I. BÖLÜM
2.1. Araplar
Após 4 e 12 semanas da cirurgia os animais foram eutanasiados em câmara de CO2 e os crânios, após a dissecção, foram fotografados para
análise macroscópica. Imediatamente os crânios foram fixados em solução de p-formaldeído 4% por 48 horas e, em seguida, dispostos em tubos de 30 mm em etanol 70% e as calvárias foram destinadas para as análises por µ-CT (2 amostras por grupo) e histologia (4 amostras por grupo). Para a avaliação da expressão gênica por qPCR, imediatamente após a dessecação dos crânios, a região do implante foi isolada e congelada a -80°C (2 amostras por grupo).
3.24.1. Microtomografia computadorizada
As calvárias coletadas, fixadas e dispostas em tubos de 30 mm em etanol 70% foram analisadas por µ-CT, utilizando o aparelho Skyscan 1172.
Os implantes foram analisados em modo de alta resolução de 8,9 µm e tempo de exposição de 590 ms. Os parâmetros de energia definidos no
53
scanner foram de 48 kV e 204 µA. Imagens seriadas obtidas foram reconstruídas tridimensionalmente, utilizando o programa NRecon.
A configuração do aparelho permitiu detectar a densidade óssea baseado no osso natural do crânio. Dessa forma, o osso maduro e a estrutura óssea nova formada de similar densidade foram observados em cor cinza, enquanto o tecido de baixa densidade óssea foi eliminado e observados em preto.
3.24.2. Análise histológica
As calvárias destinadas a avaliação histológica, já fixadas, foram descalcificadas em solução de EDTA 10%, pH 7,2 por 7 dias.
Após a descalcificação, os crânios foram lavados abundantemente em água corrente e o local do implante foi seccionado em 2 metades (parte anterior e posterior), por corte transversal do crânio com auxílio de lâmina Gillete. Ambas as partes foram processadas pela técnica de inclusão em Paraplast (Sigma) para análises histológicas, de acordo com os protocolos utilizados no Laboratório de Biologia do Desenvolvimento, do Departamento de Morfologia, ICB, UFMG e previamente descrito no item 3.14.
Foram obtidos cortes transversais de 5 μm de espessura por microtomia e corados por H&E. As lâminas de H&E foram analisadas por microscopia óptica, pela qual foi feita o screening das lâminas em campos sucessivos do menor para maior aumento.
Para avaliar a neovascularização, foram contados os vasos sanguíneos em imagens consecutivas (de uma extremidade a outra do corte) obtidas em aumento de 40x, de 3 cortes histológicos de cada grupo. Para contagem foi utilizada a ferramenta Cell counter do programa Image J (National Institutes of Health). Os resultados representam a média do número de vasos/mm2 para
cada grupo.
3.24.3. Análise da expressão gênica de RUNX2, COL1A1, ALPL,
BGLAP e VEGFA (qPCR)
As amostras de calvárias foram avaliadas por reações de qPCR em relação a expressão dos seguintes transcritos gênicos: RUNX2, COL1A1,
54
ALPL, BGLAP e vascular endothelial growth factor A (VEGFA). Actin, beta (ACTB) foi usado como gene de referência.
A extração de RNA total foi feita somente da região do implante, congelada imediatamente após a eutanásia dos animais. O implante foi mantido congelado com nitrogênio líquido e assim macerado vigorosamente, em gral com pistilo. Após completamente macerado foi adicionado 1 mL de Trizol (Invitrogen) e macerado, a temperatura ambiente, até formação de uma pasta que derreteu após descongelamento. O conteúdo macerado foi recolhido em tubos de 1,5 mL. Em seguida, a extração do RNA total foi realizada conforme procedimento descrito no item 3.10.1.
As amostras de RNA total foram tratadas com DNAse (Promega) e, em seguida, sintetizado o cDNA, pelo tratamento com RevertAid™ H Minus M- MuLV RT (Fermentas) previamente descrito no item 3.10.2.
Os pares de primers específicos para cada gene de interesse (Tabela 4) foram desenhados conforme descrito no item 3.10.3. Os pares de primers e reações de qPCR foram padronizadas e realizadas de acordo com os protocolos descritos anteriormente no item 3.10.4 e 3.10.5.
