Pasif hedeflendirme

Pasif hedeflendirme genel olarak doğal fizyolojik süreçler ve faktörler aracılığıyla belli bölgelere ilacın taşınmasıdır. Pasif hedeflendirme ilaçları gerekli bölgeye taşımak için normal ve hastalıklı dokular arasındaki anatomik farklılıklardan faydalanır. Normal dokularda yalnızca küçük moleküller kan damarları çeperlerinden difüzlenebilirler.

15

Tümör dokusundaki anormallikler kan plazma bileşenlerinde ve diğer makromoleküllerde sızıntıya yol açmaktadır. Tümörlü damarların sağlıklı damarlara göre daha yüksek geçirgenliğe sahip olması nedeniyle makromoleküller tümör yapısının arayüzeyine sızmaktadır. Bu olay “gelişmiş geçirgenlik ve tutma etkisi (EPR)” olarak adlandırılmaktadır (Şekil 2.11 Barreto vd. 2011), Sun vd. 2014).

Şekil 2.11 Gelişmiş geçirgenlik ve tutma etkisi (EPR) (Barreto vd. 2011)

a. normal doku, b. tümörlü doku

2.4.1.2 Aktif hedeflendirme

Aktif hedeflendirme ilaç taşıyıcı sistemin spesifik hücrelere, doku ya da organlara yönlendirilmesi esasına dayanır. Bu yöntem manyetik, ultrasonik ve ligand-reseptör aracılı hedeflendirme olmak üzere 3 grup altında incelenebilir.

Manyetik hedeflendirme, ilaç yüklü manyetik yapıların manyetik alan kullanılarak istenilen bölgeye ulaşmasını sağlamak ve ilacın salımını kontrol etmek amacıyla gerçekleştirilen hedeflendirme yöntemidir. Serbest ilacın dolaşım sistemindeki derişiminin 100 kat azalması ve dokuda kontrollü bir şekilde ilaç salımının gerçekleştirilmesi yöntemin avantajları arasındadır. Manyetik olarak hedeflendirilebilecek hastalık grupları arasında kanser, beyin tümörleri, kalp ritm bozuklukları ve hormon eksikliği sıralanabilir.

16

Ultrasonik hedeflendirme yönteminde biyolojik olarak bozunan ya da bozunmayan polimerler ilaç taşıyıcısı olarak kullanılırlar. Bu yöntemde ilaç salımı ultrasonik dalgaların şiddet, frekans ve uygulama süresine bağlıdır.

Ligand-reseptör aracılı hedeflendirme yönteminde hedef yapıya yönlendirilen reseptör yapılarına spesifik bir şekilde bağlanabilen hedeflendirilmiş ligandlar kullanılmaktadır.

Ligandlar bağlanma etkinliğini artırdığı için reseptör aracılı endositoz daha etkin bir şekilde gerçekleşmektedir. Ligand hedeflenen hücrede bulunan reseptörün özeliklerine bağlı olarak seçilmektedir. Ligand-reseptör aracılı hedeflendirmede kullanılan ligandlar arasında lektinler, vitaminler, peptit yapıdaki büyüme faktörleri ve glikoproteinler sayılabilir (Gürsoy 2002, Barreto vd. 2011, Sun vd. 2014). Şekil 2.12’de aktif ve pasif ilaç hedeflendirmesi şematik gösterimi verilmiştir.

Şekil 2.12 Pasif ve aktif hedeflendirmenin şematik gösterimi (Danhier vd. 2012)

17 2.5 Süperkritik Akışkanlar

Bir akışkan, kritik sıcaklık (Tc) ve basıncından (Pc) daha yüksek değerlerde sıcaklık ve basınca sahipse süperkritik olarak adlandırılır. Sıcaklık ve basınç faz diyagramında kritik nokta üzerindeki bölgeye “süperkritik bölge”, bu bölgedeki akışkana ise

“süperkritik akışkan” (SKA) denir (Subramaniam vd. 1997, Kakumanu ve Bansal 2005). Saf bir maddenin sıcaklık-basınç diyagramı şekil 2.13’te gösterilmektedir.

Şekil 2.13 Saf bir maddenin sıcaklık-basınç faz diyagramı (www.le.ac.uk/chemistry/

greenchem/supercritical_fluids.html)

Süperkritik akışkanlar yoğunluk özelikleriyle sıvılara, akış özelikleriyle ise gazlara benzemekte ve akışkan olarak bilinmektedirler. Süperkritik akışkanlar, sıvı çözücülerden, daha uygun kütle transferine neden olacak yüksek yayınırlık katsayısına, düşük vizkoziteye ve yüzey gerilimine sahiplerdir (Subramaniam vd. 1997, Sihvonen vd. 1999, Kakumanu ve Bansal 2005).

