Maturidiyye'ye Göre Günahların Affı

DEPOIS

Figura 24 - Actograma mostrando a intensidade da atividade locomotora 1 dia antes, dia do pulso e 1 dia depois. Na figura, o estímulo atingiu a HC 4 (quadrado pontilhado). Nesse caso, não observamos incremento na atividade locomotora.

Figura 25 – Teste ANOVA (one-way, Tukey pós-teste). Atividade locomotora do sagüi por hora circadiana em condições de claro constante (250 lx), mostrando concentração de atividade no início do dia subjetivo. *p < 0,05 / **p < 0,001.

Figura 26 – Histogramas mostrando o registro de atividade locomotora no dia do pulso na HC 3 (A) e na HC 4 (B). Registro de atividade nas HC’s 3 (C) e HC’s 4 (D) 1-7 antes do pulso e 1-7 depois.

Figura 27 – Histogramas mostrando o registro de atividade locomotora no dia do pulso na HC 12 (A) e na HC 17 (B). Registro de atividade nas HC’s 12 (C) e HC’s 17 (D) 1-7 antes do pulso e 1-7 depois.

Figura 28 – Curva de resposta dependente de fase para o escuro. Animais mantidos em claro constante (250 lx) recebendo pulso de escuro com duração de 45 min.

6. DISCUSSÃO

6.1 – Citoarquitetura do Núcleo Pré-geniculado

O NPG foi primeiramente nomeado por Vogt em 1909, em que o mesmo o descreveu como um aglomerado de células semelhante a um capuz, o qual envolvia o núcleo geniculado lateral dorsal (GLD). Friedemann (1912), considerou o NPG como sendo derivado do núcleo reticular do tálamo (RT), devido ao incremento na densidade celular em suas proximidades. Balado e Franke (1937), observando a morfologia celular, foram os primeiros a abordar o NPG como uma estrutura bilaminar. Fazendo uma análise comparativa do núcleo geniculado lateral ventral (GLV) em diversos mamíferos, Niimi et al. (1963), dividiram o NPG em duas lâminas, interna e externa, sendo a primeira ainda dividida em subcamadas interna e externa, ambas contíguas com o RT inicialmente, tomando direção à zona incerta em sentido mais caudal. A camada externa foi descrita sendo pobremente desenvolvida e restrita a porção caudal do núcleo. Jones (1985) descreve o NPG contendo duas porções, uma látero-dorsal ao GLD e outra dorsomedial. Em nossa análise, a primeira seria equivalente à camada externa do NPG, descrita por Niimi em 1963, e a segunda corresponderia à camada interna (contendo suas duas subcamadas).

Baseado na morfologia celular, após realizar a técnica de Nissl e imunohistoquímica contra NeuN, caracterizamos o NPG como uma estrutura bilaminar, possuindo uma lâmina externa (NPGle) e outra interna (NPGli). Em ambas as camadas, não identificamos qualquer característica morfológica que permitisse maiores subdivisões. A presença de neurônios grandes e poligonais exclusivamente na NPGle e de neurônios pequenos esféricos e fusiformes na NPGli permitiu distinguir nitidamente essas duas regiões, corroborando com os achados de Niimi et al (1963), ao descrever a lâmina interna do NPG. O RT mantém uma estreita relação com ambas as lâminas do NPG e em determinados níveis chega a fundir-se a elas, isso provavelmente contribui para imprecisão na delimitação do mesmo. A origem embriológica comum entre o NPG e o RT, derivados do diencéfalo ventral, justifica esse fato (Polyak, 1957).

Babb (1980), em Macaca mullata, observando aspectos da morfologia neuronal, divide o NPG em duas lâminas, uma interna (NPGli) e outra externa (NPGle). A

NPGli estende-se como uma densa projeção dentro do tracto óptico, passando sobre o GLD, de uma posição lateral a uma região mais medial ao mesmo. A NPGle curva-se em torno da cápsula geniculada e parece emergir imperceptivelmente com o globo pálido anterolateralmente, com o núcleo reticular mais lateralmente e com estruturas do subtálamo após penetrar na cápsula interna em regiões mais mediais (ver figura 1).

