Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon (MALDI)

Kütle spektrometri şüphesiz halen kullanılan tüm analitik yöntemlerin en geniş uygulama alanına sahip olup maddelerin elementel bileşimlerinin belirlenmesinde, inorganik, organik ve biyolojik moleküllerin yapılarının aydınlatılmasında, karmaşık karışımların kalitatif ve kantitatif analizlerinde, katı yüzeylerinin yapılarının ve bileşimlerinin aydınlatılmasında; bir numunenin izotopik oranlarının bulunmasında oldukça yararlı bir yöntemdir (Kılıç vd 2000a).

Kütle spektrometreleri iyon oluşturma ve bu iyonları kütle/yük (m/z) oranlarına göre ayırma yeteneğine sahip cihazlardır. Ayırmanın gerçekleştirilebilmesi için cihaz içinde elektrik ya da manyetik alanlar oluşturulmaktadır. Cihaz içinde oluşturulan söz konusu alanlar iyonların uzaysal yörüngelerini, hızını ve/veya yönünü etkileyerek ayrılmalarını sağlamaktadır. Elektromanyetik alanların iyon hareketi üzerindeki etkileri iyon kütlesi ile ters, iyon yüküyle doğru doğru orantılı olarak değişmektedir. Böylece moleküler kütlenin tespit edilebildiği, iyon bolluğuna (abundance) karşı m/z oranını gösteren kütle spektrumları elde edilmektedir (Cañas vd 2006).

İyonizasyon kaynağı, analizör, detektör, veri işlemcisi ve vakum pompası kütle spektrometresindeki ana kısımlardır (Şekil 2.9). İyon üretimi iyonlaştırma kaynağına bağlı olarak atmosferik basınç altında gerçekleştirebilmektedir. Ancak etkili bir ayırmanın gerçekleştirilebilmesi için iyonların hava molekülleri ile çarpışması engellenmeli, yani analizör ve detektör vakum altında olmalıdır (Cañas vd 2006).

44

Elektromanyetik alanlarda etkili bir ayırmanın sağlanabilmesi için nötral moleküllerin iyonlara dönüştürülmesi ve gerekirse gaz faz haline geçmeleri gerekmektedir. Peptid ve proteinlerin yüksek moleküler ağırlıkları ve polar yapıları göz önüne alındığında, iyonlaştırıcı kaynak protein ya da peptidleri hem iyon haline hem de gaz faza geçirmelidir. Çeşitli iyonlaştırıcı kaynaklar arasında sadece elektrospray iyonizasyon (ESI) ve matriks yardımlı lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) proteinlerin analizi için uygundur (Cañas vd 2006).

Kütle spektrometresinin bir diğer kısmı olan analizör, iyonlaştırıcı kaynakta elde edilen iyonların m/z oranlarına göre ayrılmasını sağlamaktadır. İdeal olarak kütle analizörleri küçük kütle farklarını ayırdedebilecek duyarlılıkta olmalıdır. Kütle analizörlerinde elektrik veya manyetik alanlar kullanılabilmektedir. Tüm analizörler uygun bir iyonlaştırıcı kaynak ile birleştirildiğinde, peptid ve proteinlerle çalışmaya uygun hale gelmektedir. Kullanım kolaylığı ve düşük maliyetleri nedeniyle en yaygın kullanılan kütle analizörleri kuadrupol ve uçuş zamanlı (TOF-time of flight) kütle analizörleri ve iyon kapanlı analizörlerdir (Kılıç vd 2000a, Cañas vd 2006).

Kütle spektrometresi yöntemiyle peptid ve proteinlerin tanımlanmasında en çok kullanılan iyonizasyon yöntemleri desorpsiyon kaynaklı elektrospray iyonizasyon (ESI) ve matriks yardımlı lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI)’dur (De Hoffmann ve Stroobant 2007). Desorpsiyon kaynaklı kütle spektrometrelerinin diğer iyonizasyon yöntemlerine göre avantajı, uçucu olmayan ve termal olarak kararsız numunelere de uygulanabiliyor olmasıdır (Kılıç vd 2000a).

Elektrosprey iyonlaştırma/kütle spektrometresi (ESI/MS), proteinler, polipeptidler ve mol kütlesi 105 Da’dan büyük oligopeptidler gibi biyomoleküllerin analizi için ilk defa 1984 yılında önemli bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. ESI/MS yöntemi analit ve çözücü molekülleri içeren akışkanın ince kapilerde yüksek voltaj ve atmosferik basınçta iyonlar şeklinde gaz faza dönüştürülmesi ve söz konusu iyonların kütle spektrometresi ile tespit edilmesi prensibine dayanmaktadır (Karataylı ve Bozdayı 2008, Kebarle ve Verkerk 2010). Elektrosprey iyonlaştırma Şekil 2.10’da görülen cihazda atmosfer basıncında ve oda sıcaklığında gerçekleştirilmektedir. Örneğin içinde bulunduğu çözelti, paslanmaz çelikten iğne şeklinde kapiler ile, dakikada birkaç mikrolitre hız sağlanarak pompalanmaktadır. İğneye, etrafındaki silindirik elektroda göre birkaç kilovolt enerji uygulanmaktadır. Oluşan çok küçük ve elektrik yüklü damlacıklar, daha sonra bir çözücü giderme kapilerinden geçmektedir. Burada çözücü buharlaşmakta ve elektrik yükleri analit moleküllerine tutunmaktadır. Çözücü buharlaşıp damlacıklar küçülürken yük yoğunlukları artmakta ve iyonlar gaz fazına desorbe olmaktadır (Kılıç vd 2000a).