Süperkritik akışkanlar sahip oldukları üstün özelikleri nedeniyle, gıda, kozmetik, kimya endüstrileri, polimerler, ağaç, tekstil ve ilaç endüstrisi alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır (Jung ve Perrut 2001, Kakumanu ve Bansal 2005).

Süperkritik akışkan süreçlerinde çok çeşitli akışkanlar (su, amonyak, alkoller, aminler..vb) kullanılmaktadır. Bu akışkanlar arasında ise en yaygın olarak kullanılan

18

karbondioksittir (CO2). CO2’in kritik sıcaklık ve basıncı sırasıyla 31.1 ^oC ve 73.8 bar’dır. Apolar bir çözücü olan CO2 zehirli değildir, tutuşmaz, organik çözücülerle karşılaştırıldığında ucuzdur ve üründen uzaklaştırılması kolaydır. (Subramaniam vd.

1997, Sihvonen vd. 1999, Hakuta vd. 2003, Byrappa vd. 2008).

2.6 Süperkritik Akışkanlar ve Polimerizasyon

Medikal uygulamalar için kullanılacak polimerin üretim sürecinde, toksik maddelerin kalması olumsuz bir özelik taşımaktadır. Bu durum, organik çözücüler kullanılmadan gerçekleştirilecek polimerizasyon süreci arayışına yönlendirmiş, süperkritik akışkanların tepkime ortamı olarak kullanımı yaygınlaşmıştır. Süperkritik ortamda gerçekleştirilen polimerizasyon süreçlerinde kurutma, çözünürlük ve polimerin plastikleşmesi dikkat edilmesi gereken noktalardır. Çalışmalarda, olumlu özeliği nedeni ile yaygın olarak kullanılan süperkritik karbondioksit (SK-CO2) bir sentez ortamı akışkanıdır. Polimerizasyon süreci sonunda sistemin vanası açıldığında basınç düşer ve polimer çözücüden kolaylıkla ayrılır. Ayrıca SK-CO₂ polimerin camsı geçiş sıcaklığında (T_g) düşmeye yol açarak plastikleşme sağlar. Süperkritik ortamda plastikleşen polimerden tepkimeye girmemiş monomerin ayrılması daha kolay bir hal alır (Kendall vd. 1999, Mazzaro vd. 2007).

Polimerizasyon sırasında kullanılan yüzey aktif maddeler genel olarak CO2’yi ve polimeri seven bölgelerden oluşur. Florlu yapılar CO2’yi seven özelik taşımaktadır.

Florokarbonlu yüzey aktif maddeler yüksek etkinliğe sahip olmaları nedeni ile klasik yüzey aktif maddelere göre 10-100 kat daha az miktarda kullanılmaktadır. Florlu yapılarda zincir uzunluğu insan sağlığına zarar vermeyecek şekilde ayarlandığında bu yapılar ilaç salımı ve hedeflemede uygulama alanı bulmaktadır (Krafft vd. 1998, Kendall vd. 1999, Riess vd. 2009).

19 2.7 Kaynak Araştırması

Bu bölümde manyetik nanoyapıların sentezi ve uygulamaları ile ilgili çalışmaların bir bölümü özetlenmiştir;

2.7.1 Fe3O4 sentezi ve yüzey modifikasyonu

Yang ve Yan (2012), Fe3O4 nanotaneciklerini azot atmosferinde demir tuzlarının (Fe²⁺/Fe³⁺ : 1/2, molar oran) sulu çözeltisinden üre ortamında birlikte çöktürme yöntemi ile sentezlemişlerdir. Deneylerde polivinil alkol (PVA) stabilizatör olarak kullanılmış, sıcaklık 85 ^oC’de sabit tutulmuştur. Manyetik nanotanecikler TEM, XRD ve VSM ile analiz edilmiştir. TEM görüntülerine göre ortalama tanecik büyüklüklerinin ortalama 300 nm olduğu (Şekil 2.14), VSM analizinden ise nanotaneciklerin süperparamanyetik özelikte oldukları belirlenmiştir (Şekil 2.15).

Şekil 2.14.a.b.PVA içermeyen, c.d. PVA içeren Fe3O4 nanotaneciklerinin TEM görüntüleri (Yang ve Yan 2012)

20

Şekil 2.15.a.PVA içermeyen, b.c. PVA içeren Fe3O4 nanotaneciklerinin VSM analiz sonuçları (Yang ve Yan 2012)

Wu vd. (2011), sodyum hidroksit (NaOH) ortamında birlikte çöktürme yöntemi ultrasonik etki altında Fe3O₄ nanotaneciklerini sentezlemişlerdir. Tepkime sonunda manyetik nanotanecikler deiyonize su ile yıkama, santrifüjleme ve vakumda 74 ^oC’de kurutma ile elde edilmiştir. Manyetik nanotanecikler SEM, XRD ve VSM ile analiz edilmiştir. Çalışmada sentezlenen manyetit nanotaneciklerinin 15 nm ortalama büyüklüğe sahip (Şekil 2.16) ve süperparamanyetik özelikte (Şekil 2.17) oldukları saptanmıştır. Ayrıca yüzey aktif maddenin (C12H₂₅OSO₃Na) nanotanecik oluşumu üzerine etkisi incelenmiş ve yüzey aktif madde ile daha homojen büyüklük dağılımı elde edilmiştir.

