Denemelerde bir depo zararlısı olan A. obtectus kullanıldı. Denemeler 15, 20 ve 30±2 °C sıcaklık, %60±5 nem şartlarında yapıldı. Denemeler sırasında herhangi bir fotoperyot rejimi uygulanmadı. Denemelere zararlının belirtilen üç farklı sıcaklık derecesinde stok kültürlerin kurulması ile başlandı. Stokların kurulmasında Sönmez ve Gülel (2008) tarafından uygulanan yol takip edildi. Denemelerde kullanılacak olan kuru fasulye tohumları stok kültürler kurulmaya başlamadan önce, daha önceden parazitlenmiş olabileceği göz önüne alınarak, -80 °C’da üç gün derin dondurucuda tutuldu ve daha sonra kullanılıncaya kadar +4 °C’da buzdolabında saklandı.
Belirli bir sıcaklık derecesinde stok kültür kurmak için laboratuarımızda bulunan A. obtectus kültüründen alınan erginler içerisinde 250 gr kuru fasulye tohumları bulunan, ağızları hava sirkülasyonunu önlemeyecek şekilde bez ile kapatılan 500 ml’lik cam kavanozlara konuldu. Hazırlanan bu kavanozlar %60±5 bağıl nem şartlarında muhafaza edildi. Kavanozlarda ergin çıkışı başlandıktan sonra erginlerin 7-14 gün yaşadıkları dikkate alınarak 0, 4, 8 ve 12 günlük erginlerle dört yaş grubu oluşturuldu. Böcekler erginleştikleri gün 0 yaşlı olarak kabul edildi. 0 yaş grubu için erginler erginleştikleri gün eşeylerine göre ayrılıp -80 °C’daki derin dondurucuya konuldu. Belirli bir sıcaklık derecesindeki stok kültürlerden elde edilen erginler petri kaplarına alınarak belirtilen yaş gruplarına ulaşıncaya kadar aynı koşullarda muhafaza edildi. İstenilen yaşa gelen erginler derin dondurucuya konulmadan önce eşeylerine göre ayrıldı. Belirli bir sıcaklık derecesinde her yaş grubu için her eşeye ait 40 birey toplandı. Her eşeye ait 40 birey toplama işlemi populasyondan farklı zamanlarda alınan örneklerle üç defa tekrar edildi. Bu işlemler diğer iki sıcaklık için aynen tekrarlandı. Belirli bir sıcaklıkta her yaş grubu için stoklanan erginler daha sonra analizlerde kullanıldı. 20 ve 30 ºC’da yeterli sayıda 12 günlük birey elde edilemediği için belirtilen sıcaklıklarda 12 günlük erginlerde analizler yapılamadı. 12 günlük erginlerin analizleri sadece 15 ºC’da yapılabildi.
3.2. Analizler İçin Numunelerin Hazırlanması
Çalışılan sıcaklık derecelerinde yaş gruplarına ve eşeylerine göre ayrılıp -80 °C’da stoklanmış olan erginlerin gaz kromatografi numunelerinin hazırlanmasında her sıcaklık derecesi ve her yaş grubu için aynı yöntem uygulandı.
Kullanılan Madde ve Malzemeler:
Kloroform-hekzan çözeltisi (1:4 v/v), kloroform-metanol çözeltisi (2:1 v/v), sülfürik asit (8N), BF3-CH3OH (%14) (Bortriflorür %14 metanolde), % 6’lık KOH
(saf su ve metanol (1:1), NaCl (doymuş), Whatman No:41 (9cm) filtre kağıdı, homojenizatör (pro-200), su banyosu (elektro mag M2535), silika jel (mavi-2-5 mm), SHIMADZU 17A GC-FID marka gaz kromatografi cihazı
3.2.1. Toplam Yağ Miktarının Belirlenmesi
Toplam yağ miktarını belirlemede Folch ve ark. (1956)’ nın metodu kullanıldı. Bunun için belirli bir eşeye ve yaşa ait 40 adet ergin böcek tartıldı. Tartılan 40 ergin kloroform-metanol (2:1) çözeltisi ile homojenizatörde 35.000 dakika/devir’de 5 dakika homojenize edildi. Homojenat darası alınan şişeye whatman kağıdı ile süzüldü. Şişe direkt azot gazı altına tutularak şişenin içindeki kloroform-metanol çözücü karışımı uçuruldu. İçerisinde süzüntü kalan şişenin ağırlığı tekrar tartıldı ve içerisinde silika jel bulunan desikatöre konuldu. Desikatöre konulan şişe sabit ağırlığa ulaşıncaya kadar her gün tartıldı. Sabit ağırlığa ulaşıldıktan sonra son tartım değerinden şişenin dara ağırlığını çıkararak 40 bireye ait toplam yağ miktarı ve bu değerden de birey başına düşen toplam yağ miktarı mg olarak hesaplandı. Yaş ağırlığa göre birey başına düşen toplam yağ yüzdesi ise;
Birey Başına Düşen Toplam Yağ Yüzdesi=
Birey Başına Düşen Ağırlık(mg)
Birey Başına Düşen Toplam Yağ Miktarı(mg) X 100
formülü kullanılarak hesaplandı.
