Moleküler Yöntem

Moleküler çalışmalar için gerekli numuneler, arazi çalışmaları sırasında boncuk silika jel içerisine alınarak muhafaza edilmiştir. Bundan sonraki süreçte çalışmalar 4 aşamada gerçekleştirilmiştir.

1-) DNA ekstraksiyonu 2-) PCR amplifikasyonları 3-) Sekanslama

3.5.1. DNA ekstraksiyonu

Total genomik DNA’nın ekstraksiyonu, Türkiye’nin farklı lokalitelerinden toplanarak silika jel içerisine alınmış örneklerden ticari kit (QIAGEN-DNeasy Plant Mini Kit) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

DNA ekstraksiyon işlemi: Kullanılan ticari kitin DNA ekstraksiyonu için önermiş olduğu bir protokol mevcuttur. Ancak tez çalışmaları kapsamında DNA ekstraksiyonu yapılırken bu protokol üzerinde kısmi birkaç değişiklik yapılarak aşağıda verilen adımlar izlenmiştir.

— Silika jel içerisinde kurutulmuş her bir numuneden yaklaşık 30 mg tartılarak içi sıvı azot ile doldurulmuş bir havan içerisine konulur. Daha sonra örnekler ezilerek toz haline getirilir. Toz halindeki örnekler vakit kaybetmeden bir kaşık yardımıyla 2 ml’lik mikrosantrifüj tüplerine aktarılır.

— Tüplere 400 µl Buffer AP1 ve 4 µl RNase eklenir.

— Vortekslenen tüpler, 65 °C sıcaklıkta 10 dk. ısıtıcı blok üzerinde bekletilir. Bu sırada tüpler 2-3 kez hafifçe çalkalanarak materyal iyice karıştırılır.

— 130 µl Buffer P3 eklenir ve karıştırıldıktan sonra 5 dk. buzun üzerinde bekletilir. — Buz üzerindeki inkübasyondan sonra 5 dk 14000 rpm’de santrifüj işlemi yapılır. — Santrifüjden sonra tüpün üst tarafında biriken kısım pipetle alınarak 2 ml’lik

toplama tüpleri (QIAshredder spin column) içerisine aktarılarak 2 dk. 14000 rpm’de santrifüj işlemi yapılır.

— Oluşan sıvı kısım yeni tüplere alınır. Eğer dip kısımda pellet oluşumu mevcut ise bu kısmın aktarılan kısma karıştırılmamasına dikkat edilir.

— Aktarılan sıvı hacmin 1.5 katı kadar Buffer AW1 eklenir ve karıştırılır.

— Elde edilen karışımdan 650 µl alınarak 2 ml’lik toplama türleri (DNeasy mini spin column) içerisine aktarılarak 1 dk 8000 rpm’de santrifüj edilir. Elde edilen karışım 650 µl’den fazla ise, kolonun alt kısmına geçen sıvı kısım tüplerden uzaklaştırıldıktan sonra, geri kalan karışım için aynı işlem tekrarlanır.

— Kolonlar 2 ml’lik yeni toplama tüplerine yerleştirilerek üzerine 500 µl Buffer AW2 eklenir ve 1 dk. 8000 rpm’de santrifüj edilir. Sıvı kısım uzaklaştırılır. — Tekrar kolonlara 500 µl Buffer AW2 eklenir ve 2 dk. 14000 rpm’de santrifüj

edilir.

— Kolonlar dikkatlice 2 ml’lik yeni mikrosantrifüj tüplerine alınır ve kolon membranı üzerine 50 µl Buffer AE eklenir. Tüpler oda sıcaklığında 5 dk

bekletildikten sonra 1 dk 8000 rpm’de santrifüj edilir. Bu aşama tekrarlandıktan sonra tüpler içerisinde DNA çözeltisi elde edilmiş olur.

