MBNK YPR Spektrometresi ile Biyotarayıcı Uygulamaları

Çapraz bağlayıcı ve çözücü sistemine karar verildikten sonra uygun bulunan kaplama yöntemi ile baskılama işlemi uygulanmamış polimer kaplı nanoküreler (No-MBNK) kullanılarak kontol örneği hazırlandı. Sistemin kalınlık ve dielektrik sabiti değerleri

127

hesaplandı. Altın yüzeyi 263,74 nm kalınlığında nanoparçacık tabakası ile kaplanmış ve hava ortamında sistemin dielektrik sabitin gerçek kısmı 1,114 olarak elde edildi. Kritik açısı 12,5˚ ve rezonans açısı 21˚ olarak görülen sistemin deneysel ve hesaplanan YRP eğrileri Şekil 5.16’da gösterilmektedir.

Şekil 5.16: Baskılanmamış polimer kaplı silika nanoparçacık (No-MBNK) içeren sensörün hava ortamında deneysel (siyah çizgi) ve hesaplanmış (kırmızı çizgi)YPR eğrileri

Çizelge 9: No-MBNK içeren sensör sisteminin içerdiği her bir tabakanın hesaplanmış kalınlık ve dielektrik sabiti değerleri

Tabaka Kalınlık (nm) ε’ (gerçek) ε’’ (sanal) LaSFN9 0 4,1001 0 Krom 1,32 -7,9077 23,4504 Altın 50,96 -10,0398 1,002 Kaplama 263,74 1,1138 0,0564 Ortam 0 1 0

Baskılanmamış polimer (No-MBNK) yüzeyinden 2 mM derişiminde molekül içeren çözelti geçirildiğinde seçici olmayan bağlanmanın reflektiviteyi yaklaşık % 1,5 arasında arttırdığı görüldü. Aynı derişimde MBNK kaplı sensör yüzeyinde bu miktarda kırılma indisi değişimi daha önce saptanamadığından polimerizasyon sonrasında nanoparçacıkları metanol ile yıkama sayısının etkisi olduğu öngörüldü. UV Spektroskopisi ile şablon molekülünün uzaklaştırılma miktarı takip edilerek 3 kere yıkama uygulamanın yeterli olduğuna kanaat getirildi ve bu basamaktaki yıkama sayısı 5’ten 3’e düşürüldü.

128

Gerçekleştirilen kinetik ölçümde No-MBNK yüzeyinden 2 mM derişiminde analit ve analog moleküller geçirilerek seçici olmayan bağlanma olup olmadığı tespit edilmek istendi. İlk 10 dakika boyunca çözücü varlığında stabil hale gelen yüzeye molekül gönderilmesinin ardından 3 dakika içerisinde yüzeyde tutunma gözlenerek yaklaşık 10 dakika içerisinde yüzeyin doyuma ulaştığı elde edildi. Tutunan molekülleri uzaklaştırmak amacıyla yıkama çözücüsü kullanıldı ve yüzeyin başlangıç noktasına geri döndüğü tespit edildi. Bu veriler ışığında moleküllerin yüzeye adsorbe olduğu (fizisorpsiyon) ve yıkama sonrasında 2 dakikalık bir zaman dilimi içerisinde tekrar yüzeyden uzaklaştırılabildiği görüldü (Şekil 5.17).

Her bir molekülün izlendiği kinetik ölçüm öncesi ve sonrasında YPR eğrileri kaydedildi ve inceleme sonrasında rezonans açısında herhangi bir değişim görülmedi. Sistemden geçirilen moleküllerin baskılanmamış polimer yüzeyinde meydana getirdikleri değişimin, kinetik ölçüm ile tutarlı bir şekilde seçici olmayan bağlanmadan kaynaklandığı sonucuna varıldı. (Şekil 5.18).

Şekil 5.17: 2 mM derişimde L-BFA ve benzer moleküllerin No-MBNK tutunma kinetiği

129

Şekil 5.18: No-MBNK’in çözelti ortamında her bir molekülün ve bütün kinetik ölçümün öncesi ve sonrasında elde edilen YPR eğrileri

MBNK ile hazırlanmış sensör sisteminin kaplama öncesi ve sonrasındaki kalınlık ve dielektrik sabiti değerleri hesaplandı. Altın metali 48,73 nm kalınlığında kaplanmış ve rezonans açısı 14,02˚ olarak elde edildi (Şekil 5.19.a). Altın yüzeyi 286,01 nm kalınlığında nanoparçacık tabakası ile kaplanmış ve hava ortamında sistemin dielektrik sabitin gerçek kısmı 1,2996 olarak elde edildi. Kritik açısı 12,33˚ ve rezonans açısı 28,36˚ olarak görülen sistemin deneysel ve hesaplanan YRP eğrileri Şekil 5.19.b’de gösterilmektedir. Altın metalinin MNBK ile kaplanmasının ardından rezonans açısında artma görüldü. Bu değişimin sebebi, yüzeye sabitlenen nanoparçacıkların sistemin kırılma indisini arttırmasıdır.

