Taksol (Paklitaksel)

Taksol (TX), kanser tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir antineoplastik ilaçtır.

Göğüs, yumurtalık, cilt, akciğer, baş ve boyun kanserlerinin tedavisinde etkindir. Taksol ilk olarak 1971 yılında "Taxus brevifolia" bitkisinden ekstrakte edilmiştir. Beyaz toz kristal yapıda olan taksolün suda çözünürlüğü oldukça düşüktür. Molekül formülü C47H51NO14 ve molekül ağırlığı 853 g/mol'dür. Taksolün kimyasal yapısı şekil 3.3 ile verilmiştir (Yıldız vd. 2007, Schleich vd. 2013).

Şekil 3.3 Taksol kimyasal yapısı (Yıldız vd. 2007)

42 3.2 Yöntem

3.2.1 Fe3O4 nanotaneciklerin sentezi

Fe₃O₄ nanotanecikleri süreli yayınlara benzer şekilde (Nyiro-Kosa vd. 2009, Gaihre vd..

2008), deiyonize su ve HCl içeren çözelti içerisindeki Fe²⁺ ve Fe³⁺ iyonlarının alkali çözeltiye damlatılarak birlikte çöktürülmesi (Şekil 3.4) ile sentezlenmiştir. Manyetik nanotanecik sentezinde Fe²⁺ ve Fe³⁺ iyonlarının mol oranı 0.5 ve tepkime sıcaklığı 80

oC’de sabit tutulmuştur. Birlikte çöktürülen Fe3O4 nanotanecikleri 10000 rpm’de 20 dk (3 kez deiyonize su ile yıkama) santrifüjlenmiş ve 50 ^oC’de 24 h vakumda kurutulmuştur.

Şekil 3.4 Fe3O₄ sentezi deney düzeneği

3.2.2 Fe3O4 nanotaneciklerinin yüzey modifikasyonu

Fe3O4 nanotanecikleri toluen içerisinde ultrasonik etki ile dağıtılarak Fe3O4 miktarının daha fazlası kadar silanlı bileşik ((Trimetoksi) propil metakrilat MPTMS, 3-(Trietoksi) propil metakrilat MPTES ve Trietoksivinilsilan VS) çözeltiye eklenmiştir (Nguyen vd. 2011). Çözelti oda sıcaklığında 24 saat süreyle azot atmosferi altında çalkalayıcıda karıştırılmış, yüzeyi modifiye edilmiş Fe3O₄ nanotanecikleri 10000 rpm’de 10’ar dk (3 kez toluen ile yıkama) santrifüjlenmiştir. Vakum altında 60 ^oC’de 24 saat süreyle kurutma işlemi ile yüzeyi modifiye manyetik nanotanecikler elde edilmiştir.

Fe3O4 taneciklerinin 3-(trimetoksi) propil metakrilat (MPTMS) ile yüzey modifikasyonunun şematik gösterimi şekil 3.5’de verilmiştir.

43

Şekil 3.5 Fe3O4 nanotaneciklerinin silanlı bileşik ile yüzey modifikasyonunun şematik gösterimi (Arsalani vd. 2010)

3.2.3 Atmosfer koşullarında Fe3O4 nanotaneciklerinin PLGA ile kaplanması

Atmosfer ortamında PLGA kaplama çalışmalarında modifikasyon etkinliği yüksek olan Fe₃O₄ - MPTMS nanotanecikleri kullanılmıştır.

3.2.3.1 O/W (yağ/su) tekli emülsiyonu I

Fe₃O₄-PLGA manyetik nanokompozitlerinin sentezinde kullanılan ilk yöntemde PLGA polimeri diklorometan (DCM) içerisinde çözünmüştür. Manyetik nanotanecikler ultrasonik banyoda PLGA çözeltisi içerisinde dağıtılmıştır. Karışım 4 ml PVA (ortMw: 13000-23000; 89000-98000, % 1 ya da % 3) çözeltisi içerisine katılmış, 20000 rpm’de homojenizatörde 30 s karıştırma yapılarak tekli emülsiyon elde edilmiştir. Emülsiyon % 0.3’lük 50 ml PVA çözeltisi içerisine alınarak mekanik karıştırma (250 rpm) ile DCM’ın uzaklaştırılması sağlanmıştır. Polimer kaplı manyetik nanotanecikler deiyonize su (DI) ile yıkanarak mıknatıs yardımı ile ayrılmıştır. Elde edilen nanoyapılar farklı yöntemlerle kurutularak +4 ^oC’de saklanmıştır (Okassa vd. 2007, Abdalla vd. 2010, Raut vd. 2010). Deney koşulları çizelge 3.1’de verilmiştir.