45

Şekil 2.10. Elektrosprey iyonizayonlaştırma kaynağı (Kılıç vd 2000a)

Protein gibi büyük biyomolekülleri oldukça duyarlı biçimde kolayca iyonize edebilen ve kütle spektrometresinde iyon kaynağı olan MALDI metodu ise, ilk olarak 1988 yılında Franz Hillenkamp ve Michael Karas tarafından ortaya konulmuştur (Özen Karataylı ve Bozdayı 2008, Baum 2013). Söz konusu yöntem bulunduğu zamandan bu yana sürekli olarak geliştirilmiş olup; proteinler, oligonükleotidler, sentetik polimerler gibi büyük molekül ağırlıklı, uçucu olamayan ve termal olarak kararsız olan bileşenler ile büyük molekül ağırlıklı inorganik bileşenlerin bozulmamış gaz fazı iyonlarının üretilmesinde kullanılan en önemli teknikler arasında yer almaktadır (De Hoffmann ve Stroobant 2007, Baum 2013).

Proteomik çalışmalarda yaygın olarak kullanılan MALDI’nin prensibi, ultraviyole ışınları absorblama özelliğine sahip bir matriksin kullanılmasına dayanmaktadır. Hem desorpsiyon hem de iyonizasyonu sağlayan MALDI matriksi, bu metodun başarılı bir şekilde uygulanmasındaki en önemli faktördür. MALDI prosesi iki aşamadan oluşmaktadır. İlk aşamada, analiz edilecek bileşen (peptid karışımı) ile lazer dalga boyunda güçlü absorblama yeteneğine sahip küçük organik molekülleri ihtiva eden matriks uygun çözücü içinde çözülerek karıştırılmaktadır. Daha sonra söz konusu karışım MALDI örnek yükleme plakalarına aktarılmakta ve çözücünün uzaklaştırılması amacıyla kurutulmaktadır. Söz konusu işlem sonucunda, matriks kristalleri arasına gömülü halde bulunan ve birbirinden tamamen izole hale gelen kokristalizayona uğramış analit molekülleri elde edilmektedir. İkinci aşama ise kütle spektrometresi kaynağının içinde vakum koşulları altında gerçekleşmektedir. Bu amaçla, MALDI örnek plakası cihaza yerleştirilmekte ve örnek plakası yüzeyine yapılan yoğun lazer darbeleri ile plaka üzerinden moleküllerin ayrılması sağlanmaktadır. MALDI prosesinin kesin mekanizması bugüne kadar tam olarak açıklanamamıştır. Ancak matriks moleküllerinin uyarımıyla birlikte kondense fazda büyük miktarda enerji birkimi sonucu lazerle ışınım, kristallerin hızla ısınmasını tetiklediği ve bu hızlı ısınmanın matriks kristallerinin lokal süblimleşmesine, bir kısım kristal yüzeyin aşınmasına ve matriksin genleşen matriks

46

duman bulutu içerisindeki analitleri de beraberinde taşıyarak gaz faza geçmesine neden olduğu düşünülmektedir (Cañas vd 2006, De Hoffmann ve Stroobant 2007).

İyonlaşma reaksiyonları bu işlem esnasında herhangi bir zamanda vakum koşulları altında gerçekleşebilmektedir. Ancak MALDI’de üretilen iyonların kaynağı henüz tam olarak açıklanamamıştır. MALDI için önerilen kimyasal ve fiziksel iyonizasyon yolları arasında gaz-faz fotoiyonizasyon, uyarılmış hal proton transfer, iyon molekül reaksiyonları, önceden oluşturulmuş iyonların desorpsiyonu ve daha fazlası yer almaktadır. En geniş çapta kabul edilen iyon oluşum mekanizması desorpsiyon öncesi katı fazda protein transferi ya da fotoiyonize matriks moleküllerinden genleşen matriks dumanı içinde gaz-faz proton transferidir. Daha sonra gaz fazındaki iyonlar analizöre gönderilmek üzere elektrostatik alanda hızlandırılmaktadır. MALDI desorpsiyon iyonizasyon işlemi Şekil 2.11’de şematik olarak gösterilmiştir (De Hoffmann ve Stroobant 2007).

