4.1. Makromantarların Toplanması, TeĢhisi ve Genel Özellikleri
ÇalıĢmalarımızda kullandığımız her iki mantar da, yüksek yapılı Ģapkalı mantarlardan olup yöre halkı tarafından sevilerek tüketilen ve yurt dıĢından da çok rağbet görüp ihraç edilen türlerdir. Mantarlardan C. cibarius ilkbaharda Ordu‟ dan, T.
anatolicum ise sonbaharda Karaman‟dan toplanıp, Selçuk Üniversitesi Mantarcılık
AraĢtırma ve Uygulama Merkezi‟ nde Yard.Doç.Dr. H.Hüseyin DOĞAN tarafından teĢhis edilmiĢlerdir.
Tricholoma anatolicum Doğan & Intini‟ un genel özellikleri;
Regnum : Mycetae Divisio : Basidiomycota Classis: Basidiomycetes Ordo: Agaricales
Familia : Tricholomataceae
Species : Tricholoma anatolicum Doğan & Intini, Tricholoma anatolicum Spec. Nov.: A New Member of The Matsutake Group, Micol. e Veget. Medit., 18, 2: 135- 142 (2003).
ġapka; 4-20 cm çapında, önce sapa bitiĢik topuz Ģeklinde, sonra açılarak yarı kubbe Ģeklinden düzgünleĢir. Gençken beyaz-krem, geliĢme ilerleyince sarımsı kreme döner. Yüzeyi ince yünümsü tüylü, kenarında yünümsü velar kalıntılar asılı bulunur (ġekil 9).
Etli kısım; 2-5 cm kalınlığında, beyaz, sıkı yapılı ve dolgun, katran kokusunda ve tadı çok güzeldir.
Lameller; krem beyaz, sapa ince bir girinti yaparak birleĢir.
Sap; 4-10 x 2-5 cm, silindirik ve tabana doğru biraz incelmektedir. Önce beyaz, sonra krem beyazdan krem sarıya döner. Üzerinde ince yünümsü yapıda velar kalıntılar ve annulus bulunur.
Sporlar; 6-7.5 x 4-5 µ, geniĢ eliptik veya subgloboz, renksiz, siyanofiliktir. Spor baskısı krem beyazdır.
YetiĢme yeri özellikleri; Sedir ormanı içinde kumlu yerlerde sedir ağacı ve
Astragalus’ ların dibinde ektomikorhizal yaĢamaktadır.
Diğer özellikleri; Endemik bir türdür. Ġlk kez Doğan (2001) tarafından doktora çalıĢmaları sırasında belirlenmiĢ ve tezde cins seviyesinde verilmiĢtir. Intini ve Ark. (2003) te ise yeni tür olarak bilim dünyasına tanıtmıĢlardır. Amerika‟da bol miktarda yetiĢen Tricholoma magnivelare ve Japonya‟daki Tricholoma matsutake’ye çok benzemektedir. Bu iki türden bazı morfolojik özellikleri, yetiĢme yeri özellikleri ve belirgin kokusuyla ayrılmaktadır. Ayrıca yapılan DNA analiz sonucuna göre belirtilen iki türden kesin hatla ayrıldığı da belirlenmiĢtir.
Yalnızca Akdeniz bölgesinde sedir ağaçlarının bulunduğu yerlerde ve kumlu alanlarda, Ekim ve Kasım aylarında, hava Ģartları iyi olursa Aralık ayında yetiĢir. Yöre halkı mantarı tanımakta ve “Katran Mantarı” ismi verilmektedir. Mantar bol miktarda toplanarak yurt dıĢına özellikle Japonya‟ ya ihraç edilmektedir.
Cantharellus cibarius Fr.‟ un genel özellikleri;
Regnum : Mycetae Divisio : Basidiomycota Classis : Basidiomycetes Ordo: Cantharellales Famillia : Cantharellaceae
Species : Cantharellus cibarius Fr., Syst. mycol. (Lundae) 1: 318 (1821) var. cibarius
ġapka; 3-6 cm çapında, genç mantarlarda yarım küre Ģeklinde, geliĢmiĢlerde ise huni Ģeklini alır. Mantarın rengi sarımsı beyazdan, yumurta sarısı rengine kadar değiĢir. ġapka üstü mumsu bir görünüĢte, ıslandığı zaman mantarın üstü yağımsı görünüĢlü olur (ġekil 10).
Etli kısım; lifli yapılı, az sulu, rengi sarımsı beyaz, genç mantarlarda tadı hoĢ, geliĢmiĢlerde ise acımsı, piĢirilince bu acılık hissedilmez. GeliĢmiĢ mantar uzun zaman toprakta kalırsa kurtlanma görülür.
Lameller; decurrent sap üzerinde 1-1,5 cm kadar devam eder. Eni dar, damar Ģeklinde ve Ģapka kenarına doğru ucu çatallanır ve yanındaki lamellerle birleĢir. Renk Ģapkayla aynı, yumurta sarısıdır.
Sap; 3-5 cm boyunda, 1-2 cm çapında, genellikle silindir Ģekilli, Ģapkaya doğru geniĢler. Sarımsı- beyazdan, yumurta sarısı rengine kadar değiĢir
Sporlar; 8,5 x 5 µ, eliptik ve bir tarafında küçük bir çıkıntısı bulunur. Üzeri halka Ģeklinde süslü ve bunların üzerinde siyah noktacıklar görülür.
YetiĢme yeri özellikleri; Mantar orman içlerinde görülürse de kayın, köknar, ve meĢe ormanlarında yayılıĢ göstermektedir. Memleketimizde ise mantarın, bu ormanlarda haziran ayından kasım ayına kadar toplaması mümkündür.