Şekil 2.16.a.Yüzey aktif madde içermeyen, b. yüzey aktif madde içeren Fe3O4 nanotaneciklerinin SEM görüntüleri (Wu vd. 2011)

21

Şekil 2.17 Sentezlenen nanotaneciklerin VSM analiz sonucu (Wu vd. 2011)

Yamaura vd. (2004), alkali ortamda birlikte çöktürme yöntemi ile sentezledikleri manyetit (Fe₃O₄) nanotaneciklerinin yüzeyini 3-(aminopropil)trietoksisilan (APTES) ile modifiye etmişlerdir. Manyetik nanotanecikler TEM, XRD, AFM ile karakterize edilmiş ve manyetik özelikleri belirlenmiştir. TEM ve AFM analiz sonuçlarına göre yüzeyi modifiye nanotaneciklerin 15-20 nm büyüklüğe sahip oldukları saptanmıştır.

AFM görüntüleri şekil 2.18’de verilmiştir.

Şekil 2.18 APTES-manyetit nanotaneciklerinin AFM görüntüleri (Yamaura vd. 2004)

Yüzeyi silanlı bileşikle modifiye ve modifiye olmayan manyetit nanotaneciklerinin süperparamanyetik özelikte sırasıyla 62 emu/g ve 68 emu/g doygunluk manyetizasyon değerlerine sahip oldukları belirlenmiştir. Nanotaneciklerin mıknatıs tarafından çekilebilir oldukları şekil 2.19'da görülmektedir.

22

Şekil 2.19 Mıknatıs tarafından çekilen manyetik nanotaneciklerin görüntüsü (Yamaura vd. 2004)

2.7.2 Süperkritik akışkan ortamında polimer (PLGA) sentezi

Mazarro vd. (2007), PLGA polimerini süperkritik karbondioksit (SK-CO₂) ortamında sentezlemişlerdir. Polimerizasyonda çinko oktaat (Zn(Oct)2)katalizör olarak seçilmiştir.

Basınç (150-250 bar), süre (1-18 h) ve karıştırma hızının (50-2200 rpm) polimerin molekül ağırlığı ve polidispersitesi üzerine etkileri incelenmiş, sıcaklık ise sabit tutulmuştur. Sentezlenen polimer SEM, GPC,FTIR ve ¹H-NMR ile karakterize edilmiştir. FTIR ve ¹H-NMR sonuçları şekil 2.20-2.21 ile verilmiştir.

Şekil 2.20 Sentezlenen PLGA polimerinin FTIR sonuçlarının PLA, PGA ve PLGA 75:25 ile karşılaştırılması (Mazarro vd. 2007)

23

Şekil 2.21 PLGA polimerinin ¹H-NMR spektrumu (P: 200 bar, karıştırma hızı : 500 rpm, t:18 h) (Mazarro vd. 2007)

Çalışmada reaktör içerisine 80:20 molar oranında d,l-laktid : glikolid yerleştirilmiş, 18 h tepkime süresi ve 200 bar basınçta sentezlenen polimer içerisinde bu oran 76.6 : 23.4 olarak belirlenmiştir. Ayrıca en yüksek molekül ağırlığına 4 h tepkime süresi (Mw = 9000) ve 150 barda (Mw = 7947) ulaşılmıştır.

Asandei vd. (2005), süperkritik reaktör sisteminde PLGA polimerini sentezlemişlerdir.

Polimerizasyonda kalay oktaat (Sn(Oct)2)katalizör, 1,10-dekandiol başlatıcı ve süperkritik akışkan olarak karbondioksit seçilmiştir. Süreçte, basınç 1500-3500 psi, sıcaklık 110-130 ^oC ve süre 1-3 h aralığında denenmiştir (Çizelge 2.1). Elde edilen PLGA polimeri TEM, ¹H-NMR ve GPC ile karakterize edilmiştir.

Çizelge 2.1 Süperkritik akışkan ortamında PLGA polimerizasyonu koşulları ve analiz sonuçları (Asandei vd. 2005)

a laktid/glikolid/1,10 dekandiol/Sn(Oct)₂, ^b NMR, ^c GPC

24

Analiz sonuçlarından glikolid monomerinin her koşulda % > 99 dönüşüme sahip olduğu, d,l-laktidin ise koşullara bağlı olarak dönüşüm oranının % 86-98 arasında olduğu belirlenmiştir. PLGA polimerinin sayıca ortalama molekül ağırlığının en yüksek 13114 g/mol (3500 psi, 110 ve süre 3 h) olduğu saptanmıştır.