DNA saflık analizi: Elde edilen DNA örneklerinden 2 μl uygun bir tüpe aktarılır. Üzerlerine 8 μl ultra saf su ve 2 μl brom fenol mavisi ilave edilir. Elde edilen DNA, ultra saf su ve boya karışımı, daha önceden hazırlanmış ve 1X TBE (Tris-Borate-EDTA) içerisinde yaklaşık 15 dk bekletilen % 1.5’luk agaroz jel kuyucuklarına yüklenir. Daha sonra örnekler 70 voltta yaklaşık 60 dk boyunca yürütülür. Bu şekilde DNA örneklerinin agaroz jeldeki parlaklıkları ve durumuna göre kullanılabilirliği hakkında fikir edinilir. Ayrıca, DNA örneklerinin NanoDrop ile 260/280/230 nm dalga boylarında ölçümleri gerçekleştirilir. Sonuçta, ng/μl olarak miktarları ve nükleik asit/protein oranları veya nükleik asit harici komponentlerin oranı belirlenir. ng/μl olarak miktarları belirlenen DNA örnekleri reaksiyon için gerekli olan oranda seyreltilebilir.

Agaroz jel hazırlanma: Gerekli olan % 1.5’luk agaroz jel hazırlayacak kadar agaroz 1X TBE çözeltisi ile karıştırılarak mikrodalga fırında 300 Watt enerji ile kaynatılarak homojen hale getirilir. Yaklaşık 45 ºC ye kadar soğuması beklendikten sonra yeteri miktarda EtBr (Ethidium Bromide) eklenir. Daha sonra elektroforez kasalarına dökülerek örnek miktarına uygun taraklar takılır ve yükleme işleminin yapılacağı kuyucukların açılması sağlanır. Jel donduktan sonra kasa elektroforez tankının içine konulur. Tanklara jelin üzerini 2-3 cm geçecek kadar 1X TBE çözeltisi ilave edilir ve jel yaklaşık 15 dk 1X TBE içerisinde bekletilir. Yukarıdaki bölümde açıklandığı şekilde hazırlanan örnekler jelde açılan kuyucuklara mikro pipet yardımıyla yüklenir. Örneklerin yüklendiği kuyucuğun önündeki kuyucuğa 2 μl moleküler ağırlık markörü yüklenir. Yükleme işlemi tamamlandıktan sonra elektroforez kasaları güç kaynağına bağlanır ve 70 voltta yaklaşık 60 dk. boyunca yürütülür.

3.5.2. PCR amplifikasyonları

Tez kapsamında taksonların nrDNA-ITS (ITS1+5.8S rRNA+ITS2) ile cpDNA- trnL-F bölgelerinin sekans bilgileri elde edilmiştir. Amplifikasyonlar için kullanılan primerler ve PCR programları Çizelge 3.5’de verilmiştir.

Çizelge 3.5. PCR amplifikasyonlarında kullanılan primerler ve kullanılan PCR programları

ITS (ITS1-5.8s rRNA-ITS2) Primerleri trnL-F Primerleri

ITS4 5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3' trnLf 5'-ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG-3'

ITS-5P 5'-GGA AGG AGA AGT CGT AAC AAG G-3' trnLe 5'-CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG-3'

ITS bölgesi için kullanılan PCR programı trnL-F bölgesi için kullanılan PCR programı

Basamak Sıcaklık Zaman Döngü sayısı Basamak Sıcaklık Zaman Döngü sayısı

Ön denatürasyon 94 ˚C 2 dk 1 döngü Ön denatürasyon 94 ˚C 5 dk 1 döngü Denatürasyon 94 ˚C 50 sn 33 döngü Denatürasyon 94 ˚C 30 sn 35 döngü Annealing 51 ˚C 30 sn Annealing 52 ˚C 45 sn Extension 72 ˚C 1 dk Extension 72 ˚C 1 dk

