Câhiliye ġiiri

Os pares de primers específicos para cada gene de interesse (Tabela 4) foram desenhados através do programa Primer3 versão 0.4.0 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Os parâmetros selecionados no programa Primer3 para a elaboração dos oligonucleotídeos foram: amplificar fragmentos cujo peso molecular variasse entre 70 e 150 pares de base (pb), apresentasse teor de GC entre 30 e 60%, não apresentasse complementariedade entre si ou mesmo estruturas secundárias estáveis e apresentasse temperatura de anelamento de 60°C.

3.10.4. PCR

Reações de amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) foram feitas com o objetivo de confirmar a especificidade dos pares de primers. Cada reação de amplificação continha 10 ng de cDNA, 1,5 mM de MgCl2,

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Tabela 4. Sequência dos primers utilizados nas reações de qPCR.

Gene NOME Espécie Sinônimo Sequencia (5´ - 3´) Tamanho do _fragmento Concentração _{dos primers} Tm Sequência de referência NCBI/referência GAPDH Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase Homo sapiens GAPDH F GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC 105 pb 0,5 µm 60°C NM_002046.5 R AAGGGGTCATTGATGGCAAC CDKN2A Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Homo sapiens P16 F GCCGATCCAGGTCATGATGA 105 pb 0,2 µm 60°C NM_000077.4 R ACGGGTCGGGTGAGAGTG ERBB2 v-erb-b2 avian erythroblastic leucemia viral oncogene homolog 2 Homo sapiens HER2 F GAACTCACCTACCTGCCCAC 102 pb 0,2 µm 60°C NM_004448.3 R GACCTGCCTCACTTGGTTGT

MYC v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog Homo sapiens c-MYC F AGAGTTTCATCTGCGACCCG 76 pb 0,3 µm 60°C NM_002467.4 R AAGCCGCTCCACATACAGTC

TERT Telomerase reverse transcriptase Homo sapiens TERT F CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA 145 pb 0,5 µm 60°C NM_198253.2 R GGATGAAGCGGAGTCTGGA

ACTB Actin, beta Mus

musculus Beta-actina

F GGATGCAGAAGGAGATTACTACTG

90 pb 0,3 µm 60°C * R CGATCCAGAGAGAGAGTACTTG

COL1A1 Collagen, type I, alpha 1 Mus musculus Colágeno tipo 1 F CTTCACCTACAGCACCCTTGTG 65 pb 0,3 µm 60°C NM_007742.3 R TGACTGTCTTGCCCCAAGTTC

RUNX2 Runt related transcription factor 2 Mus musculus RUNX2 F AATGCCTCCGCTGTTATGAAAA 64 pb 0,5 µm 60°C NM_001146038.₂ R TCCGGCCCACAAATCTCA

ALPL Alkaline phosphatase, liver/bone/kidney Mus musculus Fosfatase alcalina F CAGTAACCGCTGCCCGAAT 55 pb 0.5 µm 60°C X13409.1 R TCCTCGCCCGTGTTGTG BGLAP Bone gamma carboxyglutamate protein Mus musculus Osteocalcina F TGACCTCACAGATGCCAAGC 92 pb 0,3 µm 60°C NM_007541.3 R GCCGGAGTCTGTTCACTACC

VEGFA Vascular endothelial growth factor A Mus musculus VEGF F GTACCTCCACCATGCCAAGTG 63 pb 0,5 µm 60°C NM_001287056.₁ R TGGGACTTCTGCTCTCCTTCTG *(Morais et al., 2013)

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dGTP, dTTP), 0,25 μM de cada primer e 1,25 unidades de GoTaq® DNA Polymerase (Promega), totalizando um volume final de 20 μL.

Os ciclos de amplificação foram: etapa inicial de desnaturação a 94°C por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de: 94°C por 30 segundos (desnaturação), temperatura específica para cada primer por 30 segundos (anelamento) e 72°C por 20 segundos (extensão) e uma última etapa de extensão foi realizada a 72°C por 5 minutos. Em todas as reações foi feito um controle branco de amplificação (NTC- no template control) para cada par de primers, onde água estéril foi acrescentada no lugar de cDNA.

