Nâdiye

As matrizes de PHB-HV colonizadas por hASCs induzidas a diferenciação osteogênica em meio suplementado com SH, descrito no item 3.17, foram analisadas por imunofluorescência, para detectar a expressão de proteínas específicas, produzidas por osteoblastos e por PCR, para detectar a expressão gênica de marcadores associados a diferenciação de osteoblastos.

3.21.1. Imunofluorescência das secções

As amostras das matrizes de PHB-HV foram lavadas com PBS 0,15 M, pH 7,2 (2 vezes) para retirar o meio de cultura e fixadas em solução de p- formaldeído a 4% em tampão fosfato 0,2 M, pH 7,4, por 24 horas. Em seguida, foram lavadas com PBS 0,15 M, pH 7,2, por 5 minutos e colocadas em solução de sacarose a 10% em PBS 0,15 M, a 4°C, por 6 horas. Após esse período, as amostras foram transferidas para uma solução de sacarose a 20% em PBS 0,15 M, pH 7,2, a 4°C, por 24 horas. Posteriormente as amostras foram congeladas a - 30°C, em meio de inclusão para criostato, solúvel em água (Easy Path). Secções histológicas de 10 µm foram obtidas em criostato (Leica CM1510S-Leica Mycrosystems) e estas foram mantidas a -20°C até o momento de realizar a marcação para imunofluorescência.

Secções de todos os grupos e diferentes intervalos de indução foram descongeladas por 10 minutos e em seguida iniciadas a etapa de hidratação, através da imersão das mesmas em uma série decrescente de etanol: etanol 100% (3 vezes), 95% e 80%, por 5 minutos cada. Para finalizar, as secções foram imersas em 6 banhos de água destilada, por 5 minutos e 3 banhos de PBS 0,15 M, pH 7,2, por 5 minutos.

A etapa de permeabilização foi realizada incubando as secções com solução Triton X-100 a 0,25% e BSA a 2% em PBS (200 µL/secção) por 1 hora, em câmara úmida a temperatura ambiente. As secções foram lavadas através da imersão em PBS 0,15 M, pH 7,2 (3 vezes, por 5 minutos) e incubadas com solução de BSA a 2% e Tween 20 a 0,1% em PBS, por 1 hora em câmara úmida a temperatura ambiente.

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Após a permeabilização, as secções foram lavadas com PBS 0,15 M, pH 7,2 (3 vezes, por 5 minutos), e feito o bloqueio de reações inespecíficas, incubando as secções com solução de 5% de soro de cabra e BSA a 1% em PBS, por 1 hora em câmara úmida a temperatura ambiente. Em seguida, as secções foram lavadas novamente em solução de PBS 0,15 M, pH 7,2 (3 vezes, por 5 minutos).

Posteriormente, as secções foram incubadas com os anticorpos primários (Tabela 5) diluídos em solução de Triton X-100 a 0,025% e BSA a 0,2% em PBS 0,15 M, pH 7,2, por 2 horas, em câmara úmida, a temperatura ambiente.

Tabela 5. Anticorpos primários utilizados na marcação das secções para

imunofluorescência.

Antígeno Tipo Espécie Conjugado Fornecedor Diluição

OSTEOPONTINA Policlonal Coelho - Abcam 1:200 OSTEOCALCINA Monoclonal Camundongo - Abcam 10 µg/mL

COLÁGENO I Monoclonal Camundongo - Abcam 1:200

Após incubação com anticorpo primário, as secções foram novamente lavadas com PBS 0,15 M, pH 7,2 (3 vezes, por 5 minutos) e, em seguida, foram incubadas com os respectivos anticorpos secundários Alexa Fluor 488 goat anti-camundongo IgG 2 mg/mL (1:500; Invitrogen) ou Alexa Fluor 488 goat anti- coelho IgG 2 mg/mL (1:500; Invitrogen), diluídos em solução de Triton X-100 a 0,025% e BSA a 0,2% em PBS 0,15 M, pH 7,2, por 1 hora em câmara úmida, na ausência de luminosidade e a temperatura ambiente. Os controles negativos foram feitos utilizando-se apenas a marcação com os respectivos anticorpos secundários.