44

Çizelge 3.1 Atmosfer ortamında Fe3O4-PLGA nanokompozitlerinin sentezinde O/W tekli emülsiyonu I ile sentezi deney koşulları

Manyetik

45 3.2.3.2 O/W (yağ/su) tekli emülsiyonu II

Fe₃O₄-PLGA nanokompozitlerinin kullanılan ikinci yöntemde PLGA polimeri DCM içerisinde çözünmüştür. Manyetik nanotanecikler ultrasonik prob ile DCM’da dağıtılmıştır. Dispersiyon vortekslenerek organik PLGA çözeltisi ile karıştırılmış, 4 ml PVA (ortMw: 13000-23000; 31000-50000, % 1 ya da % 3) çözeltisi karışıma eklenerek ultrasonik prob yardımı ile tekli emülsiyon elde edilmiştir. Emülsiyon % 0.3’lük 50 ml PVA çözeltisi içerisine alınarak mekanik karıştırma (500 rpm) ile DCM’ın uzaklaştırılması sağlanmıştır. Polimer kaplı manyetik nanotanecikler deiyonize su ile yıkanarak mıknatıs yardımı ile ayrılmıştır. Elde edilen nanoyapılar % 50 sulu HCl çözeltisi ile yıkanarak polimer kaplanmamış Fe3O4 nanotaneciklerinin uzaklaştırılması sağlanmıştır. Nanotanecikler +4 ^oC’de DI içerisinde saklanmıştır (Tansık vd.2014).

Deney koşulları çizelge 3.2’de verilmiştir.

Çizelge 3.2 Atmosfer ortamında Fe3O4-PLGA nanokompozitlerinin sentezinde O/W tekli emülsiyonu II ile sentezi deney koşulları

Manyetik

46

Çizelge 3.2 Atmosfer ortamında Fe3O4-PLGA nanokompozitlerinin sentezinde O/W tekli emülsiyonu II ile sentezi deney koşulları (devam)

Fe₃O₄-MPTMS

3.2.3.3 O/W (yağ/su) tekli emülsiyonu II-a

Yöntemde O/W II'den farklı olarak manyetik polimer karışımına 4 ml PVA (ortMw: 13000-23000) çözeltisi eklenerek 20000 rpm’de homojenizatörde 30 s karıştırma ile tekli emülsiyon elde edilmiştir. Deney koşulları çizelge 3.3’te verilmiştir.

Çizelge 3.3 Atmosfer ortamında Fe3O4-PLGA nanokompozitlerinin sentezinde O/W tekli emülsiyonu II-a ile sentezi deney koşulları

Manyetik

3.2.3.4 O/W (yağ/su) tekli emülsiyonu III

Manyetik nanotanecikler (40 mg) ultrasonik prob ile DCM’da dağıtılmış ve PLGA polimeri (50 mg) DCM'da çözünmüştür. Manyetik nanotanecikler PLGA çözeltisi

47

içerisinde ultrasonik prob yardımı ile dağıtılmıştır. Elde edilen organik karışım hızla % 1 PVA çözeltisi içerisine eklenmiş ve homozenizatörde 20000 rpm’de 30 s karıştırma yapılmıştır. Emülsiyon 75 ml % 1'lik PVA çözeltisi içerisine eklenerek 4 h mekanik karıştırma (500 rpm) sonucu DCM uzaklaştırılmıştır. Nanokompozitler santrifüj, DI su ve % 50 sulu HCl çözeltisi ile yıkama işlemleriyle ayrılmış, 48 h dondurarak kurutma işlemiyle + 4 ^oC’de saklanmıştır (Ashjari vd. 2011).

3.2.4 Süperkritik akışkan ortamında PLGA sentezi

Süperkritik karbondioksit (SK-CO2) ortamında PLGA sentezi deneyleri süperkritik reaktör sisteminde (Şekil 3.6-3.7) gerçekleştirilmiştir. Reaktör içerisine D,L laktid ve glikolid monomerleri molce 50:50 olacak şekilde yerleştirilmiştir. Başlatıcı 1-10 dekandiol, katalizör kalay oktaat ve yüzey aktif madde (YAM) eklenerek süperkritik karbondioksit ortamında PLGA polimerizasyonu gerçekleştirilmiştir. PLGA polimerizasyonuna tepkime basıncı (200-240 bar) ve YAM miktarının (0-0.05 g) etkisi incelenmiştir. 3 h tepkime süresi sabit tutularak sentezlenen PLGA polimeri FTIR, ¹ H-NMR ve GPC ile analiz edilmiştir.

Şekil 3.6 Süperkritik reaktör sistemi şematik gösterimi (Yılmaz 2009)

Soğut

48

Şekil 3.7 Süperkritik reaktör sistemi görüntüsü

3.2.4.1 Yüzey aktif madde (YAM) sentezi

Süperkritik akışkan ortamında kullanılan yüzey aktif madde akciğer yüzey aktif maddelerine alternatif olarak geliştirilmiş ve C33H33F17N⁺I^- kimyasal formülüne sahiptir.