Moore (1989), em Macaca mullata, descreveu o NPG da mesma maneira que Jones (1985), no entanto, ele sugere que o grupamento látero-dorsal seria subdividido em duas outras camadas. A primeira camada estaria localizada mais dorsalmente e contígua à parte ventral do RT e a segunda compreenderia todos os outros neurônios remanescentes e, estes, já fariam parte do grupo medial. Segundo o autor, essa primeira camada seria equivalente ao núcleo perigeniculado de gatos ou ao GLV de roedores. O grupo medial como um todo seria equivalente ao FIG dos roedores, já que o mesmo identificou neurônios imunorreativos a NPY e aferência bilateral da retina nessa região. Ele ainda acrescenta que este fato traz indícios de que o GLV poderia não estar presente em primatas ou seria muito pequeno em relação a outros mamíferos. O mesmo também sugere que mais estudos neuroquímicos precisariam ser realizados para se definir a localização do equivalente ao GLV em primatas e que, para isso, dever-se-ia empregar anticorpos contra substâncias que tenham sido descritas presentes exclusivamente no GLV. Moore (1993), diferente de seu trabalho anterior, adota a subdivisão proposta por Jones inicialmente, dividindo o NPG em um grupamento látero-dorsal e outro dorsomedial ao GLD. Nessa nova proposta, ele considera o grupamento medial como contendo o equivalente ao GLV e FIG de roedores, baseando-se nas características neuroquímicas, como a presença de imunorreatividade a NPY e ENK (neurônios e fibras) e SP (fibras), e também no padrão das aferências retinianas. Em ambos os trabalhos, ele avalia o NPG em apenas um nível. Sabemos que diferenças na citoarquitetura, distribuição neuroquímica e projeções da retina variam no sentido rostro-caudal, em estudos realizados com roedores (Moore e Card, 1994a). Esse aspecto também precisa ser considerado na caracterização do NPG dos primatas.

Em relação à morfologia celular, as técnicas de Nissl e de Golgi tem revelado no NPG a presença de 2 ou 3 tipos de neurônios. Polyak (1957), com a técnica de Nissl, descreve neurônios pequenos e fusiformes, médios e multipolares e grandes e

poligonais, com citoplasma intensamente marcado. O primeiro e segundo tipos estão presentes na NPGli e o terceiro na NPGle. Com a técnica de Golgi, Hendrickson (1973) descreve apenas 2 tipos: neurônios pequenos, encontrados na NPGli e neurônios grandes, localizados na NPGle. Babb (1980), descreve 3 tipos de células no NPG com a técnica de Golgi: o primeiro tipo possui pericário pequeno e esférico e encontra-se localizado apenas na lâmina interna do NPG; o segundo é grande e possui um pericário poligonal e pode ser visualizado exclusivamente na lâmina externa; e o terceiro tipo pode ser observado ocupando ambas as lâminas, possuindo um pericário ovóide. Esses últimos foram de difícil identificação no NPG do sagüi. A técnica citoarquitetônica utilizada em nosso trabalho e o plano de corte do tecido podem ter tido influência nesse aspecto, impedindo conclusões mais precisas. Mesmo assim, considerando a presença dessas células, notamos que a morfologia neuronal da NPGle se assemelha as das células presentes no GLV de roedores e que a NPGli possui células que lembram ao aspecto descrito para o FIG. Esses resultados corroboram com a idéia de Moore (1993), em que teríamos um NPG contendo o equivalente ao GLV e FIG dos roedores. Entretanto, na NPGle as duas populações neuronais descritas estão homogeneamente distribuídas, diferente do GLV, em que esses dois tipos celulares estão topograficamente organizados, permitindo delimitar dois subsetores.

Comparativamente, em roedores, o método de Nissl revela neurônios pequenos e de pericário ovóide, semelhantes às células da divisão interna do GLV, em toda extensão do FIG (Hickey e Spear, 1976). Nas preparações de Golgi, um segundo tipo de neurônio é descrito ocupando a porção mais rostral, o qual possui um pericário pleomórfico e arborização dendrítica diferente daqueles da região caudal. Nesta última, a morfologia neuronal se aproxima das células descritas com a técnica de Nissl, mostrando neurônios mais alongados (Moore e Card, 1994a). Vale salientar, que a divisão externa do GLV apresenta neurônios poligonais e maiores do que os da divisão interna nas técnicas de Nissl (Rockel et al. 1972; Swanson et al. 1974), e suas células lembram o aspecto descrito para o grupo rostral do FIG na técnica de Golgi. Em última análise, a morfologia das células do FIG parece acompanhar aquelas do GLV com a qual mantêm relação anatômica.