Hile ve Pishko (2001), süperkritik akışkan ortamında PLGA sentezlemişlerdir. Halka açılma polimerizasyonu ile süperkritik karbondioksit ortamında polimer sentezi yüzey aktif madde varlığında gerçekleştirilmiştir. Deneylerde kalay oktaat başlatıcı ve florlu bir polimer (poli 1,1-dihidroperflorooktil akrilat) yüzey aktif madde olarak seçilmiştir.

Polimerizasyonda basınç 200 bar, sıcaklık 35-70 ^oC ve süre 6-72 h olarak denenmiştir.

Elde edilen PLGA polimeri ¹H-NMR, ¹³C-NMR ve GPC ile analiz edilmiştir.

Polimerizasyon süresi 6’dan 48 h’e arttıkça polimerin ağırlıkça ortalama molekül ağırlığının 2500-30200 g/mol arasında değiştiği belirlenmiştir. Polimerin molekül ağırlığında 48-72 h arasında önemli bir değişim gözlenmemiştir (Çizelge 2.2).

Çizelge 2.2 Tepkime süresinin molekül ağırlığı üzerindeki etkisi (Hile ve Pishko 2001)

a GPC analiz sonuçları

b Yüzey aktif madde olmadan gerçekleştirilen tepkime

25

2.7.3 Atmosfer koşulları ve süperkritik akışkan ortamında Fe3O4-polimer nanokompozitlerinin sentezi

Patel vd. (2008), çalışmalarında emülsifikasyon-difüzyon yöntemi ile 5 ± 1 nm büyüklüğe sahip Fe3O₄ nanotaneciklerini PLGA polimeri ile kaplamışlardır.

Sentezlenen nanoyapılar HRTEM, XRD, FTIR ile analiz edilmiş ve manyetik özelikleri belirlenmiştir. FTIR analiz sonuçlarından (Şekil 2.22) PLGA yapısında laktidten kaynaklanan C=O fonksiyonel grubuna ait pik (1760 cm⁻¹) belirlenmiş ve Fe₃O₄ nanotaneciklerinin PLGA polimeri ile başarıyla kaplandığı görülmüştür.

Süperparamanyetik özelikte Fe3O4-PLGA nanoyapılarının TEM görüntüsü şekil 2.23 ile verilmiştir.

Şekil 2.22 Fe3O4 ve Fe3O4-PLGA nanoyapılarının FTIR spektrumları (Patel vd. 2008)

Şekil 2.23 PLGA kaplı Fe3O₄ nanotaneciklerinin TEM görüntüleri (Patel vd. 2008)

26

Okassa vd. (2005), öncelikle birlikte çöktürme yöntemiyle Fe3O4 nanotaneciklerini sentezlemişlerdir. Sentezlenen manyetik nanotanecikler oleik asitle (OA) modifiye edilerek, PLGA ile kaplamada oleik asidin etkisi incelenmiştir. Fe3O4-PLGA nanokompozitlerinin sentezinde ikili emülsiyon yöntemi (w/o/w) uygulanmıştır. PLGA ile kaplanma etkinliği oleik asit varlığında % 60, oleik asit yokken % 48 olarak belirlenmiştir. Sentezlenen polimer kaplı nanoyapıların 268-327 nm aralığında büyüklüğe sahip oldukları saptanmıştır (Şekil 2.24).

Şekil 2.24 Nanokompozit yapıların TEM görüntüleri (Okassa vd. 2005)

a.b. Fe₃O₄-PLGA, c.d. Fe₃O₄-OA-PLGA

Hoa vd. (2011), süperkritik akışkan reaktör sisteminde poli (2-hidroksietilmetakrilat), PHEMA - Fe3O4 nanokompozitlerini sentezlemişlerdir. Ticari Fe3O4 nanotanecikleri metakriloksipropiltrimetoksisilan (MPTMS) ile modifiye edilerek kullanılmıştır.

Çalışmada sentez ortamı olarak süperkritik karbondioksit (SK-CO₂) seçilmiştir.

27

Polimerizasyonda kullanılmak amacıyla atmosfer ortamında kopolimerik yüzey aktif madde (poli [(2-dimetilamino) etilmetakrilat-ko-1H,1H-perflorooktil metakrilat]

(PDMAEMA-ko-PFOMA)) sentezlenmiştir. Nanokompozitler SEM, FTIR, XRD, TEM, XPS ve TGA ile analiz edilmiş ve manyetik özelikleri incelenmiştir. Sentezlenen nanotaneciklerin ortalama büyüklükleri 30.6 nm olarak belirlenmiştir (Şekil 2.25);

ancak araştırmacılar taneciklerin aglomere olduğunu saptamışlar, bunun nedenini de yüzey aktifin yeterince etkin olmaması ile açıklamışlardır. XRD sonuçlarından polimerle kaplama sonucunda manyetik nanotaneciklerin kristal yapısında herhangi bir değişim olmadığı belirlenmiştir (Şekil 2.26).