Yüzey aktif maddenin kimyasal yapısı şekil 3.8'de verilmiştir.

Şekil 3.8 Yüzey aktif madde C33H33F17N⁺I^-, FHCL (N,N-dietil-N (4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,9,9,10,10,11,11,11 heptadekafloroundesil) oktadekan-1-amonyum) kimyasal yapısı (Aydoğan vd. 2011)

49

Yüzey aktif madde sentezi iki aşamada gerçekleştirilmiştir;

1. 1-Bromooktadekan aseton içerisinde dağıtıldıktan sonra karışım dietilamin içerisine damla damla eklenmiştir. 37^oC’da gerçekleştirilen tepkime 28 saat sonra sonlandırılmıştır. Vakumda süzme ve döner buharlaştırıcıda kurutma işlemlerinden sonra 1. basamak ürünü C22H47N elde edilmiştir.

2. 1. basamak ürünü, etanol ve florokarbon (C₁₁H₆F₁₇I) karışımı geri soğutucu altında 50^oC ‘da 48 h, sonrasında ise 80^oC ‘da 120 h tepkimeye sokulmuştur.

Etanolün uzaklaştırılması,  10 kez hekzanla yıkama, döner buharlaştırıcıda kurutma ve asetonitril ile  5 kez rekristalizasyon işlemleri ile yüzey aktif madde C33H33F17N⁺I^- sentezlenmiştir.

3.2.4.2 Kloroform ve THF (tetrahidrofuran) içerisinde çözünürlük deneyleri

Polimerizasyon sırasında kullanılan monomerler, başlatıcı, katalizör, yüzey aktif madde, ticari ve farklı koşullarda sentezlenen PLGA polimerlerinin kloroform ve THF içerisindeki çözünürlük davranışları incelenmiştir. SK-CO2 ortamında sentezlenen PLGA polimerinin proton nükleer manyetik rezonans spektrometresi (¹H-NMR) ve jel geçirgenlik kromatografisi (GPC) ile analizinde çözünürlüğü artırabilmek amacıyla D,L laktid ve glikolid monomerleri saflaştırılarak da kullanılmıştır. Bu işlem için monomerler etil asetat içerisinde ısıtılarak ( 55 ^oC) yeniden kristallendirilmiştir. PLGA sentezinde monomerler D,L laktid ve glikolid, başlatıcı ve katalizör kalay oktaat (Sn(Oct)₂) reaktör içerisine yerleştirilerek istenen sıcaklık ve basınçta tepkimeler gerçekleştirilmiştir. Deneyler sırasında 110 ^oC tepkime sıcaklığı ve 3 h tepkime süresi sabit tutulmuştur. Çizelge 3.4-3.7'de PLGA sentezinde gerçekleştirilen farklı deney koşulları ve çözünürlük deneyleri verilmiştir.

50 Çizelge 3.4 THF içerisinde çözünürlük deneyleri

Madde Derişim Süre

*Not: Deneylerde Sn(Oct)₂: 10 µl, sıcaklık: 110 ^oC, basınç: 200 bar ve süre: 3 h olarak sabit tutulmuştur.

51

Çizelge 3.5 Kloroform içerisinde çözünürlük deneyleri

Madde Derişim Süre

*Not: Deneylerde Sn(Oct)₂: 10 µl, sıcaklık: 110 ^oC, basınç: 200 bar ve süre: 3 h olarak sabit tutulmuştur.

52

Not: Deneylerde süre: 3 h olarak sabit tutulmuştur, rk = rekristalize

Çizelge 3.7 Kloroform ve THF içerisinde çözünürlük deneyleri

Madde Derişim Süre

Kloroform THF Kloroform THF

rk_dl-laktid : rk_glikolid

Not: Deneylerde Sn(Oct)₂: 10 µl, sıcaklık: 110 ^oC, basınç: 200 bar ve süre: 3 h olarak sabit tutulmuştur.

53

3.2.5 Süperkritik akışkan ortamında Fe3O4 nanotaneciklerinin PLGA ile kaplanması

3.2.5.1 Ticari PLGA ile kaplama çalışmaları

Fe₃O₄ - MPTMS nanotanecikleri (40 mg) ultrasonik prob ile DCM’da dağıtılmış ve PLGA polimeri (50 mg) ile yüzey aktif madde C33H33F17N⁺I^- (5 mg) DCM'da çözünmüştür. Oluşan süspansiyon süperkritik reaktör içerisine yerleştirilmiştir. 35 ^oC sıcaklık ve 100 bar basınç altında 3 h süreyle kesikli sistemde karıştırma yapılmıştır.

3.2.5.2 Polimerizasyon ile kaplama çalışmaları

SK-CO2 ortamında Fe3O4-PLGA nanokompozitlerinin sentezi deneylerinde D,L laktid ve glikolid oranı 85:15, kalay oktaat (Sn(Oct)2) miktarı, 110 ^oC tepkime sıcaklığı ve 3 h tepkime süresi sabit tutulmuştur. Fe3O4-MPTMS (0.03-0.1 g) ve YAM (0-0.05 g) miktarlarının etkisi incelenmiştir. Deney koşulları çizelge 3.8’de verilmiştir.