Os produtos de PCR, em paralelo com marcador de peso molecular (1 kb Plus DNA Ladder; Invitrogen), foram aplicados em gel de agarose 1-2% em tampão Tris-acetato-EDTA (TAE) 1X (Tris 40 mM, pH 7,6; ácido acético 20 mM; EDTA 1 mM). A corrida eletroforética foi realizada a 100 volts por aproximadamente 60 minutos em TAE 1X. As bandas foram reveladas por brometo de etídeo a uma concentração final de 0,5 μg/mL em TAE 1x. Os tamanhos dos fragmentos foram visualizados sob luz ultravioleta.

3.10.5. qPCR

3.10.5.1. Teste de concentração ótima dos primers

A concentração ótima de cada par de primers foi determinada através de ensaios de qPCR. Considerando os genes avaliados as concentrações testadas foram 0,2; 0,4; 0,5 e 0,6 µM. As concentrações otimizadas de cada par de primers foram descritas na (Tabela 4).

3.10.5.2. Determinação da eficiência de amplificação dos primers

Curvas padrão para cada gene foram geradas através de ensaios de qPCR envolvendo diluições logarítmicas seriadas de um cDNA controle (teste de eficiência de amplificação da qPCR): 1, 1:10, 1:100 e 1:1000 (Figura 3 A). Cada diluição foi testada em triplicata.

A partir dos valores de Ct foi construída uma curva-padrão, onde a média dos Ct obtidos, em cada concentração, variava em função do logaritmo

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Figura 3. Exemplo da padronização das reações de qPCR. (A) Resultado das amplificações

com emprego dos primers para o gene MYC. É possível observar as curvas de amplificação referentes a cada diluição de cDNA testada. É notável a relação inversa existente entre a quantidade de cDNA empregada na reação e o valor alcançado de Ct. (B) Regressão linear baseada nas médias dos Cts para amplificações relativas ao gene MYC. No gráfico, as unidades do eixo x representam a quantidade de cDNA nas diluições seriadas de 4 vezes. (C) Curvas de dissociação contínua obtidas para os transcritos relativos ao gene MYC. É possível observar picos aproximados de fluorescência entre as reações, indicando a presença de um fragmento de DNA amplificado específico, cuja média da temperatura de dissociação está entre 75 e 80°C.

da concentração de cDNA. O coeficiente angular da reta (slope) obtido (a, em = + ) foi utilizado para cálculo da eficiência da amplificação dos primers,

através da seguinte fórmula: _{𝑖 𝑖ê 𝑖 =} − /𝑎_{− × sendo, a:}

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Foram aceitos valores de eficiência entre 1,80 e 2,10 (Figura 3 B). A partir desse teste padronizou-se a quantidade de cDNA a ser utilizada em todos os ensaios de qPCR (10 ng/amostra).

3.10.5.3. Especificidade da amplificação

A especificidade da amplificação pôde ser verificada pela temperatura de desnaturação do produto amplificado, que depende de seu tamanho e constituição de nucleotídeos. Assim, a especificidade da amplificação foi verificada a partir de uma única temperatura de dissociação para cada segmento gênico amplificado em todas as amostras testadas. Em todos os resultados obtidos foi observado somente um pico na curva de dissociação (melting curve), sugerindo a presença de somente um fragmento de DNA amplificado pelos primers (Figura 3 C).

3.10.5.4. Reações

Após todas as padronizações, cada reação de qPCR continha 10 μL de SYBR® Green PCR Master Mix 2X (Applied Biosystems), 10 ng de cDNA, cada par de primers em sua concentração ótima e água nuclease-free em quantidade suficiente para um volume final de 20 μL.

As condições de amplificação consistiram em uma etapa inicial a 50°C por 2 minutos, uma etapa de desnaturação a 95°C por 10 minutos, seguido de 45 ciclos de: 95°C por 15 segundos (desnaturação), 60°C por 1 minuto (anelamento) e 75°C por 1 minuto (extensão), seguido de mais um ciclo a 75°C por 10 minutos para o término da reação. Após os 45 ciclos de amplificação, todas as amostras foram submetidas à desnaturação gradual para determinação da curva de dissociação. Em todas as reações foi feito um NTC para cada par de primers.

Todo procedimento para a qPCR foi feito na plataforma de instrumentação Applied Biosystems 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems), e os dados foram processados pelo 7500 Software, versão 2.3 (Applied Biosystems).

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