Şekil 2.11. MALDI iyonlaştırma yönteminin şematik görünümü (De Hoffmann ve Stroobant 2007)

MALDI kütle spektrometresinde elde edilen sonuçların kalitesi örnek hazırlama aşamasına bağlı olduğu için matriks seçimi ve örnek hazırlama protokolününün optimizasyonu analizin en önemli aşamalardır. Farklı analitler ve analitik problemler için farklı matriksler bulunmakta olup, matriksin seçiminde kullanılan lazerin dalga boyu esas alınmaktadır. MALDI matriksi lazer dalga boyunu güçlü bir şekilde absorblama, vakum kararlılığı, analit iyonizasyonunu destekleme yeteneği, analit ile uygun çözücüler içinde çözünürlük, kimyasal reaksiyona girmeme gibi özelliklere aynı anda sahip olmalıdır. Ancak iyi bir matriks seçimi için söz konusu özellikler her zaman yeterli olamayabilmektedir (De Hoffmann ve Stroobant 2007). Örneğin uçuş zamanlı kütle analizörlerinde çözme gücü örnek yüzeyinin düzgünlüğüne bağlı olarak değiştiği için matriksin düzgün ve büyük kristaller oluşturması arzu edilmektedir. En sık kullanılan matriksler arasında α-siyano-4-hidroksisinamik asit (CHCA), sinapik asit olarak da bilinen sinapinik asit, 2,5-dihidroksi-benzoik asit (DHB), hidroksi pikolinik asit ve süksinik asit yer almaktadır (O’Connor 2010). Söz konusu matriksler arasında sinapinik asit ve α-siyano-4-hidrosinamik asit sırasıyla, protein ve peptid analizleri için en yaygın

47

olarak kullanılan matrikslerdir (Cañas vd 2006). Çizelge 2.2’de yaygın olarak kullanılan matriksler ve bu matrikslerin genel özellikleri sunulmuştur.

Çizelge 2.2. Yaygın olarak kullanılan MALDI matriksleri (Hillenkamp ve Karas 2007)

Matriks Dalga boyu Önemli uygulama alanları

Nikotinik asit UV

266 nm

Proteinler, peptidler, eklenti oluşumu 2,5-Dihidroksi-benzoik asit (ilave %10 2-hidroksi-5- metoksi-benzoik asit) UV 337 nm, 353 nm Proteinler, peptidler, karbonhidratlar, sentetik polimerler Sinapinik asit UV 337 nm, 353 nm Proteinler, peptidler α-Siyano-4-hidroksisinamik asit UV 337 nm, 353 nm Peptidler, 3-Hidroksi-pikolinik asit UV 337 nm, 353 nm

Nükleik asitler için en uygunu

6-Aza-2-tiyotimin UV

337 nm, 353 nm

Proteinler, peptidler, kovalent olmayan

kompleksler; nötral pH’ya yakın k,m,n-Di(tri)hidroksi- asetofenon UV 337 nm, 353 nm Proteinler, peptidler, kovalent olmayan

kompleksler; nötral pH’ya yakın Süksinik asit IR 2.94 µm, 2.79 µm Proteinler, peptidler Gliserol IR 2.94 µm, 2.79 µm Proteinler, peptidler, sıvı matriks

UV: ultraviyole, IR: İnfrared

MALDI iyonları oldukça düşük kaliteli spektra üreten düşük maliyetli kuadrupol iyon tuzak kütle spektrometrelerinden (QIT/MS) aşırı yüksek kalitede spektra üreten yüksek maliyetli Fourier dönüştürücü kütle spektrometrelerine (FT/MS) kadar birbirinden farklı çok sayıda kütle spektrometresi kullanılarak analiz edilebilmektedir. Ancak MALDI iyonları için en yaygın kütle analizör tipi uçuş zamanlı kütle spektrometreleridir (TOF/MS). MALDI genellikle birkaç nanosaniye genişliğinde iyon darbeleri oluşturduğu için TOF analizörleri için özellikle uygundur. Ayrıca MALDI 1 MDa’dan çok daha büyük kütleli iyonlar oluşturabilmektedir. Elektrospreyin aksine, tek yüklü iyonlar genellikle baskın olmakla birlikte MALDI iyonları sadece birkaç yük taşımaktadır. Yine TOF prensip olarak sınırsız kütle aralığına sahip olmasından dolayı bu gibi büyük iyonlar için en uygun kütle analizörüdür (O’Connor ve Hillenkamp 2007). Sonuç olarak; MALDI-TOF kütle spektrometresi 400 ile 350 000 Da molekül ağırlığındaki proteinler, peptitler, oligosakkaritler ve oligonükleotidler gibi biyomoleküllerin belirlenmesi ve tanımlanmasında kullanılabilmektedir (Yürüt 2010).

48

3. MATERYAL VE METOT