Çizelge 3.8 SK-CO2 ortamında Fe3O4-PLGA nanokompozitlerinin sentezi deney koşulları

54

3.2.6 Fe3O4 - PLGA nanokompozitleri üzerine ilaç yükleme çalışmaları

3.2.6.1 İfosfamit yükleme çalışmaları

Manyetik nanotanecikler ultrasonik prob ile DCM’da dağıtılmış ve PLGA polimeri DCM'da çözünmüştür. İfosfamit ilacı DI su içerisinde çözünmüştür. Manyetik nanotanecikler ultrasonik etki ile ilaç çözeltisi içerisine eklenmiştir. Oluşan O/W tekli emülsiyonu PLGA çözeltisi içerisinde ultrasonik prob yardımı ile dağıtılmıştır (O/W/O). Elde edilen emülsiyon hızla % 1 PVA çözeltisi içerisine eklenmiş ve homojenizatörde 20000 rpm’de 30 s karıştırma yapılmıştır. O/W/O/W çoklu emülsiyonu 75 ml % 1'lik PVA çözeltisi içerisine eklenerek 4 h mekanik karıştırma (500 rpm) sonucu DCM uzaklaştırılmıştır. Nanokompozitler santrifüj ve DI su ile yıkama işlemleriyle ayrılmış, 48 h dondurarak kurutma işleminden sonra + 4 ^oC’de saklanmıştır (Ashjari vd. 2011). Sentezden hemen sonra manyetik yapılardan ayrılan sıvı da analiz edilmiştir.

3.2.6.2 Taksol (Paklitaksel) yükleme çalışmaları

Manyetik nanotanecikler ultrasonik prob ile DCM’da dağıtılmış, taksol ilacı ve PLGA polimeri DCM'da çözünmüştür. Manyetik nanotanecikler PLGA çözeltisi içerisinde ultrasonik prob yardımı ile dağıtılmıştır. Elde edilen organik karışım hızla %1 PVA çözeltisi içerisine eklenmiş ve homozenizatörde 20000 rpm’de 30 s karıştırma yapılmıştır. Emülsiyon 75 ml % 1'lik PVA çözeltisi içerisine eklenerek 4 h mekanik karıştırma (500 rpm) sonucu DCM uzaklaştırılmıştır. Nanokompozitler santrifüj ve DI ile yıkama işlemleriyle ayrılmış, 48 h dondurarak kurutma işleminden sonra + 4 ^oC’de saklanmıştır (Ashjari vd. 2011).

İlaç yüklü nanotaneciklerin ilaç içeriği ve enkapsülasyon etkinliğini belirlemek amacıyla nanoyapılar DCM içerisinde çözünmüş ve ilaç sıvı-sıvı ekstraksiyon yöntemiyle asetonitril:DI su (% 50:50) HPLC taşıyıcı fazına alınmıştır. Analiz verileri 3.1 ve 3.2 denklemleriyle (Ashjari vd. 2011) değerlendirilmiştir.

55 İlaç içeriği = nanoyapı içerisindeki ilaç miktarı

Fe₃O₄ − PLGA − ilaç nanoyapı miktarı x 100 (3.1)

Dondurarak kurutulmuş ilaç yüklü nanokompozitler (10 mg) PBS tampon çözeltisi (%

0.1 w/v tween 80, % 0.01 w/v sodyum azid, 10 ml) içerisine alınmıştır. İfosfamit yüklü nanoyapıların salım deneylerinde PBS çözeltisinin pH'ı 7.4, çalkalamalı hava banyosunun sıcaklığı 37 ^oC ve rpm değeri 30 olarak ayarlanmıştır. Belirli zaman aralıklarında 1 ml örnek alınarak, yerine aynı miktarda taze PBS çözeltisi eklenmiştir.

Taksol yüklü nanoyapıların salım çalışmalarında ise iki farklı pH'ta (7.4 ve 5.5) PBS çözeltisi kullanılmıştır. 37 ^oC ve 150 rpm'de çalkalama yapılmıştır. Taksol suda çözünmeyen bir ilaç olduğundan salım sırasında belirli sürelerde örneklerin tamamı (10 ml) santrifüjlenmiş ve süpernatant HPLC analizi için ayrılmıştır. Nanotanecikler üzerine taze PBS çözeltisi (10 ml) eklenmiştir. Süpernatant içerisindeki taksol sıvı-sıvı ekstraksiyon ile ayrılmıştır. Bu işlemde antikanser ilacı içeren PBS çözeltisi içerisine 1 ml DCM eklenerek çalkalama yapılmıştır. Faz ayrımı gözlendikten sonra organik faz ayrılmıştır. DCM fazı üzerine asetonitril:DI su (% 50:50, 3 ml) eklenerek, ilacın HPLC taşıyıcı fazına geçmesi sağlanmış, sıvı içerisinden N2 gazı geçirilerek DCM uzaklaştırılmıştır.

