3.1. Materyal
3.1.1. Bitkisel MateryalinTemini Ve Hazırlanması
Denemeler Selçuk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği BölümüGıda Mikrobiyolojisi Laboratuvarı‟nda gerçekleştirilmiştir.Çalışma materyali olarak kullanılan sebze suları karnabahar (Brassica oleraceae L.var.botrytis), beyaz lahana (Brassica oleraceae L.var. capitata alba), brokoli (Brassica oleraceae italica), kırmızı lahana(Brassica oleraceL.var. capitata rubra ) yerel marketlerden ve Konya semt pazarlarından taze olarak temin edilmiştir, Laboratuvar ortamına getirilen sebzelerin suları Katı Meyve Sıkacağı kullanılarak elde edilmiştir, sebze suları otoklavta steril edilmiştir.Her tekerrür için 850 g karnabahar, 750g beyaz lahana, 700 g kırmızı lahana ve 850g brokoli kullanılmıştır.Fermente sebze suyu ile yapılan bu çalışmada probiyotik kültür olarak Selçuk Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü'nden sağlanan L. casei ve L. paracasei kültürleri kullanılmıştır.
3.1.2. Kullanılan Cihazlar
Hassas terazi: Tüm tartım işlemlerinde (Kren sohin) D-72336 marka terazi kullanılmıştır.
Buz dolabı: Örneklerin, elde edilen ekstraktların ve bazı kimyasalların saklanması için (Arçelik) marka kullanılmıştır.
Santrifüj: (Nüve, NF800R).
Renk analizi: CR400 renk ölçüm cihazı (Minolta) kullanılarak yapılmıştır. Spektrofotometre: (Optizen) Tüm spektrofotometrik analizlerde .
Otoklav: (Hirayama) HV100 marka kullanılmıştır.
Su aktivitesi değerleri: AquaLab 3 TE (Amerika) cihazı ile ölçülmüştür. İnkübatör: (Nüve ) marka FN/120.
Mikrobioloji kabin Model: (JSCB)-1200SB No:120820-71 Korea. Katı meyve sıkacağı: (Arçelik) marka P.R.C.
3.1.3. Kimyasal Malzemeler
MRS- Agar 500g (Merck),MRS- Broth 500g (Merck),Ortho Phosphoric Acid Extra Pure 85.0-88.0%, 2.5 L ( SIAL) , Spektrofotometre Küveti, PS, Köpük Rakta, 2-4 ml Makro, (LPITALIANA),DPPH2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (Aldrich), Sodium Hydroxide Extra Pure 98-100.5% pellets 1kg (SAIL),ABTS,2′-Azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammoniumsalt (SIGMA),Temizleme Solisyonu (Metil A). Extra Pure, 2.5 L (SAIL), Trizma hydrochloride for molecular biology, 500 g (SIGMA), Filtre Kağıdı,Grade1 ,125mm (WHATMAN),Folin-Ciocalteu's Phenol Reagent 100 Ml (Merck),Santrifüj tüpü--PP-Vidalı Kapaklı-50 ml-Dna and Rna Free- Tek Amb (Isolab), Tüp Sporu, Plastik PP, 30 mm, 18 Delikli (LP ITALIANA), Sodium Carbonate anhydrous, 99.5-100.5%, 1 kg (SIAL), petri kutusu- Pp,Steril.90mm,700adt/koli (Fıratmed).
3.2. Yöntem
3.2.1. Probiyotik Bakteri Muhafazası ve Uygulaması
İçerisinde 100 ml MRS Broth bulunan 250 ml‟lik erlene 2 ml probiyotik bakteriden (L. casei veL. paracasei) inoküle edilmiştir ve 37°C‟ta 12 saat inkübe edilmiştir (Broth‟un pH‟sı H3PO4 ile 6,4‟e ayarlanmıştır). %50 kültür ve %50 steril
gliserol karıştırılıp 8 ml‟lik stok kültür olarak -20 °C‟ta saklanmıştır.