Şekil 2.25.a. Fe3O4, b. MPTMS ile modifiye Fe3O4 nanotaneciklerinin, c.d. Fe3O4 -PHEMA nanokompozitlerinin TEM görüntüleri (Hoa vd. 2011)

28

Şekil 2.26.a. Fe3O4 ve MPTMS ile modifiye Fe3O4 nanotaneciklerinin, b. Fe3O4 -PHEMA nanokompozitlerinin XRD sonuçları (Hoa vd. 2011)

Furlan vd. (2010), birlikte çöktürme yöntemi ile sentezledikleri Fe3O4 nanotaneciklerini risinoleik asit ile stabilize etmişlerdir. Polimer miktarı, yüzey aktif madde türü ve derişimi, çözücü miktarı, sonikasyon süresi gibi parametreler incelenerek, manyetik nanotanecikler atmosfer ortamında PLGA (poli (dl-laktid-ko-glikolid)) polimeri ile kaplanmıştır. Bu işlemde kullanılmış organik çözücü hızlı, temiz ve etkin bir süreç olan süperkritik akışkan ekstraksiyon sisteminde uzaklaştırılmıştır. Polimer kaplı manyetik nanokompozitlerin 140-230 nm büyüklüğe sahip oldukları belirlenmiştir (Şekil 2.27-2.28).

29

Şekil 2.27 Fe3O4-PLGA nanokompozitlerinin TEM görüntüleri (Furlan vd. 2010)

a. % 1 PVA % 15 Fe₃O₄, b. % 2 PVA % 15 Fe₃O₄, c. % 3 PVA % 30 Fe₃O₄, d. % 4 PVA % 15 Fe₃O₄

Şekil 2.28 Fe3O4-PLGA nanokompozitlerinin (% 3 PVA, % 15 Fe3O4) SEM görüntüsü (Furlan vd. 2010)

30

2.7.4 Fe3O4-polimer nanokompozitleri üzerine ilaç yükleme ve salım

Tansık vd. (2014), süperparamanyetik özelikte oleik asitle (OA) modifiye Fe3O₄ nanotaneciklerini (MNP) tekli yağ/su emülsiyonu (O/W) yöntemini kullanarak PLGA polimeri ile kaplamışlar ve yapı üzerine doksorubisin (DOX) antikanser ilacını yüklemişlerdir. TEM görüntülerinden OA-Fe3O4 nanotaneciklerinin ortalama büyüklüğünün 10 nm, DOX-PLGA-MNP yapısının ise 65 nm olduğu belirlenmiştir (Şekil 2.29).

Şekil 2.29 Nanotaneciklerin TEM görüntüleri (Tansık vd. 2014)

a. OA-Fe₃O₄, b. DOX-PLGA-MNP

Manyetik nanoyapı üzerine ilaç yükleme etkinliği % 32 olarak saptanmış ve pH 7.4'te doksorubisinin salım çalışmaları gerçekleştirilmiştir. 35 gün sonunda toplam ilacın % 65'inin salındığı belirlenmiştir (Şekil 2.30). DOX-PLGA-MNP nanoyapılarının MCF-7 kanser hücreleri üzerinde sitotoksik etkisi olduğu belirlenmiştir.

Şekil 2.30 DOX-PLGA-MNP nanoyapısından ilaç salım grafiği (Tansık vd. 2014)

31

Abdalla vd. (2010), kimyasal çöktürme ile Fe3O4 nanotaneciklerini sentezlemişler ve kaplama maddesi olarak polilaktik asit (PLLA) ve poli (l-laktik asit-ko-glikolit) (PLGA) olmak üzere iki farklı polimer kullanılmışlardır. In vitro ilaç yükleme çalışmaları için noskapin seçilmiştir. Şekil 2.31’de noskapinin kimyasal yapısı görülmektedir.

Çalışmada TEM, DLS, FTIR, VSM ve HPLC analizleri gerçekleştirilmiştir.

Şekil 2.31 Noskapin kimyasal yapısı (Abdalla vd. 2010)

Fe₃O₄ nanotaneciklerinin (10  2.5 nm) ve PLLA kabuk üzerine ilaç yüklenmiş nanotaneciklerin (252  6.3 nm) TEM görüntüleri şekil 2.32-2.33 ile verilmiştir.