3.2.8 Sitotoksisite deneyleri

In vitro sitotoksisite deneyleri, L929 fare fibroblast ve MG-63 insan osteosarkom hücreleri kullanılarak yürütülmüştür.Hücrelerin kültürasyon işlemi % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve % 1 penisilin streptomisin içeren DMEM besi ortamında 37 ºC ‘daki Thermo Scientific marka CO₂ (% 5) inkübatöründe gerçekleştirilmiştir. Hücre kültür

56

çalışmalarında TCPS, taksol ve Fe3O4-PLGA-Taksol nanokompozitleri olmak üzere 3 farklı grup kullanılmıştır. 24 gözlü hücre kültür plaklarına L929 ve MG-63 hücreleri ekilmiş ve hücrelerin yüzeye tutunmaları ve çoğalmaları sağlanmıştır. Hücrelerin besi ortamı uzaklaştırılarak farklı derişimlerde (2, 10, 20 µg/ml) yapılar eklenmiştir. 72 h hücre canlılığının takibi amacıyla MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-ol)-2,5-difenil tetrazolyum bromür) analizleri gerçekleştirilmiştir. Besi ortamına MTT çözeltisi eklenen hücreler 37 ºC ‘daki % 5 CO2 içeren etüvde 3 saat süreyle inkübe edilmiş, çözeltinin uzaklaştırılmasının ardından oluşan formazan kristallerinin çözünmesi için izopropanol:HCl (0.1 N) çözeltisi eklenerek 37 ºC’da 1 saat süreyle bekletilmiştir. Bu süre sonunda elde edilen çözeltinin 690 nm referans olmak üzere 570 nm'de absorbans değeri ölçülerek canlı hücre miktarı kalorimetrik olarak tayin edilmiştir.

3.3 Analizler

3.3.1 Fourier dönüşümlü infrared spektroskopisi (FTIR)

Analizler Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliğinde FTIR Shimadzu 8400 S cihazında gerçekleştirilmiştir. Potasyum bromür (KBr) kullanılarak tablet haline getirilen manyetik örneklerin analizi 4000-500 cm^-1 dalga sayısı aralığında gerçekleştirilmiştir.

3.3.2 Taramalı elektron mikroskobu ve enerji dağılım spektroskopisi (SEM-EDS)

Analizler ODTÜ Merkez Laboratuvarı QUANTA 400F Field Emission SEM cihazında gerçekleştirilmiştir. Örnekler farklı organik çözücüler (metanol, toluen) içerisinde ultrasonik etki ile dağıtılmış ve SEM "stub" ları üzerine damlatılıp kurutularak hazırlanmıştır.

3.3.3 Geçirimli elektron mikroskobu (TEM)

Analizler ODTÜ Merkez Laboratuvarı FEI Tecnai G² Spirit BioTWIN cihazında gerçekleştirilmiştir. Örnekler, sentez sonrası direkt ya da farklı organik çözücüler

57

(metanol, toluen) içerisinde ultrasonik etki ile dağıtma sonucu karbon kaplı bakır grid üzerine damlatma yapılarak hazırlanmıştır.

3.3.4 X-ışınları kırınımı (XRD)

Analizler ODTÜ Merkez Laboratuvarı Rigaku Ultima-IV X-Işını Kırınım cihazında gerçekleştirilmiştir. Toz numuneler 2 derece/dakika tarama hızında analiz edilmiştir.

3.3.5 Titreşimli örnek magnetometresi (VSM)

Analizler ODTÜ Merkez Laboratuvarı Cryogenic Limited PPMS ve Ankara Üniversitesi Fizik Mühendisliği Microsense EV9 cihazlarında oda sıcaklığında gerçekleştirilmiştir.

3.3.6 Proton nükleer manyetik rezonans spektrometresi (¹H-NMR)

1H-NMRanalizi ODTÜ Merkez Laboratuvarında bulunan NMR Spektrometresi (Bruker) ile gerçekleştirilmiştir. CDCl3 (d-kloroform) çözücü olarak kullanılmıştır.

3.3.7 Jel geçirgenlik kromatografisi (GPC)

Analizler ODTÜ Merkez Laboratuvarında bulunan Polymer Laboratories PL-GPC 220 cihazıile gerçekleştirilmiştir. THF (tetrahidrofuran) çözücü olarak kullanılmıştır.

3.3.8 Askıda damla cihazı

Kontakt açısı ölçümleri Hacettepe Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü Prof. Dr.

Nihal AYDOĞAN’ın Araştırma Laboratuvarı'nda bulunan Krüss DSA 10 cihazı ile gerçekleştirilmiştir.