Kullanılacağı zaman 8 ml‟lik bu tüp 100 ml MRS Broth içeren 250 ml‟lik erlene boşaltıltılıp, 37°C‟ta hücre kültür yoğunluğu, macfarlansla 9 log kob/ml olana dek bekletilmiştir. 9 log/kob‟ya ulaşan bu kültürden 2 ml alınarak 200 ml sebze suyu
bulunan 500 ml‟lik erlene inoküle edilmiştir. İçerisinde probiyotik bakteri bulunan sebze suyu 24 saat fermente edilmiştir. Daha sonra 42 gün olarak belirlenen raf ömrü periyodunda her yedi günde bir laktik asit bakterilerinin mikrobiyal sayımları,titrasyon asitliği, pH, renk, antioksidan aktivite ve fenolik maddedeğerlerine bakılmıştır.
3.2.2. Mikrobiyal (Laktik asit bakteri) Büyüme ve Canlı Hücre Sayımı
L. casei ve L. paracasei kültürü ile fermenteedilen sebze suları 30°C‟ta 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. Fermente edildikten sonra, 42 gün 4°C ta depolanmıştır. 1, 7, 14, 21, 28, 35, 42. günlerde L. casei ve L. paracasei sayımı yapılmıştır. Ringer tableti (Merck, Almanya) kullanılarak hazırlanan dilüsyon sıvısı 9 ml olacak şekilde tüplere bölünmüştür ve bu sıvılarla sebze sularının seri dilüsyonları hazırlanmış, dökme kültür yöntemine göre de petrilere ekim yapılmıştır (Rybka and Kailasapathy, 1996; Vinderola and Reinheimer,2000). 30°C‟ de 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Daha sonra gelişen tipik kolonileri sayılmıştır (Tipik koloniler, yuvarlak, beyaz, krem renginde ve yaklaşık 0,9-1,3mm çapındadır). Sonuçlar log kob/ml olarak verilmiştir (Anonymous, 1996).
3.3. Fiziksel ve Kimyasal Analizler
3.3.1. Titrasyon Asitliği Analizi
Titrasyon asitliğinin belirlenmesinde 10 ml sebze suyu, titrasyon için 0.1N NaOH çözeltisi ve indikatör olarak fenolfitaleyn kullanılmıştır. Sonuçlar sebze suyundaki laktik asit g/L olarak cinsinden verilmiştir(Ough ve ark., 1988).
3.3.2. pH Analizi
10 g fermente edilmiş sebze sularının pH metre ile pH analizleri gerçekleştirilmiştir. Cihazın kalibrasyonu için standart buffer çözeltileri (pH 4.01 ve 7.01; Merck) kullanılmıştır(Case ve ark., 1985).
3.3.3. Renk Analizi
Renk ölçümlerinde sebze sularıölçüm kaplarına konularak L* (parlaklık), a* (yeşil ve kırmızılık) ve b* (sarı ve mavilik) değerleri okunur. Öncesinde alet beyaz bir tabla ile kalibre edilir (Pinho ve ark., 2004).
3.3.4. Su Aktivitesinin Analizi(aw)
Fermente edilmiş sebze suyu örneklerinin su aktivitesi değerleri ölçülmüştür. Cihaz ölçüm öncesinde distile su ile kalibre edilmiştir. Kalibre edildikten sonra örnek haznesine yeterli miktarda örnek konularak kapatılmış ve cihaz ekranında okunan değer sabitlenene kadar beklenmiştir. Sabit hale gelen su aktivitesi (aw) değeri ve örnek ısısı
cihaz ekranından okunmuştur (Lang ve Steinberg, 1980).
3.4. Antioksidan Aktivitesi Tayini
Antioksidan aktivite tayini, farklı radikalleri bağlama özelliklerine göre 2 farklı metotla ( DPPH,TEAC Metodu) ile gerçekleştirilmiştir.
