Moleküler markörler

Morfolojik Markörler

Çok uzun zamandır bilinmelerine rağmen sayılarının az oluşu yanında çevreden ve diğer lokuslardan etkilenmeleri nedeniyle fazlaca kullanılmamaktadırlar. Ayrıca çoğunlukla dominant özelliktedirler. Asıl avantajları analizlerinin kolay olmasıdır (Yıldırım ve Kandemir, 2001).

Protein Markörler

Protein markörleri, depo proteinleri ve enzim proteinleri olarak iki ana gruba ayrılırlar. Depo proteinleri bir jel üzerinde hareket ettirilip boyandıklarında farklı genotiplerde ortaya çıkan yapı farklılıkları genetik markör olarak kullanılabilir. En önemli avantajları analizlerinin çabuk, güvenilir ve tekrarlanabilir olmasıdır. En büyük dezavantajları ise sayıca çok az olmalarıdır. Enzim markörleri kendi içinde iki ana grup altında incelenebilir. Alloenzim birbirinden ayırt edilebilen allelleri bulunan enzimleri ifade etmektedir. İzoenzim, farklı genler tarafından üretilen, ancak birbirine çok benzeyen enzimleri ifade etmektedir (Yıldırım ve Kandemir, 2001).

DNA Temelli Markörler

DNA markörleri, bir tür içerisindeki farklı bireylerde dizi polimorfizmi gösteren DNA bölgeleridir ve varyasyonun belirlenmesinde günümüzde en sık kullanılan

yöntemdir (Liu, 1998; Özşensoy ve Kurar, 2012). Polimeraz Zincir Reaksiyonunun keşfinden sonra genetik çalışmalarda PCR temelli markörler daha çok tercih edilmeye başlanmıştır. Kary Mullis tarafından 1985 yılında ilk kez ortaya konulan bu teknoloji sayesinde genomun özgün bölgelerinin in vitro şartlarda çoğaltılabilmesi ve elektroforez teknikleri ile görüntülenmesi mümkün hale gelmiştir. DNA teknolojisi ve moleküler biyolojideki hızlı gelişmeye paralel olarak daha ekonomik, kolay ve polimorfik olmalarından dolayı özellikle PCR temelli DNA markör sistemleri genetik çalışmalarda daha yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Weber ve May, 1989; Liu, 1998; Özşensoy ve Kurar, 2012).

Kumar ve ark., (2009) tarafından moleküler markörler PCR tabanlı olmayan teknikler ve PCR tabanlı teknikler olarak iki grup altında incelenmiştir. Bunlar:

PCR tabanlı olmayan teknikler: RFLP, VNTR

PCR tabanlı teknikler: Sequence Tagged Sites (STS)

Mikrosatellit, Basit tekrar dizileri (SSR), Short Tandem Repeat (STR), Sequence Tagged Microsatellite (STMS) yada Simple Sequence Lenght Polimorfizmi (SSLP)

Amplified Sequence Lenght Polimorfizmi (ASLP) Sequence Characterized Amplified Region (SCAR) Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) Single–Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Denaturating Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Thermal Gradient Gel Electrophoresis (TGGE) Heteroduplex Analysis (HDA)

Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) Multiple Arbitrary Amplicon Profiling

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) DNA Amplification Fingerprinting (DAF)

Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction (AP-PCR) Inter Simple Sequence Repeat (ISSR)

Single Primer Amplification Reaction (SPAR)

Directed Amplification of Microsatellites DNA (DAMD) Amplified Fragment Lenght Polymorphism (AFLP)

Selectively Amplified Microsatellite Polymorphic Loci (SAMPL) DNA sekanslama

Multi-copy DNA, ITS (Internal Transcribed Spacer Regions of Nuclear Ribosomal Genes)

Single-copy DNA, intron ve ekzonları içerir

Inter Simple Sequence Repeat (ISSR)

1980’den bu yana PCR teknolojisinin de yardımıyla genom analizlerinde önemli ilerlemeler oldu. Bu ilerlemeler hızlı ve az miktarda DNA gerektiren markör protokollerinin gelişmesini sağladı. RAPD’ler, SSR’lar (microsatellit) ve AFLP’ler yaygın kullanılan PCR tabanlı markörlerdir (Williams ve ark., 1990, Tautz, 1989, Vos ve ark., 1995). 1994 yılından bu yana genetik çeşitliliği belirlemede ISSR markörleride kullanılmaktadır. ISSR markörleri genetik çeşitliliği belirlemede hızlı, basit ve pahalı olmayan bir yol sağlar (Gonzales ve ark., 2005).