Posteriormente, as secções foram lavadas com PBS 0,15 M, pH 7,2 (3 vezes, por 5 minutos) e incubadas com a sonda Hoechst 33258 pentahydrate 1 μg/mL (Invitrogen), por 20 minutos, para marcação do núcleo. Em seguida, foram feitas novas lavagens com PBS 0,15 M, pH 7,2 (3 vezes, por 10 minutos). E as lâminas montadas com Hydromount Aqueous (National Diagnostics) e lamínulas.

As lâminas montadas foram visualizadas e analisadas através do Microscópio Confocal LSM 510 Meta (Zeiss), CEMEL do Departamento de

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Morfologia do ICB/UFMG, utilizando-se o programa Carl Zeiss Laser Scanning Microscope LSM 510©.

3.21.2. PCR - Análise da expressão gênica de COL1A1, RUNX2, ALPL e BGLAP

As amostras de PHB-HV colonizadas por hASCs e induzidas a diferenciação obtidas após cada intervalo de tempo, assim como a cultura de monocamada em meio de cultura basal suplementado com SH (controle) foram avaliadas por reações de PCR em relação a expressão dos seguintes transcritos gênicos: collagen, type I, alpha 1 (COL1A1), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), alkaline phosphatase, liver/bone/kidney (ALPL), e bone gamma-carboxyglutamate (gla) protein (BGLAP). GAPDH foi usado como gene de referência.

A extração do RNA dos constructos e das culturas em monocamada, após cada intervalo de tempo foi realizada utilizando TRIZOL (Invitrogen). O procedimento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante e previamente descrito no item 3.10.1.

As amostras de RNA total foram tratadas com DNAse (Promega) e, em seguida, sintetizado o cDNA, pelo tratamento com RevertAid™ H Minus M- MuLV RT (Fermentas) previamente descrito no item 3.10.2.

Os pares de primers específicos para cada gene de interesse (Tabela 6) foram desenhados através do programa Primer3 versão 0.4.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Os parâmetros selecionados no programa para a elaboração dos primers foram: amplificar fragmentos cujo peso molecular variasse entre 100 e 700 pb, apresentasse teor de GC entre 30 e 60% e não apresentasse complementariedade entre si ou mesmo estruturas secundárias estáveis.

Após a síntese do cDNA, foram realizadas as reações de PCR para cada par de primer, conforme descrito no item 3.10.4. Os resultados foram visualizados por expressão de bandas de tamanho esperado para cada par de primers.

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Tabela 6. Sequência dos primers utilizados nas reações de PCR.

Gene Nome Espécie Sinônimo Sequencia (5´ - 3´) Tamanho

fragmento Concentração primers Tm Sequência de referência NCBI GAPDH Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase Homo sapiens GAPDH F ACATCGCTCAGACACCATG 143 pb 0,5 µm 60°C NM_002046.5 R TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG

ALPL Alkaline phosphatase, liver/bone/kidney Homo sapiens Fosfatase alcalina F TGGTGGAAGGAGGCAGAATTGAC 581 pb 0,5 µm 62°C NM_000478.4 R CAGGACGCTCAGGGGGTAGA COL1A1

Collagen, type I, alpha 1 Homo sapiens Colágeno tipo I F TGACGAGACCAAGAACTG 600 pb 0,5 µm 62°C XM_011524341.1 R CCATCCAAACCACTGAAACC

BGLAP Bone gamma carboxyglutamate protein Homo sapiens Osteocalcina F ATGAGAGCCCTCACACTCCTC 297 pb 0,5 µm 59°C NM_199173.4 R CGGGCCGTAGAAGCGCCGATA

RUNX2 Runt related transcription factor 2 Homo sapiens RUNX2 F CCAGGCAGTTCCCAAGCATTT 377 pb 0,5 µm 53°C NM_001024630.3 R TCCATCAGCGTCAACACCATC

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3.22. Avaliação da biocompatibilidade in vivo da matriz tridimensional de