Şekil 2.32 Sentezlenmiş Fe3O4 nanotaneciklerinin TEM görüntüleri (Abdalla vd. 2010)

32

Şekil 2.33 Noskapin yüklü Fe3O4 / PLLA nanotaneciklerin TEM görüntüleri (Abdalla vd. 2010)

İlaç yükleme çalışmalarında farklı miktarlarda noskapin (2.5, 5, 7.5, 10 ve 12.5 mg) yüklenmiştir.Polimerler açısından ilaç yüklemede düşük ve yüksek molekül ağırlığının etkisi incelenmiştir. Her iki polimer için de düşük molekül ağırlığının ilacın yüksek yüklenme oranına etkili olduğu belirlenmiştir.

Zhu vd. (2009), γ-Fe2O3 (maghemit) nanotaneciklerini, doğal polimer kitosanla (CS) kaplamışlardır. Bu nanotanecikler 5-Florourasil (5-Fu) kanser ilacı için taşıyıcı görevindedir. Nanotanecik sentezleme ve ilaç yükleme eş zamanlı olarak ters misel yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. İlaç yüklenmiş γ-Fe2O3 / kitosan manyetik nanotanecikler (CS–5-Fu-MNPs) TEM, VSM ve Fourier dönüşümlü infrared spektrofotometre (FTIR) ile karakterize edilmiştir. Araştırmacılar ilacın yükleme, salım ve sitotoksisite çalışmalarını gerçekleştirmişler, ultraviyole görünür bölge spektroskopisi (UV-vis) ile analiz yapmışlardır.

İlaç yüklenmiş küresel yapıda nanotaneciklerin büyüklüğü TEM analizleriyle 100  20 nm olarak belirlenmiştir (Şekil 2.34).

33

Şekil 2.34 CS-5 Fu-MNPs TEM görüntüleri (Zhu vd. 2009)

Biyouygulamalarda kullanılabilecek nanotaneciklerin manyetik özeliklerini incelemek amacı ile VSM analizi uygulanmıştır. Şekil 2.35’de verilen analiz sonucunda zorlayıcı alanın sıfır (0) olduğu görülmektedir. Bu nedenle taneciklerin süperparamanyetik özelikte olduğu sonucuna varılmıştır.

Şekil 2.35 CS-5 Fu-MNPs manyetizasyon eğrileri (Zhu vd. 2009)

İlaç yükleme çalışmalarında farklı kitosan ve 5-Fu oranlarında kitosan miktarı arttıkça yükleme oranının da arttığı saptanmıştır (Çizelge 2.3). İlaç salımında deneyler farklı kitosan ve 5-Fu oranlarında (fosfat tampon çözeltisi pH: 7.4) ve ayrıca 37 ^oC’ta farklı pH’a sahip tampon çözeltiler (PBS) içerisinde gerçekleştirilmiştir. İlacın salımına bakıldığında 2 h sonunda % 99 salım oranına ulaşıldığı belirlenmiştir. Farklı kitosan ve 5-Fu oranlarında maksimum salım oranının % 80 civarında olduğu ve kitosan-ilaç oranı

Manyetizasyon(emu/g)

Uygulanan alan (Oe)

Manyetizasyon(emu/g)

Uygulanan alan (Oe)

34

2:1 iken daha yüksek salımın gerçekleştiği görülmüştür. Farklı tampon çözeltilerde 82 h sonunda pH 7.4, 6.8 ve 1.2 için salım oranı % 82, % 67 ve % 57 olarak belirlenmiştir (Şekil 2.36).

Çizelge 2.3 Farklı örnekler için ilaç yükleme parametreleri ve sonuçlar (Zhu vd. 2009)

Örnek CS:5-Fu İlaç içeriği

(%)

Yükleme oranı (%)

I 4:1 20-23 85-92

II 2:1 16-18 60-68

Şekil 2.36 CS-5 Fu-MNPs’den 5-Fu in vitro ilaç salım grafikleri (Zhu vd. 2009)

a. Farklı oranlar (PBS 7.4), b. farklı tampon çözeltiler (4:1)

Çalışmada ilaç yüklenmiş nanotaneciklerin in vitro sitotoksisite deneyleri gerçekleştirilmiştir. Sitotoksisite belirlemesinde MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-ol)-2,5-difeniltetrazolyum bromit] analizi uygulanmıştır. İlaç yüklenmiş nanoyapı için K562 kanser hücreleri seçilmiştir. Şekil 2.37’de farklı derişimlerde ilaç yüklü nanotaneciklerin hücre öldürme etkisi görülmektedir. Yüksek derişimde kanserli hücrelerin ölüm oranının % 85 civarında olduğu saptanmıştır.