3.24.3.1. Análise dos dados
A expressão quantitativa dos genes de interesse foi determinada pelo método comparativo Ct, quantificação relativa (Schmittgen & Livak, 2008). A expressão relativa do gene apresenta os dados do gene de interesse relativo a algum gene de controle interno (gene de referência) e calibrador (osso maduro). Os níveis de mRNA alvo foram normalizados de acordo com o gene de referência ACTB e o calibrador para cada gene testado.
O cálculo da expressão gênica foi realizado utilizando-se o método:
−∆∆𝐶𝑡
Sendo,
∆∆ = [ 𝑙 − 𝑟 𝑟ê 𝑖 ] − [ 𝑙𝑖 𝑟 𝑟
− ]
Os resultados foram plotados na forma de gráfico utilizando o programa GraphPad Prism 5.0.
55
4. Resultados
4.1. Isolamento e cultivo das hASCs
O isolamento das hASCs usando ambos os meios de cultura basal, suplementado com SFB e SH foi satisfatória. As culturas primárias, obtidas após o processamento do lipoaspirado, eram compostas por uma população heterogênea de células, apresentando células aderentes à superfície plástica das garrafas de cultura, de formato fusiforme e células não aderentes, de formato arredondado.
Ao longo do cultivo, com a expansão celular e com a troca dos meios de cultura, o número de células não aderentes diminuiu em ambas as culturas, predominando a população de células aderentes de formato fusiforme, com potencial de auto-renovação e formação de colônias.
O diferencial entre os dois tipos de cultura, é que na presença de meio de cultura basal suplementado com SH, as células apresentaram um tamanho menor, menos grânulos citoplasmáticos, menor aderência à superfície plástica e maior tendência a se aglomerar ao alcançar confluência. Além disso, essas culturas apresentavam-se sempre mais densas quando comparadas as culturas cultivadas em meio de cultura basal suplementado com SFB (Figura
5).
Figura 5. Característica morfológica das hASCs na 4a passagem de um doador representativo. As células cultivadas em meio de cultura basal suplementado com (A) SH e (B) SFB apresentaram formato fusiforme.
56
4.2. Viabilidade e proliferação celular in vitro
As hASCs cultivadas em meio de cultura basal, suplementado com os dois tipos de soro, foram capazes de metabolizar o MTT e produzir cristais de formazan. O aumento da densidade óptica, observado ao longo dos tempos de cultivo avaliados, indicou que o tipo de suplemento utilizado não interferiu na viabilidade dessas células (Figura 6). As culturas de hASCs cultivadas em meio de cultura basal suplementado com SH apresentaram maiores valores de densidade óptica, que pode ser devido ao maior número de células em cultura, indicando uma proliferação aumentada na presença deste suplemento.
Figura 6. Viabilidade e proliferação das hASCs avaliadas pelo ensaio de MTT realizado após 7,
14, 21 e 28 dias de cultura em ambos os meios de cultura basal (SH e SFB). Os resultados foram baseados nos valores de densidade óptica mensurados a 595 nm e representam a viabilidade e proliferação das hASCs. Os resultados representam a média ± EMP (n=3). Análise estatística de variância e pós-teste de Bonferroni foi realizado. *p<0,05: SH vs SFB.
4.3. Caracterização do imunofenótipo das hASCs
A caracterização das populações de hASCs em relação ao imunofenótipo foi realizada na 4a e 10a passagens e a seguir estão representados os histogramas das populações de hASCs cultivadas em meio de cultura basal suplementado com SH e SFB (Figura 7).
Tamanho celular e granulosidade foram medidos durante a citometria de fluxo utilizando as configurações forward e side-scatter e os resultados mostraram que as hASCs cultivadas em meio de cultura basal suplementado
57
com SH (Figura 7 A) eram menores e apresentavam menos granulosidade comparado as hASCs cultivadas em meio de cultura basal suplementado com SFB (Figura 7 B).
Os níveis de expressão dos marcadores de superfície não mudaram significativamente entre as passagens e entre os diferentes suplementos empregados nos meios de cultura.
O perfil imunofenotípico das hASCs, em ambos os meios de cultura, na 4a e 10a passagem (Figura 7 C-D), indicou que mais de 90% das hASCs
expressaram marcadores de MSCs CD105, CD166, CD90, CD73 e moléculas de adesão CD44 e CD54, e menos de 2% da população de células foi positiva para marcadores de HSCs CD45, CD34, CD19 e HLA-DR. Além disso, aproximadamente 100% das hASCs, em ambos os meios de cultura, expressaram HLA-ABC.