Gerçekleştirilen kinetik ölçümde MBNK yüzeyinden 2 mM derişiminde analit ve analog moleküller geçirilerek yalnızca baskılanmış LBFA molekülü için seçici bağlanma gözlendi. Yüzeye analit molekülün gönderilmesinden yaklaşık 90 dakika sonra yüzeyin doygunluğa ulaştığı görüldü. Doyum noktasının ardından yıkama işlemi gerçekleştirildi ve yüzeye tutunan LBFA moleküllerinin yalnızca bir kısmının uzaklaştırılabildiği gözlendi. Kinetik ölçüm tamamlandığında L-BFA için R

(a)

(c)

(b)

130

Şekil 5.19: Baskılanmış polimer kaplı silika nanoparçacıkların (MBNK) sensör yüzeyine sabitlenmeden önce (a) ve sonraki (b) hava ortamında deneysel ve hesaplanmış YPR eğrileri

Çizelge 10: Saf altın yüzeyi içeren sistemde bulunan her bir tabakanın hesaplanmış kalınlık ve dielektrik sabiti değerleri Tabaka Kalınlık (nm) ε’ (gerçek) ε’’ (sanal) LaSFN9 0 4,238 0 Krom 0,71 22,4939 12,468 Altın 48,73 -12,5657 1,6822 Ortam 0 1 0

Çizelge 11: MBNK içeren sensör sisteminin içerdiği her bir tabakanın hesaplanmış kalınlık ve dielektrik sabiti değerleri Tabaka Kalınlık (nm) ε’ (gerçek) ε’’ (sanal) LaSFN9 0 4,120 0 Krom 2,14 -14,170 49,85 Altın 50,51 -10,414 1,069 Kaplama 286,01 1,2996 0,069 Ortam 0 1 0

değişiminin 9,3 olduğu ölçüldü. Bu veri tutunmanın seçici olarak gerçekleştiğini vurgular niteliktedir (Şekil 5.20.a)

Analog moleküllerin tutunmasını izlemek amacıyla gerçekleştirilen kinetik ölçüm sonuçları Şekil 5.20.b’de gösterilmektedir. İlk 10 dakika boyunca çözücü varlığında stabil hale gelen yüzeye analog moleküllerinin gönderilmesinin ardından doygunluğa 10 dakika içerisinde ulaşıldığı gözlendi. Yıkama işleminin ardından yüzeyin kırılma indisinin başlangıç noktasına geri döndüğü tespit edildi. Bu veriler ışığında yüzeyi L- BFA baskılanmış nanoparçacıkların analog moleküllere karşı bir miktar bağlanma gösterdiği belirlendi; R değişimi B-TRP için 0,39, B-TRY için 0,07 ve B-Phe için 0,05 kadardır.

Analit ve analog moleküllerinin tutunmasının takip edildiği kinetik ölçüm öncesi ve sonrasında YPR eğrileri incelendi (Şekil 5.21). Analit molekülün (LBFA) kavitelerei bağlanması sonucu rezonans açı değişiminin () 0,45° olduğu hesaplandı. Analog moleküllerinin test edildiği ölçümlerde rezonans açısında herhangi bir değişim

görülmedi. Sistemden geçirilen moleküllerin baskılanmış polimer yüzeyinde meydana getirdikleri değişimin, kinetik ölçüm ile tutarlı bir şekildedir. Yüksek rezonans açısında oluşan omuz, altın metalinin kaplama kalitesi ile yüzeyine sabitlenmiş nanoparçacıkların heterojenliği ile ilgilidir.

Şekil 5.20: 2 mM derişimde analit (a) ve analog (b) moleküllerinin MBNK sistemine tutunma kinetiği ile (c) seçicilik grafiği. (Sablon ve analog moleküllerin nanokürelerle etkileşimi sonucu oluşan kırılma indisi değişimi farkının açık olarak gözlenebilmesi için a ve b grafiklerinin y-eksenleri eşit tutulmuştur.)

Gerçekleştirilen bu testler 2 mM dahil olmak üzere 5 farklı derişim için uygulandı ve benzer şekilde yalnızca analit molekülü için seçici tutunma gözlendi. Diğer derişimlerin meydana getirdiği rezonans açısındaki kayma miktarı aşağıdaki çizelgede belirtilmiştir. Literatür incelendiğinde YPR sensörlerin yalnızca kinetik eğrileri paylaşılmış olup, tutunmanın YPR eğrisinde bir değişime neden olup olmadığı paylaşılmamıştır. Bu çalışmada YPR eğrileri ile kinetik ölçümlerle oldukça tutuarlı bir şekilde değişim gösterdiğinden kapsamı daha geniştir.

(a)

(c)

Şekil 5.21: MBNK’in çözelti ortamında her bir molekülün ve bütün kinetik ölçümün öncesi ve sonrasında elde edilen YPR eğrileri

Bu veriler ışığında geliştirilen transdüser mimarisinin Tespit Limiti (LOD) 27,6 M olarak hesaplanmıştır [175]. Literatürdeki YPR tabanlı sensörlerin tespit limiti genel olarak 1000-0,1 nM arasında değişmektedir [194-199]. Ayrıca elektrokimyasal tabanlı sensörlerde atto molar seviyesinde tespit limitleri başarılmıştır200_{. Üretilmiş bu sistem}

için yüzeye sabitlenen nanoparçacıkların yoğunluğu düzenli bir şekilde arttırılabilirse tespit limitinin de artacağı öngörülmektedir.

Çizelge 12: 5 farklı derişimdeki LBFA ile meydana gelen rezonans açısı değişimi

Rezonans açısı değişimi (Ɵ) Derişim (10-3 _M)

0,45±0,03 2,0 0,3 1,5 0,24±0,02 1,0 0,1 0,5 0,062±0,006 0,25 (a) (c) (b) (d)

Şekil 5.22: Farklı derişimlere sensörün verdiği cevap ile oluşturulan Tespit Limiti (LOD) hesaplama eğrisi

6. FONKSİYONEL NANOPARÇACIKLARIN SUCUL ORTAMDAN