Nota-se, como descrito acima, uma grande dificuldade de delimitar com precisão o NPG de primatas. Como se pôde observar, há muita divergência entre os

autores. Isso se deve ao fato de que estes não avaliaram todas as características necessárias para compreender a organização do NPG. Ao considerar o NPG uma estrutura homóloga ao FIG e GLV de roedores, precisar-se-ia demonstrar em que região do NPG estaria o FIG e em que outra porção se encontraria o GLV. Para isso, mister se faz reunir informações a respeito da citoarquitetura, neuroquímica, projeções retinianas, atividade celular, eletrofisiologia e hodologia. Também, é necessária uma análise comparativa, confrontando esses dados com o que se tem descrito para o FIG e GLV de roedores. Assim, poderemos compreender se o NPG, ou parte dele, corresponde ao FIG e GLV de roedores. Portanto, em nosso estudo, procuramos levantar o maior número de dados possível (exceto hodologia), sugerindo uma organização diferente do que é proposto na literatura para o NPG (ver figura 22).

6.2 – Projeção Retiniana

Identificamos no sagüi uma forte predominância contralateral da projeção retiniana às duas lâminas do NPG. A NPGli apresenta uma alta densidade destas fibras em relação à NPGle. No entanto, nosso estudo mostra que a NPGle também recebe tais projeções, diferindo de alguns estudos relatados por Jones (1985), em Macaque

monkey. Este último descreve o NPG contendo uma região localizada mais

dorsalmente, a qual é contígua com o núcleo reticular do tálamo, e outra mais ventral que se estende em direção à zona incerta, medialmente. Ainda, nesse trabalho, identificou-se uma projeção bilateral da retina a porção ventral do NPG e nenhuma fibra ou terminal foi descrito presente na região dorsal. Costa et al. (1998), num estudo realizado com sagüis, mostraram a presença de fibras e terminais de CTb no NPG bilateralmente. A distribuição dessas fibras estava concentrada na porção ventral. Na região dorsal foram identificadas fibras esparsas no NPG contralateral ao olho injetado. Nossos resultados se assemelham aos descritos por Moore (1993) e Costa et

al. (1998), em suas respectivas espécies de primatas.

O aspecto mais peculiar para caracterizar e distinguir os componentes do complexo geniculado lateral do tálamo de roedores é o padrão das aferências retinianas (Moore, 1993). O FIG e o GLV apresentam uma distribuição característica dessas fibras. Geralmente, nesses animais, a projeção da retina para o FIG se mostra bilateral podendo haver uma discreta (Moore e Card, 1994a) ou uma forte predominância

contralateral (Goel et al., 1999). Em contrapartida, o GLV recebe quase exclusivamente fibras provenientes da retina contralateral (Moore, 1993). Moore (1993), numa análise comparativa entre macacos e humanos, sugere que a porção ventral do NPG, imediatamente medial ao GLD, a qual recebe projeção bilateral da retina, seria o equivalente ao FIG dos roedores e que a região mais dorsal corresponderia ao GLV, já que a mesma recebe praticamente apenas fibras contralaterais. Nesse contexto, apesar da organização do complexo geniculado lateral do tálamo de primatas diferir substancialmente do de roedores, acreditamos que a organização das aferências retinianas no FIG e GLV de roedores se preservaram filogeneticamente no NPG do sagüi.

Outro aspecto interessante é que as fibras retinianas fazem contato sináptico com neurônios imunorreativos a NPY e ENK no FIG, num estudo feito em ratos (Takatsuji et al. 1991b). No nosso estudo, o NPG também apresentou células com a mesma neuroquímica. Assim, comparando a localização das fibras retinianas com as da população celular, é bastante provável que esse aspecto também seja verdade no sagüi, uma vez que os neurônios NPY e ENK-positivos encontram-se localizados numa região de alta densidade de fibras retinianas.

6.3 – Neuroquímica

A presença de imunoreatividade a NPY é considerada um critério para definir os limites anatômicos do FIG de roedores. A marcação de células e fibras evidenciam o FIG, uma vez que contrasta com a ausência dessa imunorreatividade no GLD e com os poucos neurônios marcados no GLV. Em todo segmento rostrocaudal podem ser visualizados neurônios e um moderado plexo de fibras, estas últimas não se estendem além dos limites do FIG. Ocasionais axônios podem ser visualizados no GLV e uma distribuição esparsa destes no GLD. Também tem sido demonstrado uma co- localização de NPY e GABA. A presença de fibras e terminais imunorreativos a NPY no NSQ são provenientes dessas células do FIG, via TGH (Moore e Card, 1994a). A presença dessa população celular no NPG do sagüi e de fibras na porção ventrolateral do NSQ fornece indícios da existência de um TGH nessa espécie (Costa et al, 1998). Em humanos, também foram encontrados neurônios NPY-positivos no NPG, no entanto, a presença de fibras no NSQ é dispersa e escassa, já que neste núcleo podem

ser visualizadas numerosas células imunorreativas a NPY. Isso pode indicar diferenças na organização do sistema de temporização circadiana em relação a outros mamíferos. Além de identificar presença de neurônios NPY-positivos na NPGli do sagüi, verificamos que estes formam um moderado plexo de fibras e terminais nessa região e praticamente não emitem projeções à NPGle. Essas informações são sugestivas de um NPG contendo o equivalente ao FIG e GLV dos roedores.