35

Şekil 2.37 CS-5 Fu-MNPs ve CS MNPs in vitro sitotoksisiteleri (K562 hücreleri) (Zhu vd. 2009)

Sonuç olarak çalışmada elde edilen çekirdek / kabuk nanoyapının kanser tedavisi sırasında 5-Florourasil ilacı için taşıyıcı olabileceği vurgulanmıştır.

Hu vd. (2006), manyetit (Fe₃O₄) üzerine biyobozunur polimer poli(L-laktik asit) (PLLA) kaplayarak manyetik yapıda nanotanecikler elde etmişlerdir. Polimer kaplamada yağ / su emülsiyonu içerisinde çözücünün buharlaştırılması ve ekstraksiyon işlemi uygulanmıştır. Çalışmada nanotaneciklerin üzerine kanser ilaçlarından tamoksifen yüklenerek ilacın hücre dışı (in-vitro) salımı incelenmiştir. Elde edilen nanotaneciklerin karakterizasyonu geçirimli elektron mikroskobu (TEM), dinamik ışık saçılım (DLS), ilaç yükleme kapasitesi yüksek basınç sıvı kromatografisi (HPLC) ve termogravimetrik analiz (TGA) ile manyetik özeliklerinin belirlenmesi ise titreşimli örnek magnetometresi (VSM) ile gerçekleştirilmiştir.

Tamoksifen yüklenmiş manyetit / poli(L-laktik asit) çekirdek / kabuk yapının TEM görüntüsü şekil 2.38’de verilmektedir. Polimer ile kaplanmış taneciklerin büyüklükleri ortalama 200 nm olarak belirlenmiştir.

36

Şekil 2.38 Tamoksifen yüklenmiş manyetit çekirdek / poli(L-laktik asit) kabuk yapının TEM görüntüsü (100 mg PLLA, 20 mg Fe3O₄, 5 mg tamoksifen) (Hu vd.

2006)

VSM analiz sonuçlarına göre ilaç yüklenmiş ve yüklenmemiş nanotaneciklerin manyetik özelik gösterdiği, ayrıca manyetik hedefli ilaç salımda önem taşıyan süperparamanyetik özelikte olduğu belirlenmiştir.

Çekirdek / kabuk nanoyapı üzerine ilaç yükleme çalışmalarında farklı miktarlarda tamoksifen kullanılmıştır. Nanotanecikler üzerinden ilaç salım çalışmaları % 5 sodyum lauril sülfat içeren fosfat tampon çözelti (pH 7.4) içerisinde gerçekleştirilmiştir. İlaç salımının 6. gün sonunda % 88 oranında olduğu görülmüştür (Şekil 2.39).

Şekil 2.39 Manyetik nanoyapıdan in vitro ilaç salımı (Hu vd. 2006)

37

Çalışmada ilaç yüklenmiş manyetik nanokompozitlerin MCF-7 meme kanseri hücreleri üzerinde sitotoksisiteleri incelenmiş, derişim arttıkça (50-500 mg/ml) hücrelerin ölüm oranının da arttığı belirlenmiştir. Sonuç olarak manyetit çekirdek / poli (L-laktik asit) kabuk nanoyapının tamoksifenin hedefli salımında kullanılabileceği vurgulanmıştır.

Sonuç olarak, literatürde birlikte çöktürme yöntemi ile sentezlenmiş ya da ticari olarak satın alınmış manyetit (Fe3O4) nanotaneciklerin yüzeyi 3-(aminopropil)trietoksisilan (APTES), oleik asit ve 3-(Trimetoksi) propil metakrilat MPTMS gibi bileşikler ile modifiye edilmiştir. Süperkritik ortamda PLGA polimerizasyonuna sıcaklık, basınç, süre, katalizör ve yüzey aktif madde türü etkisi incelenmiştir. Sentez sırasında kullanılan yüzey aktif maddenin CO₂’yi ve polimeri seven bölgelerden oluşması ve etkinliği yüksek florlu yüzey aktif maddelerin araştırılması gerektiği vurgulanmıştır.

Literatürde, atmosfer ortamında Fe₃O₄-PLGA nanokompozitleri sentezlenmiş, çalışmaların bazılarında da nanoyapı üzerine ilaç yükleme ve salım çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalarda doksorubisin, 5-florourasil, noskapin, tamoksifen ve taksol gibi antikanser ilaçlarının kullanıldığı saptanmıştır.

Bu doktora çalışmasında birlikte çöktürme ile sentezlenmiş Fe3O₄ nanotanecikleri detaylı olarak karakterize edilmiştir. Fe3O4 nanotaneciklerinin yüzeyi 3-(Trimetoksi) propil metakrilat, trietoksivinilsilan ve daha önce literatürde modifikasyon amacıyla denenmemiş 3-(Trietoksi) propil metakrilat ile modifiye edilmiştir. Yüzeyi modifiye manyetik nanotaneciklerin özelikleri karşılaştırmalı olarak ilk defa incelenmiştir.