3.4.1. Örnek Ekstraksiyonu
Antioksidan aktivitesi tayini, sebze suları örneklerine depolama sırasında uygulanmıştır. Hazırlanan probiyotik sebze sularının antioksidan ve fenolik madde analizlerinin yapılabilmesi için öncesinde ekstraksiyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Çalışmada ekstraksiyon işlemi için metanol-su karışımı kullanılmıştır. Ekstraksiyon için 5g sebze suyu, 25 ml %80 metanol ile karıştırılmıştır. Elde edilen metanol-örnek karışımı 10 dk süresince 4000 devirde soğutmalı santrifiüjde santrifüj edilmiştir. Santrifüj işleminin ardından örneklerdeki metanollü sıvı kısım Whatman No:1 filtre kağıdından geçirilerek örnekler analizler için hazır hale getirilmiştir.
3.4.2. DPPH Metodu
Çalışmada antioksidan aktivitesi tayini DPPH (2-2-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) metoduna göreyapılmıştır. Metodun temelinde bir serbest radikal olan DPPH'in örnekte bulunan antioksidenmaddeler tarafından yok edilmesi esası vardır. Analiz sırasında spektrofotometre küvetine örnek ekstraktindan 100 μl koyulup bunun üzerine 900 μl tris
(pH7.4) Hcl ve 2 ml DPPH çözeltisi ilave edildi. Tüpler 30 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra spektrofotometerede 517 nm'de absorbans ölçümleri yapıldı. Bir radikal olan DPPH'in %50'sinin yok edilmesi için gerekli olan örnek konsantrasyonları aşağıdaki formüle göre belirlenmiştir(Bhandari ve ark., 2010).
% inhibisyon= ( Abs k- Abs ö)/(Abs k) х 100
3.4.3. TEAC Metodu
ABTS•+yöntemi Saafi ve ark.‟nın kullandığı yönteme göre yapılmıştır. Bu yöntem için 7 mMABTS•+(2,2'-Azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 2.45 mM potasyumbisulfat ile karışltırılarak karanlık ortamda 12-16 saat bekletildi ve daha sonra bu karışım fosfat buffer saline tamponu ile spektrofotometrede 734 nm dalga boyunda 0.700+0.01 absorbans olacak şekilde seyreltildi. 20 μL, 30 μL ve 40 μL sebze suyu ekstraktına absorbansı 0.700‟ye ayarlanan ABTS•+den her birine ayrı ayrı 1ml ilave edilerek ve hiç vakit kaybetmeden spektrofotometrede 734 nm dalga boyunda absorbansı ölçümü yapılmıştır. Elde edilen absorbans değerleri Trolox (10-100 μmol/L) standart eğim Çizelgesi ile hesaplanarak sonuçlar mM Trolox/kg cinsinden ifade edilmiştir (Antolovich ve ark., 2002).
3.5. Toplam Fenolik Madde Tayini
Yukarıda açıklanan şekilde hazırlanan ekstraktın berrak kısmıalınıp toplam fenolik madde ölçümü için küvetlere 50 μL örnek ekstraktı, 250 μL Folin-Ciocalteu çözeltisi, 750 μL %20‟lik Na2CO3 çözeltisi ve 3 ml saf su konulup 2 saat karanlıkta
bekletilerek 765 nm‟de okuma yapılmıştır. Zhang ve Hamauzu (2004)‟nun belirttiği şekilde gallik asit standardıkullanılarak sonuçlar mg gallik asit/100 g taze ağırlık üzerinden ifade edilmiştir.
3.6. Ġstatistiksel Analizi
Elde edilen tüm sonuçların istatistik analizlerinin yapılmasında SPSS 19 paketi, varyans analizi sonucunda önemli çıkan faktörler Duncan çoklu karşılaştırma testi ile değerlendirilmiştir (Duncan,1955).