58 3.3.9 Termogravimetrik analiz (TGA)

Analizler Hacettepe Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümü’nde PERKIN ELMER SII Exstar 6000 TG-DTA6300 cihazında 25-500 ^oC sıcaklık aralığında gerçekleştirilmiştir. Azot atmosferi altında 10 ^oC/dk ısıtma hızında çalışılmıştır.

3.3.10 Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) analizi

Analizler Ankara Üniversitesi Kimya Mühendisliği Bölümünde HPLC Spectra System ve HPLC Shimadzu cihazlarında gerçekleştirilmiştir. Analiz koşulları ifosfamit içinODS-3 kolon 4.6 x 250 mm, mobil faz asetonitril / su (% 30:70), akış hızı 1.5 ml / min, kolon sıcaklığı 40 ^oC, enjeksiyon hacmi 20 µL, UV dedektör dalga boyu 195 nm;

taksol içinODS-3 kolon 4.6 x 250 mm, mobil faz asetonitril / su (% 50:50), akış hızı 1.5 ml / min, kolon sıcaklığı 40 ^oC, enjeksiyon hacmi 20 µL, UV dedektör dalga boyu 227 nm şeklindedir (Mu ve Feng 2001, Pandit vd. 2011).

59 4. BULGULAR ve TARTIŞMA

Tez çalışması kapsamında Fe3O₄ nanotaneciklerinin sentezi, Fe₃O₄ nanotaneciklerinin yüzey modifikasyonu, atmosfer koşullarında yüzeyi modifiye Fe3O₄ nanotaneciklerinin PLGA ile kaplanması, süperkritik akışkan ortamında PLGA sentezi, süperkritik akışkan ortamında Fe3O4 nanotaneciklerinin PLGA ile kaplanması, Fe3O4 -PLGA nanokompozitleri üzerine ilaç yüklenmesi, Fe3O4 - PLGA nanokompozitleri üzerinden ilaç salımının in vitro olarak incelenmesi ve sitotoksisite deneyleri sonucunda elde edilen bulgular bu bölümde verilmiştir.

4.1 Fe₃O₄ Nanotaneciklerinin Sentezi ve Karakterizasyonu

Alkali ortamda birlikte çöktürme ile sentezlenmiş Fe3O4 nanotaneciklerinin FTIR spektrumu şekil 4.1 ile verilmiştir.

Şekil 4.1 Alkali ortamda sentezlenen Fe3O4 taneciklerinin FTIR spektrumu

Alkali ortamda sentezlenen Fe3O4 nanotaneciklerinin FTIR spektrumu incelendiğinde Fe-O bağı karakteristik pikinin 580 cm^-1, 3600-3200 cm^-1 aralığında geniş bir pik şeklinde beklenen –OH fonksiyonel grubuna ait karakteristik pikin ise 3400 cm^-1 civarında olduğu saptanmıştır. –OH grubuna ait karakteristik pikin nemden değil de

60

Fe3O4 nanotaneciklerinden kaynaklı olduğunu kanıtlayabilmek için örnekler etüvde kurutularak analiz edilmiştir. Fonksiyonel grubun alkali ortam nedeni ile Fe3O4

yüzeyinden (Şekil 4.2) kaynaklandığı belirlenmiştir (Dilnawaz vd. 2010). Ayrıca ticari olarak satın alınmış Fe3O4 nanotaneciklerinin (< 50 nm) FTIR analizi (Şekil 4.3) ile bu çalışmada sentezlenen manyetik nanotaneciklerin FTIR spektrumlarının birbiri ile uyumlu olduğu sonucuna varılmıştır. Süreli yayınlarda (Nguyen vd. 2011, Lu vd. 2010) Fe3O4’e ait FTIR spektrumlarında Fe-O bağı karakteristik pikinin 570 cm^-1, 3600-3200 cm^-1 aralığında geniş bir pik şeklinde beklenen -OH fonksiyonel grubuna ait karakteristik pikin ise 3330 ve 3398 cm^-1 civarında olduğu belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar literatürdeki bulgular ile uyumludur.

Şekil 4.2 Fe3O4 nanotaneciklerinin şematik gösterimi (Dilnawaz vd. 2010)

Şekil 4.3 Ticari Fe3O4 nanotaneciklerinin FTIR spektrumu

61

Fe3O4 nanotaneciklerinin TEM görüntüleri ve büyüklük dağılımları literatür çalışmalarıyla (Gu vd. 2005, Liang vd. 2011) karşılaştırmalı olarak şekil 4.4 ile verilmiştir.

Şekil 4.4.a.b.c Sentezlenen Fe3O4 nanotaneciklerinin farklı bölgelerden elde edilen TEM görüntüleri, d. büyüklük dağılımları, e. Gu vd. 2005, f. Liang vd.