Final extension 72 ˚C 10 dk 1 döngü Final extension 72 ˚C 10 dk 1 döngü

Final hold 4 ˚C 25 sa Final hold 4 ˚C 25 sa

Polimeraz zincir reaksiyonu için izole edilen total DNA’nın gerekli oranda sulandırılması ile elde edilen dilüsyondan 10 μl alınarak PCR tüpüne aktarılır. 40 μl’lik PCR karışımı (reaction mix) hazırlanarak tüpe eklenir ve DNA ile karışması sağlanır. Tüpler PCR kuyucuklarına ağızları sıkıca kapatılarak yerleştirilir ve Çizelge 3.5’de verilen prosedüre göre amplifikasyon işlemi gerçekleştirilir. İşlem sonunda toplam 50 µl PCR ürünü elde edilmiş olur.

PCR karışımı (reaction mix) su, OneTaq® 2X Master Mix, hedeflenen bölgenin pirimerlerini ihtiva eder. PCR karışımının içeriği ve 50 µl PCR ürünü için kullanılan miktarlar Çizelge 3.6’da yer almaktadır.

Çizelge 3.6. PCR karışımı içeriği ve miktarları

Kullanılan Malzeme İçerik Miktar

OneTaq® 2X Master Mix

20 mM Tris-HCI (pH 8.9 @ 25°C) 25 µl 1.8 mM MgCl2 22 mM NH4 Cl 22 mM KCl 0.2 mM dNTPs 5 % glycerol 0.06 % IGEPAL® CA-630 0.05 % Tween® 20 25 units/ml OneTaq DNA Polymerase

Primer 10 µM Forward Primer 1 µl

10 µM Reverse Primer 1 µl

Su PCR suyu 50 µl tamamlayacak kadar

DNA < 1,000 ng Değişken

50 ul reaksiyon hacminde gerçekleştirilen PCR uygulamasını takiben elde edilen PCR ürünlerinden 5 µl alınarak % 2’lik agaroz jelde 80 V’da 40-60 dk elektroforez işlemine tabii tutulur. Oluşan bantların uygunluğu kontrol edildikten sonra sekanslama işlemine geçilir.

3.5.3. Sekanslama

Sekanslama işlemleri hizmet alımı yoluyla gerçekleştirilmiştir. PCR ürünlerinden jel elektroforezi için kullanılan 5 µl’den sonra kalan 45 µl’lik kısmı etiketlenerek sekanslama işlemi için özel bir firmaya gönderilmiştir. Ayrıca PCR ürünleri ile birlikte PCR amplifikasyonu esnasında kullanılan pirimerlerden de gönderilmiştir. Hizmet alımı çift yönlü Otomatik DNA Dizileme + Pürifikasyon şeklinde yapılmıştır.

3.5.4. Sekans sonuçlarının işlenmesi ve analizi

Sekans sonuçları “.ab1” formatında elektronik ortamda teslim alınmıştır ve DNA

Baser Assembler programı kullanılarak işlenmiştir. Burada sekans sonuçlarının

işlenmesinden kasıt, her iki yönden okunan gen bölgesinin üst üste çakıştırılarak baz dizilerinin kontrol edilmesi ve tek bir sekans verisinin (contig verisi) elde edilmesidir. Şekil 3.4’de yapılan bu işlemden bir kısım gösterilmiştir.

Şekil 3.4. Sekans verilerinin işlenmesi.

Contig verileri her bir örnek için hazırlandıktan sonra çoklu dizi hizalama işlemi

yapılmıştır. Bu çalışmada çevrimiçi hizmet veren Clustel Omega kullanılmıştır. Elde edilen çoklu hizlama verisi ile taksonlar arasındaki filogenetik ilişkiler test edilmiştir. Taksonlar arasındaki filogentik ilişkiyi belirlemede Maksimum Parsimoni (MP) ve Neighbor Joining (NJ) metotları kullanılmıştır. Analizler PAUP* 4.0a-165 sürümü ve

SeaView-versiyon 4.7 programları ile gerçekleştirilmiştir (Gouy ve ark., 2010; Swofford ve Bell, 2017).