Na maioria dos roedores podem ser identificados neurônios e fibras imunorreativos a ENK no FIG. Quanto à morfologia, os neurônios ENK-positivos são semelhantes aos que contém NPY e estão mais densamente concentrados na porção caudal do FIG. Essas células também apresentam co-localização com GABA e se projetam para o FIG contralateral. Esses neurônios estão presentes em todo o sentido rostrocaudal do FIG, num padrão que se superpõe as das células NPY-positivas, e apresentam marcação menos intensa que o NPY (Moore e Card, 1994a). Em hamster, esses neurônios também projetam fibras para o NSQ via TGH (Morin e Blanchard, 1995). Um procedimento imunohistoquímico contra ENK no NSQ do sagüi ajudaria a discutir sobre a existência de uma projeção semelhante ao dos hamsteres, uma vez que encontramos neurônios imunorreativos a ENK no NPG do sagüi. O GLV também apresenta neurônios ENK-positivos, no entanto, estes revelam uma morfologia diferente daqueles do FIG. No sentido rostrocaudal, suas células tomam posição mais lateral e gradualmente vão ocupando as porções mais mediais, podendo ser facilmente distinguidas (Moore e Card, 1994a). No nosso estudo, revelamos a presença de poucos neurônios ENK-positivos localizados na mesma região ocupada pelos neurônios NPY- positivos, bem como a presença de fibras e terminais dispersos por toda NPGli no NPG do sagüi. Assim, podemos sugerir a existência de uma projeção do NPG contralateral. A ausência de marcação na NPGle do sagüi contrasta com a hipótese de que esta região do NPG corresponderia ao GLV de roedores ou que, na verdade, o equivalente ao GLV em primatas possua uma organização neuroquímica diferente. Moore (1993), encontrou neurônios dispersos e fibras ENK-positivas no NPG do

Macaque monkey e somente fibras no NPG de humanos. A marcação para ENK

encontrada apenas na NPGli do sagüi pode refletir diferenças inter-específicas na neuroquímica do NPG dos primatas.

Tem sido descrito um padrão variável e não reproduzível dos procedimentos imunohistoquímicos utilizando anticorpo contra GABA. A imunohistoquímica contra a descaborxilase do ácido glutâmico (GAD), enzima que sintetiza o GABA, mostra resultado mais fidedigno. Numerosos neurônios GAD-positivos encontram-se distribuídos ao longo do FIG, bem como um denso plexo de fibras repletas de varicosidades. O mesmo perfil imunorreativo é encontrado no GLV e no GLD, este último apresenta uma marcação menos densa que a do FIG e GLV. Não existe diferença morfológica evidente entre os neurônios do GAD-positivos do FIG e do GLV, entretanto, no FIG, estes se encontram mais densamente distribuídos (Moore e Card, 1994a). No NPG do sagüi a distribuição de GAD pode indicar uma organização funcional diferente comparando-se ao padrão descrito para roedores, visto que sua imunorreatividade ficou claramente concentrada na NPGle. Neurônios co-localizados contendo GAD-NPY e GAD-ENK talvez não existam nessa espécie, uma vez que NPY e ENK só foram encontrados na NPGli. Considerando a hipótese de que o TGH e a projeção contralateral do NPG do sagüi apresentem a mesma organização neuroquímica encontrada em roedores, ambas as lâminas do NPG teriam de contribuir para a formação dessas vias. Assim, o TGH do sagüi seria forma do pela projeção dos neurônios NPY-positivos da NPGli e pelos neurônios gabaérgicos da NPGle e a projeção comissural ao NPG contralateral seria formada pelos neurônios ENK- positivos da NPGli e pelos neurônios gabaérgicos da NPGle.

De uma forma geral, a imunorreatividade contra proteínas ligantes de cálcio nos roedores se caracteriza pela positividade a CB e CR e uma total ausência a PV (Célio, 1990; Arai et al. 1993). No sagüi, encontramos imunorreatividade para todas as proteínas ligantes de cálcio. Isso confirma achados anteriores nessa mesma espécie (Costa et al. 1998; Cavalcante et al. 2008). O GLV de roedores, principalmente sua lâmina externa, é caracterizada por apresentar imunorreatividade contra PV (Moore e Card, 1994a). Os nossos achados ao descreverem neurônios PV-positivos no NPG corroboram ainda mais com a idéia deste núcleo ser equivalente não somente ao FIG, mas também ao GLV.