2011

62

Fe3O4 nanotaneciklerinin TEM görüntüleri incelendiğinde taneciklerin kısmen de olsa aglomere oldukları saptanmıştır. Fe3O4 nanotaneciklerinin büyüklük dağılımlarından ortalama tanecik büyüklüğünün 8.8 ± 1.8 nm olduğu belirlenmiştir (Şekil 4.4.d) ve süreli yayınlara benzer özeliklerde sentezlendiği belirlenmiştir (Şekil 4.4.e.f.).

Fe3O4 nanotanecikleri elementel analiz yapılması amacı ile SEM-EDS görüntüsü elde edilmiştir. Fe3O4 nanotaneciklerinin şekil 4.5’te verilen SEM-EDS görüntüsünde yeşil bölgeler Fe, kırmızı bölgeler O ve mavi bölgeler ise C elementini ifade etmektedir.

Örnekler karbon bant üzerinde analizlendiği için analiz sonucunda örnek içerisinde yer almayan C elementi saptanmıştır.

Şekil 4.5 Fe3O4 nanotaneciklerinin SEM-EDS analiz sonucu

a. analiz için taranan bölge, b. bölgenin boyalı gösterimi, c. grafiksel gösterim

63

Sentezlenen Fe3O4 nanotaneciklerinin süreli yayınlarla karşılaştırmalı şekilde XRD analiz sonucu şekil 4.6’da verilmiştir.

Şekil 4.6.a. Sentezlenen, b. süreli yayınlarda (Wu vd. 2011) elde edilmiş Fe3O4

nanotaneciklerinin XRD analiz sonuçları

Sentezlenen Fe3O4 nanotaneciklerinin XRD kırınım pikleri incelendiğinde karakteristik piklerin standart Fe₃O₄ kristal yapısını (Şekil 4.7) gösterdiği ve süreli yayınlarla uyumlu olduğu belirlenmiştir (Şekil 4.6).

Şekil 4.7 Fe3O₄ kristal yapısının şematik gösterimi (Teja vd. 2009)

XRD analiz sonucuna göre sentezlenen taneciklerin kristal çapları Sherrer eşitliğine (Wu vd. 2011) göre hesaplanmış (EK 1) ve sonuçlar çizelge 4.1'de verilmiştir.

64

Çizelge 4.1 XRD analiz sonucuna göre hesaplanan kristal çapları

Kristal düzlemi 2-theta(deg) Kristal çapı (nm)

220 30.34 8.8

311 35.38 8.4

400 43.36 13

422 53.84 13.5

511 57.16 8.7

440 62.73 9.4

622 74.37 7.3

Fe3O4 nanotaneciklerinin manyetik özelikleri oda sıcaklığında VSM ile analiz edilmiştir (Şekil 4.8.a). Analiz sonucunda görülen zorlayıcı alanın (koersivite) sıfır “0” olması süperparamanyetik maddelerde beklenen bir özeliktir (Şekil 2.2). Sentezlenen Fe3O4

nanotaneciklerinin doygunluk mıknatıslanması süreli yayınlara (Wei vd. 2012) benzer şekilde 58.87 emu/g olarak belirlenmiştir (Şekil 4.8.a.b).

Şekil 4.8.a. Sentezlenmiş Fe3O4 nanotaneciklerinin, b. süreli yayınlarda sentezlenmiş Fe₃O₄ nanotaneciklerinin VSM analiz sonucu (Wei vd. 2012)

65

4.2 Fe3O4 Nanotaneciklerinin Yüzey Modifikasyonu

Fe₃O₄ nanotaneciklerinin yüzey modifikasyonunda üç farklı silanlı bileşik (3-(Trimetoksi) propil metakrilat (MPTMS), 3-(Trietoksi) propil metakrilat (MPTES) ve Trietoksivinilsilan (VS) kullanılmıştır. Bu çalışmada Fe3O4 nanotaneciklerinin MPTES ile modifikasyonu ilk defa gerçekleştirilmiştir.

Yüzeyi silanlı bileşiklerle modifiye taneciklerin FTIR analiz sonuçları Fe3O4

nanotaneciklerinin FTIR spektrumu ile karşılaştırmalı olarak şekil 4.9’da verilmiştir.

Şekil 4.9.a. Fe3O₄, b. Fe₃O₄-MPTMS, c. Fe₃O₄-MPTES, d. Fe₃O₄-VS nanotaneciklerinin FTIR spektrumları

Süreli yayınlarda (Arsalani vd. 2010, Nguyen vd. 2011) Fe3O4 nanotaneciklerinin yüzeyi 3-(Trimetoksi) propil metakrilat ile modifiye edildiğinde FTIR spektrumlarında C = O : 1700-1719 cm^-1, C = C : 167-1648 cm^-1, C-O : 1172 cm^-1, Si-O : 996-1017 cm^-1, Fe-O : 580 cm^-1 karakteristik pikleri belirlenmiştir. Bu çalışmada toluen ortamında

66

sentezlenen 3-(Trimetoksi) propil metakrilat ile modifiye Fe3O4 spektrumlarında karakteristik pikleri literatüre benzer olarak C = O : 1705 cm^-1, C = C : 1635 cm^-1, C-O : 1165 cm^-1, Si-O : 1064 cm^-1, Fe-O : 578 cm^-1 dalga sayılarında saptanmıştır (Şekil 4.9.b).

