Metodlar

3.2.1. Boyarmadde Konsantrasyonunun Belirlenmesi 3.2.1.1. Spektrum ölçümü

Besiyerindeki boyarmadde konsantrasyonunun doğrudan tespiti mümkün olmadığı için boyarmadde konsantrasyonundaki değişim besiyerinin absorbansındaki değişime bağlı olarak izlenmiştir. Boyarmadde içeren besiyerinin absorbansı her bir boyarmadde için, o boyarmaddenin maksimum absorbans verdiği dalga boyunda ölçülmüştür. Bunun için her bir boyarmadde solüsyonunun UV visible spektrofotometrede (JascoV-530 UV/VIS Spektrofotometre) spektrum ölçümü yapılmıştır. Spektrum ölçümü için 300 - 700 nm arası seçilmiş ve bu değerler arasında boyarmadde solüsyonunun verdiği tüm absorbans değerleri taranarak maksimum absorbans belirlenmiştir. Bu değer her bir boyarmadde için tespit edilmiş ve daha sonraki absorbans ölçümlerinin tümü her bir boyarmadde için o dalga boyunda yapılmıştır.

3.2.1.2. Dekolorizasyon Ortamlarındaki Boyarmadde Konsantrasyonunun Belirlenmesinde Kullanılan Kalibrasyon Eğrilerinin Oluşturulması

İnkübasyon süresi boyunca her gün ekstraselüler kültür sıvısından örnek alınmış ve gerekli olduğu durumlarda örnekler belli bir oranda distile su ile seyreltilmiştir. Daha sonra UV visible spektrofotometrede absorbansı ölçülerek boya konsantrasyonu belirlenmiştir. Ancak bunun için öncelikle kalibrasyon eğrileri oluşturulmuştur. Her bir boyarmadde ait kalibrasyon eğrisini oluşturabilmek amacıyla o boyarmaddeyi 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 mg/l konsantrasyonlarında içeren besiyerleri hazırlanmıştır. Daha sonra bu besiyerlerinin spektrfotometrede absorbansı okunmuş ve böylece her bir konsantrasyona karşılık gelen absorbans değeri belirlenmiştir. Daha sonra bu değerler kullanılarak, her bir boyarmadde için kalibrasyon eğrisi oluşturulmuştur. Bu kalibrasyon eğrileri daha sonra, absorbansı ölçülen örneklerin konsantrasyonunu belirlemek için kullanılmıştır.

3.2.2. Beyaz Çürükçül Mantarların Dekolorizasyon Çalışmaları İçin Hazırlanması Phanerochaete chrysosporium ME 446, Trametes versicolor (M96), Pleurotus sajor-caju Malt Extract Agar’da, Ganoderma carnosum (M88), Lenzites betulina (S2) ve Polyporus arcularius (438) Potato Dextrose Agar plaklarına ekilmiş ve 30 °C sıcaklıkta bir hafta inkübe edilmiştir. Daha sonra bu kültürler yatık Malt Extract Agar ve Potato Dextrose Agar tüplerine çekilerek 4 °C sıcaklıkta muhafaza edilmiştir.

Kültürler ayda bir yenilenmiştir.

3.2.3. Dekolorizasyon Çalışmalarında Kullanılan Biyomasın Üretimi

Dekolorizasyon çalışmalarında kullanılan biyomasın üretimi için öncelikle beyaz çürükçül mantarlar Malt Extract Agar ve Potato Dexrose Agar plaklarına ekilmiş ve 30

°C sıcaklıkta bir hafta inkübe edilmiştir. İnkübasyon süresi sonunda bu plaklardan misel ve spor içeren 1cm çapında diskler çıkarılmış ve içinde Kirk Medium bulunan erlenlere transfer edilmiştir. İçinde 50 ml. Kirk Medium bulunan 250 ml’ lik erlenlerin inokulasyonu için 10 adet disk kullanılmıştır. Bu şekilde Kirk Mediuma ekilen mantarlar 30 °C sıcaklıkta ve 150 rpm’de 4 gün inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon süresi sonunda oluşan pelletler steril koşullarda süzüldükten sonra homojenize edilmiş ve dekolorizasyon çalışmalarında inokulum olarak kullanılmıştır.