3.2.2. Yağ Asitlerinin Serbestleştirilmesi ve Toplam Yağ Asidi Miktarının Belirlenmesi
Toplam yağ asitlerinin miktarlarının belirlenmesinde Moss ve ark. (1974)’nın metodu kullanıldı. Yağ asitlerinin serbestleştirilmesi ve toplam yağ asidi miktarının
belirlenmesi için bölüm 3.2.1’de belirtilen şekilde hazırlanan yağlar sabunlaştırma işlemine tabi tutuldu. Bunun için içinde yağların bulunduğu şişeye 10 ml %6’lık KOH konuldu ve iyice çalkalandı. Hafifçe köpürdükten sonra su banyosunda 100°C’da bir saat kaynatıldı. Kaynatılan örnek soğuduktan sonra ayırma hunisine alındı ve üzerine faz ayırımını sağlamak için 10 ml kloroform-hekzan (1:4) karışımı konulup 100 kez iyice çalkalandı. Ayırma hunisinde oluşan iki fazdan sabunların bulunduğu sulu faz olan alttaki faz başka bir ayırma hunisine alındı, diğer artık maddelerin bulunduğu üstteki faz ise atıldı. Ayırma hunileri kullanarak kloroform-hekzan karışımı ile faz ayırma işlemi üç kez tekrar edildi. Üçüncü ayırma işleminden sonra toplanan ve ayırma hunisine konulan sabun üzerine yağ asitlerini serbestleştirmek için pH:2 oluncaya ve bulanık olan görüntü berraklaşıncaya kadar 8N sülfirik asit çözeltisi ile titre edildi. pH’nın 2 olması sağlandıktan sonra serbest hale geçen yağ asitlerinin bulunduğu çözelti tekrar ayırma hunisine konulup üzerine 10 ml kloroform-hekzan karışımı ilave edildi ve hunide iki faz oluşumu sağlandı. Sonra üstteki faz alınarak darası alınmış olan şişeye konuldu. Alt fazdaki çözeltide yağ asitlerini ayırma işlemine kloroform-hekzan karışımı ile devam edildi. Her ayırma işleminden sonra üstteki faz daha önce üst fazın konulduğu şişede biriktirildi. Kloroform-hekzan ile ayırma işlemi üç kez tekrarlandı. Daha sonra üst fazların konulduğu şişedeki kloroform-hekzan karışımı azot altında tamamen uçuruldu ve şişe tekrar tartıldı. Tartılan şişe desikatöre konuldu. Sabit ağırlığa ulaşıncaya kadar her gün tartıldı. Sabit ağırlığa ulaşınca son alınan tartım değeri ile şişenin dara değeri arasındaki farktan gidilerek 40 bireye ait toplam yağ asidi miktarı ve bu değerden giderek birey başına düşen toplam yağ asidi miktarı mg olarak hesaplandı. Yaş ağırlığa göre birey başına düşen toplam yağ asidi yüzdesi;
Birey Başına Düşen Toplam Yağ Asidi Yüzdesi=
Birey Başına Düşen Ağırlık (mg)
Birey Başına Düşen Toplam Yağ Asidi Miktarı(mg) X 100
formülünden hesaplandı.
3.2.3. Yağ Asidi Metil Esterlerinin Hazırlanması
Bir maddenin gaz kromatografide analiz edilebilmesi için uçucu ve taşıyıcı gaz ile sürüklenebilir olması gerekli olduğundan, çalışmamızda önce yağ asitlerinin uçucu türevleri hazırlandı. Bunun için bölüm 3.2.2’de hazırlanan ve içinde serbest yağ asitleri bulunan şişeye yağ asitlerinin uçucu metil esterlerini oluşturmak için 3 ml BF3-CH3OH
çözeltisi konulduktan sonra şişe su banyosunda 95 °C’da, 15 dakika bekletildi. İçinde yağ asitlerinin metil esterlerinin oluştuğu şişedeki sıvı ayırma hunisine alındı ve istenmeyen iyonik safsızlıkları ester fazından uzaklaştırarak, sulu faz ile ester fazını tam olarak ayırmak için amacıyla üzerine 10 ml NaCl konularak çalkalandı. Sonra ayırma hunisine 5 ml kloroform-hekzan karışımı konulup iyice çalkalanıp beklendi. Ayırma hunisinde faz oluşumu gözlendikten sonra üstteki faz alınıp bir şişeye konuldu. Alttaki fazda kloroform-hekzan karışımı ile ayırma işlemi üç kez tekrar edildi. Her ayırma işleminden sonra elde edilen üst fazdaki sıvı daha önceki şişeye ilave edildi. Sonra içinde yağ asidi metil esterleri bulunan şişedeki kloroform-hekzan karışımı, şişedeki sıvı 2 ml kalıncaya kadar yağ asitlerinin okside olmasını önlemek için inert bir gaz olan azot altında uçuruldu. Kalan sıvı 2 ml’lik cam şişele (vial) aktarılarak şişenin ağzı sıkıca kapatılıp parafin ile sarıldı. Hazırlanan cam şişelerdeki (viallerdeki) örnekler gaz kromatografi analizleri yapılıncaya kadar –20 derece saklandı.