Fe3O4 nanotaneciklerinin yüzeyi trietoksivinilsilan ile modifiye edildiğinde elde edilen FTIR spektrumlarında karakteristik pikler C = C : 1635 cm^-1, = CH2 : 1411 cm^-1, Si-O : 1080 cm^-1 (geniş bir pik olduğu için bazı piklerin bir arada oldukları düşünülmektedir), Fe-O : 586 cm^-1 olarak belirlenmiştir (Şekil 4.9.d). Akbarzadeh vd. (2012) çalışmalarında Fe₃O₄ nanotaneciklerinin yüzeyi trietoksivinilsilan ile modifiye edildiğinde FTIR spektrumlarında C = C : 1648 cm^-1, = CH₂ : 1411 cm^-1, Si-O :1116, 1041, 962 cm^-1, Fe-O : 568 cm^-1 karakteristik piklerini saptamışlardır.

Bu çalışmada FTIR spektrumları değerlendirildiğinde genel olarak karakteristik piklerin süreli yayınlarla uyumlu olduğu sonucuna varılmıştır. Fe3O₄ nanotaneciklerinin 3-(Trietoksi) propil metakrilat (MPTES) ile modifiye edildiği çalışmaya şimdiye kadar rastlanmamıştır; ancak bileşiğin yapı olarak 3-(Trimetoksi) propil metakrilata benzerliği göz önünde bulundurularak pikler incelenmiş ve yüzey modifikasyonunun gerçekleştirildiği belirlenmiştir (Şekil 4.9.c).

MPTMS, MPTES ve VS ile yüzeyi modifiye edilmiş Fe3O4 nanotaneciklerinin TEM görüntüleri ve büyüklük dağılımları süreli yayınlarla karşılaştırmalı olarak şekil 4.10-4.12 ile verilmiştir.

67

Şekil 4.10.a.b. MPTMS ile yüzeyi modifiye Fe3O4 nanotaneciklerinin farklı bölgelerden elde edilen TEM görüntüleri, c. büyüklük dağılımları, d. süreli yayınlarda sentezlenmiş nanotanecikler (Nguyen vd. 2012)

68

Şekil 4.11.a.b. MPTES ile yüzeyi modifiye Fe3O₄ nanotaneciklerinin farklı bölgelerden elde edilen TEM görüntüleri, c. büyüklük dağılımları

69

Şekil 4.12.a.b. VS ile yüzeyi modifiye Fe3O4 nanotaneciklerinin farklı bölgelerden elde edilen TEM görüntüleri, c. büyüklük dağılımları

Silanlı bileşiklerle yüzeyi modifiye edilmiş Fe3O4 nanotaneciklerinin TEM görüntüleri incelendiğinde beklenildiği gibi taneciklerin aglomerasyonunun azaldığı ve daha düzenli bir hale geçtikleri belirlenmiştir. Fe3O4 ve MPTMS, MPTES ve VS ile yüzeyi modifiye edilmiş Fe3O4 nanotaneciklerinin ortalama büyüklük ve büyüklük dağılımları çizelge 4.2'de verilmiştir. VS ile yüzeyi modifiye nanotaneciklerin 7.8 ± 1.0 nm ile en küçük ortalama tanecik büyüklüğüne sahip olduğu belirlenmiştir.

70

Çizelge 4.2 Fe3O4 ve yüzeyi modifiye Fe3O4 nanotaneciklerinin ortalama tanecik büyüklüğü ve büyüklük dağılımları

Örnek Ortalama tanecik

büyüklüğü (nm)

Tanecik büyüklük dağılımı

Fe3O4 8.8 ± 1.8  10 nm (71.7 %)

Fe₃O₄-MPTMS 8.7 ± 1.8  10 nm (74.5 %)

Fe3O4-MPTES 8.1 ± 1.8  10 nm (78.7 %)

Fe3O4-VS 7.8 ± 1.0  10 nm (83.3 %)

Yüzeyi modifiye Fe₃O₄ nanotaneciklerinin SEM-EDS sonuçları şekil 4.13-4.15’te görülmektedir. Sonuçlar, analiz için taranan bölge ve grafiksel gösterim ve elementel %

Yüzeyi modifiye Fe₃O₄ nanotaneciklerinin SEM-EDS sonuçları şekil 4.13-4.15’te görülmektedir. Sonuçlar, analiz için taranan bölge ve grafiksel gösterim ve elementel %

Belgede ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ (sayfa 59-0)