Nüklear Ribozomal Genlerin İç Transkribe Boşlukları (Internal Transcribed Spacer Regions of Nuclear Ribosomal Genes- ITS)

Ökaryotik ribozomal RNA genleri, nükleolar organizer bölge (NORs) olarak bilinen kromozal bölgede yer alan sıralı diziler olarak düzenlenmiş tekrar ünitelerinin bir parçasıdır. Her tekrar ünitesi trankribe olan (18S, 5.8S ve 26S rRNA genleri ve ETS1 ve ETS2 gibi transkribe boşluklar) ve transkribe olmayan (NTS) bölgeleri içerir. Transkribe bölgede 5.8S rRNA genlerinin her iki tarafında iç transkribe boşluklar bulunur ve ITS1 ve ITS 2 olarak adlandırılır. rRNA tekrarlarının ITS bölgelerinin uzunluğu ve sekansının hızlı evrimleştiğine inanılır ve dolayısıyla değişebilir. ITS bölgesinin yanlarındaki iyi derecede korunmuş bölgelerden üniversal primerler dizayn edilebilir ve rRNA tekrarlarının yüksek kopya sayısında olması nedeniyle nispeten küçük bölgelerin amplifikasyonunu sağlar. Bu özellik ITS bölgelerini biyoğrafik araştırmaların yanında filogenetik ve evrimsel araştırmalarda da ilgi çekici yapar (Sharma ve ark., 2002). Bütün çiçekli bitkilerde ITS1 ve ITS2 300 bp’dan daha azdır (ITS1: 187-298 bp ve ITS2: 187-252 bp). 5.8S alt ünitesi ise angiospermlerde neredeyse

hiç değişmez ve 163-164 bp uzunluğundadır ve toplam ITS bölgesi çiçekli bitkilerde 700 baz çiftinin altındadır (Baldwin ve ark., 1995).

Organel Genomu

Organel genomları veya sitoplazmik genomlar, son yıllarda genetik çeşitlilik, filogenetik ve filocoğrafik ilişkilerin ortaya çıkarılmasında yaygın olarak kullanılmaktadırlar (Soltis ve ark., 1992; Filiz 2012). Kloroplast DNA’sının (cpDNA) yapısal kararlılığı, haploid (n kromozom) olması, genelde uniparental (tek ebeveyn) aktarılması, rekombinant olmaması gibi özellikler nedeniyle sistematik ve filogenetik çalışmalarda kullanılmaktadır (Small ve ark., 2004; Filiz 2012). Kloroplast genomu, gen yapısının korunması ve protein kodlayan bölgelerdeki nükleotit değişim hızının düşük olmasından dolayı bitki evrimsel analizlerinde ve filogenetik çalışmalarında ideal bir moleküler araçtır (Clegg, 1994; Filiz 2012). rbcL, matK, ndhF, atpB, ve rps2 gibi kloroplat genleri yüksek taksonomik seviyelerde filogenetik akrabalığın değerlendirilmesinde kullanılır. Örneğin rbcL familya ya da daha üst taksonomik seviyelerdeki ayırımlar için kullanılır. Ancak birçok çalışma bazı gruplarda cins ve cinsler arasındaki seviyelerde de kullanıldığını göstermiştir (Seung-Chul ve ark., 1999). Ayrıca rpl16, trnL-F, trnT-L, psbA-trnH ve atpB-rbcL, trnK 5ˈ ve trnK 3ˈ intron, rpl32- trnL, trnS-trnG sekansları da filogenetik çalışmalarda kullanılır.

Şekil 2.11. Glycine max türünün kloroplast genomu (Saski ve ark., 2005).

Mitokondriyel DNA küçük halkasal yapıdaki ikili bir sarmaldan oluşur. Bitki mitokondriyel genomları 200 kb’den 2600 kb’ye kadar değişebilmektedir. Mitokondriyel DNA’da en fazla solunumla ilgili genler bulunmaktadır. Bitkilerde hastalıklara dayanıklılık genleri ile kısırlık genlerinin de mtDNA’da bulunduğu bildirilmektedir (Backert ve ark., 1997; Martin ve Hermann, 1998; Konuk ve Babaoğlu, 2001).