3.3. Gaz Kromatografisi ile Numunelerin Analizi
Bölüm 3.2.3’de belirtilen şekilde hazırlanan numunelerin gaz kromatografi cihazı (SHIMADZU 17A GC-FID) ile analizlerine başlamadan önce yağ asitleri için özel olan kolonun şartlandırma işlemi yapıldı. Farklı konsantrasyonlarda hazırlanan miks yağ asitleri standardı kullanılarak ön analizlerle uygun sıcaklık programı belirlendikten sonra örneklerin gaz kromatografik analizi yapıldı. Her numune tekrarlanabilirlik değerlendirilmesi için iki defa analiz edildi.
3.3.1. Gaz Kromatografisi Cihazının (Shimadzu 17A GC-FID) Çalışma Koşulları Enjeksiyon bloğu giriş sıcaklığı 250 °C, enjeksiyon modu split, split oranı 1:25, taşıyıcı gaz azot, gaz basıncı 175 kPa, total gaz akış hızı:39 ml/dk.
Kullanılan kolonun özellikleri:
Kullanılan kolon SP-2380 kapillar kolon (Supelco, Katalog No:24110-U). Kolon ölçüleri:60m x 0.25mm ID, 0.20μm film kalınlığı (%90 bisiyanopropil, %10 siyanopropilfenil siloksan). Kolon gaz akış hacmi:1.25 ml/dk.
Kolon fırını, kolon giriş sıcaklığı 90 ºC, girişte bekleme süresi 7 dk., daha sonra 4 °C’lık artışlar ile 220 °C’a ulaşıldı. 220 ºC’da bekletme yapılmadan 2 °C’lık artışlar ile 250 °C’a ulaşıldıktan sonra 10 dakika bekletildi. Toplam analiz süresi 64.50 dakika, FID dedektör sıcaklığı 260 °C.
3.3.2. Miks (Karışım) Yağ Asitleri Standardının Hazırlanışı
Gaz kromatografisiyle elde edilecek yağ asitleri kromatogramlarını değerlendirmede kullanılacak olan standart yağ asitleri piklerini elde etmek için miks yağ asiti standardı kullanıldı. Bunun için Supelco FAME Mix (10mg/mL) (Katalog No: 47885-U) yağ asiti standardından 10 μl alınarak üzeri n -hekzanla 1000 μl’ye tamamlandı. Hazırlanan standart çözeltisine yukarıda verilen sıcaklık programı uygulanarak yağ asitlerinin pikleri ve alıkonma zamanları tayin edildi. Elde edilen standart yağ asitleri kromatogramı Şekil 4.25’de verilmiştir.
3.3.3. Elde Edilen Kromatogramların Değerlendirilmesi
3.2.3’de belirtilen şekilde hazırlanmış olan numuneler gaz kromatografi cihazında analiz edildikten sonra elde edilen her numuneye ait kromatogram standart kromatogram ile karşılaştırılarak ve alıkonma zamanları dikkate alınarak numunelerin içerisindeki yağ asitlerinin çeşitleri belirlendi ve cihazın her yağ asidi için otomatik olarak hesapladığı alanlar kaydedildi. Yağ asidinin kendi alanını toplam pik alanına oranlayarak numuneler içerisindeki her yağ asidinin yüzdesi belirlendi.
3.4. Elde Edilen Verilerin İstatistiksel Olarak Değerlendirilmesi
Verilerin istatistiksel olarak değerlendirilmesinde SPSS 15.0 paket programı kullanıldı. Üç farklı sıcaklığa ve yaşa bağlı olarak A.obtectus erginlerinin sahip olduğu toplam yağ, toplam yağ asidi ve yağ asitlerinin yüzdelerinin istatistiksel olarak değerlendirilmesinde ikiden fazla grubun karşılaştırılmasında tek yönlü varyans analizi (ANOVA) uygulandı. Bu testten elde edilen sonuçların önem seviyeleri ‘Tukey’ testi kullanılarak değerlendirildi. İkili grupların karşılaştırılmasında ise ‘Bağımsız İki Örneklem t-Testi (independent samples t-test) kullanıldı. Değerlendirilmelerde 0.05 güven sınırı esas alındı.