Um denso plexo de fibras e terminais imunorreativos a 5-HT (Moore e Card, 1994a) e SP (Moore e Card, 1994a; Piggins et al. 2001b) estão presentes no FIG e GLV de diversos roedores. A primeira já foi demonstrada ser proveniente do núcleo

dorsal da rafe e funcionalmente tem-se observado que a ativação comportamental induz a mudanças de fase dos ritmos por meio desses neurônios (Morin e Allen, 2006). A presença de fibras serotoninérgicas no complexo geniculado lateral do tálamo de roedores pode ser encontrada, em todos os níveis, nos seus 3 núcleos. Há, no entanto, uma discreta predominância dessas fibras no GLD e GLV, em comparação ao FIG (Moore e Card, 1994a). Visualmente, o padrão de distribuição das fibras de 5-HT no NPG do sagüi parece ser homogêneo em ambas as lâminas e no GLD. A alta concentração serotonina no NPG do sagüi pode indicar uma participação do estado comportamental na ritmicidade biológica nessa espécie. A identificação de neurônios imunorreativos à serotonina nos núcleos da rafe mesencefálica do sagüi associado com técnicas hodológicas são indispensáveis para concluir sobre a origem das fibras encontradas no NPG.

Em relação a SP, ainda não foi identificada a origem de tal aferência (Morin et

al. 1992; Piggins et al. 2001b). Uma possibilidade é que esta seja proveniente das

células ganglionares da retina, uma vez que já foi demonstrado imunorreatividade dessas células à SP e que as mesmas projetam para o NSQ num padrão o qual se superpõe às fibras e terminais do TRH (Takatsuji et al. 1991a; Mikkelsen e Larsen, 1993). Diversos estudos mostram a importância dessa substância no controle dos ritmos biológicos, como por exemplo: a injeção de SP dentro do NSQ promove aumento de sua atividade metabólica (Shibata et al. 1992) e o bloqueio de seu receptor (NK1) promove significativa mudança de fase dos ritmos em determinadas condições experimentais (Challet et al. 2001). No sagüi, a alta concentração de fibras SP- positivas na NPGli em relação a NPGle e, nesta última, a região dorsal predominantemente mais bem marcada, revela um alto grau de conservação filogenética na organização dessas fibras. A imunorreatividade para SP no FIG e GLV de roedores corroboram com a afirmativa anterior, uma vez que o FIG se mostra evidentemente bem marcado e o GLV com fibras dispersas e concentradas na lâmina interna deste núcleo (Moore e Card, 1994a). Assim, a região encontrada marcando a porção mais dorsal da NPGle do sagüi poderia ser equivalente à lâmina interna do GLV de roedores.

Os astrócitos são células fundamentais para o funcionamento da barreira hematoencefálica. Eles contribuem reforçando as junções oclusivas das células que

formam a parede dos capilares cerebrais. Assim, esse conjunto atua como um mecanismo protetor regulando a troca de substâncias dentro do sistema nervoso central (Abbott, 2002). A alta concentração dessas células em torno dos vasos sanguíneos no NPG do sagüi certamente desempenha essa função protetora. Os astrócitos também são importantes para a comunicação intercelular e coordenação da atividade neuronal, como demonstrado no NSQ de hamsteres, modulado pelas aferências retinianas (Lavialle et al. 2001). Achados em ratos e hamsteres mostram que a GFAP, proteína indicadora da presença de astrócitos, está presente em toda extensão do FIG desses animais. Uma densa imunorreatividade contra GFAP está presente no FIG que, inclusive, contrasta com a baixíssima marcação das áreas diencefálicas vizinhas. (Morin et al. 1989). No sagüi, também encontramos essa proteína ocupando todo segmento rostrocaudal do NPG. No entanto, a NPGli foi predominantemente melhor marcada que a NPGle correspondendo aos resultados descritos para roedores. A numerosa população astrocitária ou de seus processos celulares nos centros circadianos, em relação a outras regiões do diencéfalo, podem indicar um papel especial dessas células na ritmicidade biológica. Variação circadiana na expressão de GFAP foi evidenciada no NSQ e FIG de camundongos sob luz constante (Moriya et

al. 2000; Santos et al. 2005).

6.4 – Expressão de FOS

No NPG do sagüi verificamos que o pulso de escuro promoveu um incremento na expressão da proteína FOS. O baixo tamanho da amostra não nos permitiu averiguar se a diferença encontrada entre os grupos é estatisticamente significante.

Até agora, as informações colhidas pelo nosso estudo nos levam a crer numa