3.2.4. Dekolorizasyon Çalışmaları

Dekolorizasyon çalışmaları çalkalamalı olarak yapılmıştır. Çalkalamalı inkübasyon için 250 ml’ lik erlenlere 45 ml. Kirk medium, 5 ml. inokulum ve daha önce steril edilmiş olan boyarmadde solüsyonlarından steril şartlarda, son konsantrasyon 50 mg/l olacak oranda ilave edilmiştir. Çalkalamalı etüvde 30 °C sıcaklıkta ve 150 rpm’ de pH 4.5’ta bir hafta inkübasyona bırakılmıştır. Çalkalamalı inkübasyon boyarmaddelerin ışığın etkisiyle parçalanabileceği düşünülerek karanlık ortamda yapılmıştır. İnkübasyon süresi boyunca hergün ekstraselüler ortamından örnek alınmıştır. Alınan örnekler filtre edildikten sonra spektrofotometrede absorbansları okunarak boya konsantrasyonları belirlenmiştir. Boya dekolorizasyonu için optimum koşulların belirlenmesinde her çalışma iki paralelli olarak yürütülmüştür.

3.2.5. Kuru Ağırlık Tayini

Tüm dekolorizasyon deneylerinde kültür ortamı belli yaş ağırlıktaki pelletler ile inokule edilmiştir. Bu yaş ağırlık miktarına karşılık gelen kuru ağırlık miktarını belirlemek amacıyla öncellikle, belli büyüklükte kesilmiş kurutma kağıtları sterilizatörde 100 °C’de bir saat kurutulmuştur. Böylelikle kurutma kağıdındaki olası bir nem uzaklaştırılmıştır. Ardından kurutma kağıdının darası alınmış ve pelletler kurutma kağıdının üzerine konarak sterilizatöre yerleştirilmiştir. Pelletler 80 °C’de 12 saat kurutulduktan sonra kurutma kağıdı ile birlikte tartılmıştır. Tartım sonucunda elde edilen değerden kurutma kağıdının darası çıkarılmış ve böylece başlangıçta ilave edilen yaş pellet miktarına karşılık gelen kuru ağırlık miktarı tespit edilmiştir. Bu yöntem kullanılarak, başlangıçta kullanılan yaş inokulum miktarına karşılık gelen kuru ağırlık miktarına ilaveten, inkübasyon süresi sonunda boyalı ve boyasız besiyerlerindeki biyomas miktarları da tespit edilmiştir.

3.2.6 İstatistik Analizleri

Beyaz çürükçül fungusların dekolorizasyon yüzdeleri SPSS programı kullanılarak pH, inokulum konsantrasyonu, çalkalama hızı, boya konsantrasyonu ve sıcaklık gibi parametrelerin testleri yapılarak sonuçlar istatiksel olarak analiz edilmiştir.

3.2.7. “ Brine-Shrrimp Toxicity ” Tekniğiyle Bileşiklerin Toksisitelerinin Belirlenmesi

3.2.7.1. Bileşiklerin Hazırlanması

Kaya tuzu su içinde çözdürülmüştür. Kaya tuzu Artemia salina larvalarının gelişebildiği ortamdır. Her bir boyanın 25 ppm - 1000 ppm arasında değişen farklı konsantrasyonları hazırlanmış ve bunlar içinde 5 ml. çözücü bulunan tüplere aktarılmıştır.

3.2.7.2. Artemia salina Larvalarının Hazırlanması

Artemia salina yumurtaları akvaryumculardan hazır olarak temin edilmiştir. 5 lt.’lik bir kavanoz içine kaya tuzu ile hazırlanmış su ile doldurulmasından sonra yumurtalar kavanoz içine bırakılmıştır. Akvaryum motoru ile kavanozun içi havalandırılmış ve kavanozun üstüne bir ışık kaynağı koyulmuştur. Kavonoz bu şekilde 48 saat oda sıcaklığında (22-29 °C) bekletilmiş, kavanozun üstüne koyulan ışık kaynağı ile yumurtadan ayrılan larvaların bu bölmeye göçü sağlanmıştır.

Artemia salina larvası (Online: www.sinor.ru/~gammarus) 3.2.7.3. Testin Yapılışı

Işığa göçü sağlanan larvaların yoğun olarak bulunduğu bölgelerden, 10 mikrolitre’ye ayarlanmış mikropipetör yardımıyla suyla birlikte alınan larvalar, steromikroskop altında boş bir petri kabına damlatılmış ve 10 adet Artemia salina sayılmıştır. Daha sonra içinde 5ml tuzlu su ile birlikte farklı konsantrasyonlarda boya bulunan tüplere ve içinde sadece 5 ml. tuzlu su bulunan kontrol tüpüne 10 adet larva aktarılmıştır.

24 saat sonunda, yine steromikroskop yardımıyla, ölmüş olan larvalar hareketsiz olmalarına göre ayırt edilerek sayılmış ve kaydedilmiştir. Daha sonra veriler Probit

Analiz bilgisayar programıyla değerlendirilmiş ve LD50 değerleri ile % 95 güvenilirlik sınırları hesaplanmıştır. Çalışmalar çift paralel olarak yapılmıştır.