Süperkritik ortamda PLGA polimerizasyonu deneylerinde basınç, yüzey aktif madde miktarı etkisi incelenmiştir. Süperkritik akışkan ortamında kullanılan yüzey aktif madde akciğer yüzey aktif maddelerine alternatif olarak geliştirilmiş olan C33H33F17N⁺I -kimyasal formülüne sahip olup, zincir uzunluğu insan sağlığına zarar vermeyecek değerdedir. Yüzeyi MPTMS ile modifiye Fe3O4 nanotanecikleriyle atmosfer ortamında Fe3O4 - MPTMS - PLGA nanokompozitleri sentezlenmiştir. Bu yapı üzerinde daha önce manyetik nanoyapılarla salımı incelenmemiş ifosfamit antikanser ilacı yükleme ve salım çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Ayrıca taksol antikanser ilacı Fe₃O₄ - MPTMS - PLGA nanokompozitleri üzerine ilk defa yüklenerek, salımı incelenmiştir.

38 3. MATERYAL ve YÖNTEM

Tez çalışması kapsamında kullanılan materyaller ve deneylerde uygulanan yöntemler;

Fe₃O₄ nanotaneciklerin sentezi, Fe₃O₄ nanotaneciklerinin yüzey modifikasyonu, atmosfer koşullarında yüzeyi modifiye Fe3O4 nanotaneciklerinin PLGA ile kaplanması, süperkritik akışkan ortamında PLGA sentezi, süperkritik akışkan ortamında Fe3O4

nanotaneciklerinin PLGA ile kaplanması, Fe3O4 -PLGA nanokompozitleri üzerine ilaç yüklenmesi, Fe3O4 - PLGA nanokompozitleri üzerinden ilaç salımının in vitro olarak incelenmesi ve sitotoksisite deneyleri bu bölümde verilmiştir.

3.1 Materyal

Çalışma kapsamında manyetik nanotaneciklerin sentezi ve yüzey modifikasyonunda FeCl2 . 4H2O (demir (II) klorür tetrahidrat, % 99, Sigma Aldrich), FeCl3 . 6H2O (demir (III) klorür hekzahidrat, % 97, Sigma Aldrich), NaOH (sodyum hidroksit, , ≥ % 98, Sigma Aldrich), HCl (hidroklorik asit, % 37, Sigma), 3-(trimetoksi) propil metakrilat (≥

% 98, Sigma), 3-(trietoksi) propil metakrilat (TCI Europe), trietoksivinilsilan (≥ % 97, Aldrich) ve toluen (Sigma Aldrich) kullanılmıştır.

Atmosfer ortamında yüzeyi modifiye Fe3O4 nanotaneciklerinin polimerle kaplanması çalışmalarında kullanılan poli(D,L-laktid-ko-glikolid) (PLGA, laktid:glikolid 50:50;

M_w: 30000-60000 g/mol), poli(vinil alkol) (PVA, M_w: 13000-23000 g/mol % 98 hidrolize) ve diklorometan (DCM) Sigma-Aldrich (Almanya) firmasından temin edilmiştir.

1-Bromooktadekan (Aldrich), dietilamin (Sigma), perflorooktil iyodür (Aldrich), aseton (Sigma) ve etanol (Sigma) yüzey aktif madde sentezinde; D,L Laktid (3,6-Dimethyl-1,4-dioxane-2,5-dione, Aldrich), glikolid (+ % 99, Sigma), kalay oktaat (Tin(II) 2-Ethylhexanoate, % 95, Aldrich) ve 1-10 dekandiol (Aldrich) ise süperkritik akışkan ortamında PLGA (poli dl-laktid-ko-glikolid) polimeri sentezinde kullanılmıştır.

39

Fe3O4 - PLGA nanokompozitlerinin üzerine ilaç yükleme ve salım çalışmalarında ifosfamit ( ≥ % 98, Sigma), taksol (paklitaksel, ≥ % 98, Sigma) , fosfat tampon çözeltisi (PBS, Sigma) ve tween 80 (Merck) kulanılmıştır.

Hücre kültür çalışmalarında kullanılan Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM), fetal sığır serumu (FBS), tripsin-EDTA (% 0.25) çözeltisi, penisilin streptomisin, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ol)-2,5-difenil tetrazolyum bromür (MTT) Sigma-Aldrich (Almanya), izopropanol ise Merck firmasından temin edilmiştir.

Hücre kültür deneylerinde kullanılan L929 fare fibroblast ve MG-63 insan osteosarkom hücreleri Hacettepe Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü’nden (Prof. Dr.

Hücre kültür deneylerinde kullanılan L929 fare fibroblast ve MG-63 insan osteosarkom hücreleri Hacettepe Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü’nden (Prof. Dr.

Belgede ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ (sayfa 32-0)