é ainda reforçada pelo fato de que FAFCS causou relaxamento independente de endotélio em anéis de artéria pulmonar de rato, mostrando que seu efeito ocorre por uma ação direta sobre a musculatura lisa vascular. Efeitos relacionados a estes foram descritos por Alves (2012) que mostrou que FAFCS aumenta os níveis de cGMP em corpo cavernoso de rato, induzindo a resposta relaxante pela ativação da via sGC-cGMP-PKG, independente da indução da produção ou liberação de NO, demonstrando sua ação direta sobre o músculo liso vascular.

Outra relevante característica da HP é o aumento do estresse oxidativo,

evidenciado pela produção excessiva de ROS, principalmente de ânions O2●-

(DEMARCO et al., 2010). O aumento de ânions O2●- ocorre em resposta a estímulos

físicos (estresse de cisalhamento, tensão pulsátil) e humorais (citocinas, fatores de crescimento e vasoativos) (GRIENDLING ;FITZGERALD, 2003; TOUYZ, 2004;

BIRUKOV, 2009). A produção exacerbada dos ânions O2●-, pode modular a função

vascular por meio do dano oxidativo direto, desencadeando a ativação de vias de sinalização que levam a redução da biodisponibilidade do NO e modulação negativa da via sCG-cGMP, contratilidade prejudicada, proliferação e o remodelamento vascular (BIRUKOV, 2009; FARROW et al., 2010; FARROW et al., 2012; KLINGER;ABMAN ;GLADWIN, 2013).

De forma semelhante à literatura, também foi evidenciado o aumento do estresse oxidativo tecidual nos animais com HP (grupo MCT), devido elevação dos

níveis de ânions O2●-, em cortes transversais de artérias pulmonares. A produção de

ânions O2●- foi significativamente reduzida com o tratamento dos animais com a

FAFCS em ambas as doses ou com sildenafil.

A redução de ROS provocada pelo tratamento com FAFCS pode está, em parte, relacionada com a presença de compostos polifenólicos (taninos e flavonoides) presente na fração aquosa de C. sympodialis (CAVALCANTI, 2014). Além disso, a fração também pode está modulando negativamente vias de sinalização que envolve a ativação de proteínas produtoras de ROS, como a NAPDH oxidase, normalmente hiperativa na HP (TABIMA;FRIZZELL ;GLADWIN, 2012; VEIT et al., 2013). Entretanto, ainda não é possível afirmar por qual

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mecanismo a FAFCS estaria induzindo a redução do estresse oxidativo ou se há alguma relação entre a redução de ROS e a melhora da função muscular evidenciada pelo aumento da função contrátil a FEN e relaxante induzida pelo NPS.

Os dados obtidos neste estudo indicam que o tratamento oral com FAFCS previne a instalação da HP induzida por MCT, como também reduz a hipertrofia do VD. Além disso, o tratamento com FAFCS durante 28 dias restaurou a resposta vasoconstrictora e vasodilatadora, demonstrando a melhora da função muscular independente do endotélio ou de seus mediadores, alterada pelo modelo de HP adotado. Esse estudo também mostra um efeito inédito para a FAFCS sobre o estresse oxidativo, no qual o tratamento com a fração diminui os níveis de ROS tecidual em artéria pulmonar no modelo de HP induzida pela MCT.

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7 CONCLUSÃO

De acordo com os resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que:

 FAFCS promove um efeito vasorrelaxante, independente do endotélio vascular, em anéis de artéria pulmonar de rato saudável;

 O tratamento por 28 dias com MCT promove um quadro de HP em ratos Wistar, com elevação significativa dos valores de PAP e hipertrofia ventricular direita;

 O tratamento com a FAFCS foi eficiente para normalizar os valores de PAP em diferentes doses e a hipertrofia ventricular durante a instalação da HP;  FAFCS restaura a função contrátil do músculo liso vascular a FEN alterada no

modelo de HP induzida por MCT;

 FAFCS restaura o relaxamento do músculo liso vascular ao NPS alterada no modelo de HP adotado;

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8 PERSPECTIVAS

Os resultados obtidos neste estudo apontam para o potencial da FAFCS em prevenir a hipertensão pulmonar no modelo monocrotalina. O próximo passo será investigar os mecanismos moleculares relacionados à melhora da função vascular, observados com o tratamento com a FAFCS, visando posteriormente iniciar testes clínicos para o desenvolvimento de um fitoterápico para o tratamento da HP.

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