Diğer özellikleri; Mantar yenen bir tür olup, kendisine benzer aldatıcı bir mantar türü yoktur. Avrupa ülkelerinde her zaman alıcı bulabilmektedir. Karadeniz bölgesinde, yukarıda bahsedilen ormanlardan toplamak mümkündür. Bolu ili çevresinde “cüce kız”, “meĢe mantarı” gibi isimlerle Giresun ve Ordu çevresinde ise “Tavuk bacağı mantarı”, ve “Tirmit” olarak bilinmektedir.
ġekil 9. Tricholoma anatolicum Doğan Intini
ġekil 10. Cantharellus cibarius Fr.
4.2. Mantarların Antioksidan Aktivitelerinin Belirlenmesinde Ġzlenen Metot ve Materyal
4.2.1. Mantar ekstraktlarının hazırlanması
4.2.1.1. Materyal
Petrol Eteri (Merck), MeOH (Merck), soxhlet, evaporatör, liyofilizatör
4.2.1.2. Metot
Uygun koĢullarda kurutulan mantarlar, toz haline getirildi ve herbirinden yaklaĢık 30 g alınarak soxhlet apareyinde 8 saat süreyle 40-60 0C‟ de yağlarından
arındırılmaları amacı ile petrol eterinde ekstre edildi. Kalan numune %70‟ lik MeOH ile sıcak su banyosunda (40 0
C) 1 saat boyunca ekstre edildi ve her 15 dakikada bir süzüldükten sonra, kalan MeOH evaporatörde vakum altında(45 0C) uzaklaĢtırıldı.
Evaporasyondan sonra kalan numunenin suyunun tamamen uzaklaĢtırılabilinmesi ve uzun süreli kullanımı amacıyla liyofilize edildi. Ekstrakt +4 oC‟ de buzdolabında
saklandı.
4.2.2. Ġndirgeme gücü
Mantarların ekstarktlarının bazı bileĢikleri indirgeme kapasitesi ölçüldü.
4.2.2.1. Materyal
Metanol, FeCl3, Fosfat tamponu [(pH: 7)- K2FeCN], Potasyum ferrosiyanid,
Trikloroasetik asit (TCA), Shimadzu U.V. 1700 spektrofotometre, santrifüj, benmari.
4.2.2.2. Metot
Mantarlar ın indirgeme gücü Oyaizu (1986) metodu ile belirlendi. Mantarların metanolik ekstraktarından 5 farklı konsantrasyonda çözeltiler hazırlandı
(0,4-0,04 mg/ml). Hazırlanan her bir çözeltide deney tüplerine 2,5 ml numune alındı. Her birinin üzerine 0,2 M 2,5 ml fosfat tamponu (pH : 6,6) , %1‟ lik Potasyum ferrosiyonad çözeltisinden ilave edildi. Tüpler 50 ˚C‟de 20 dk. boyunca benmaride inkübe edildi. Daha sonra 2,5 ml %10‟luk trikloroasetik asit (TCA) ilave edilip, 10 dk. boyunca 600 rpm‟de santrifüj edildi ve tüplerdeki karıĢımların üst kısmından 5‟er ml alınarak baĢka tüplere aktarıldı. Yeni tüplere aktarılan numunelerin her birinin üzerine 5 ml deiyonize su eklendi. % 0,1‟lik FeCl3‟den 1 mlilave edildikten sonra
oluĢan yeĢil renkli çözeltilerin absorbansları Shimadzu U.V. 1700 spektrofotometrede 700 nm‟de ölçüldü.
4.2.3. DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) radikallerini süpürme etkisi
4.2.3.1. Materyal
DPPH, metanol(Merck), Shimadzu U.V. 1700 spektrofotometre.
4.2.3.2. Metot
Qian.ve Nihorimbere (2004)‟ e göre Sanchez Moreno metodu esas alınarak yapılmıĢtır. Liyofilize edilmiĢ droglardan yukarıda belirtilen konsantrasyonlarda 5 farklı mantar çözeltisi metanolde hazırlandı. DPPH‟ın kalibrasyon eğrisi çıkarıldı. Hazırlanan çözeltilerden 0,5 ml alınarak üzerine 3 ml DPPH çözeltisi ilave edildi. Kuvvetlice karıĢtırılıp ağzı kapatıldıktan sonra 30 dk. süre ile karanlıkta bekletildi. Bu sürenin sonunda her bir karıĢımın absorbansları spektrofotometrede 515 nm‟de okundu. Bu değerlerden faydalanarak radikalin yarısının süpürüldüğü andaki mantar konsantrasyonu (IC50) değerleri hesaplandı.
4.2.4. Toplam fenolik madde tayini
4.2.4.1. Materyaller
Folin reaktifi, Na2CO3, Metanol (Merck), Gallik asit (GA), Shimadzu U.V.
1700 spektrofotometre.
4.2.4.2. Metot
Toplam fenolik madde tayini Folin-Ciocaltaeu (1927), metoduna göre yapıldı. Standart olarak kullanılan Gallik asit ve mantarlar %70‟lik metanol içerisinde hazırlandı. 0,4 mg/ml konsantrasyonunda 0,5 ml mantarların metanol ekstraktları, %10‟ luk folin reaktifinden 2,5 ml ve %10‟luk NaCO3‟dan 7,5 ml bir
deney tüpünde karıĢtırıldı ve oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat bekletildi. Bu süre sonunda 750 nm‟de çözeltilerin absorbansları okundu. Aynı yöntem kullanılarak 0,4 mg/ml konsantrasyonundan baĢlayarak giderek azalan konsantrasyonlarda hazırlanan Gallik asit için kalibrasyon eğrisi çizildi. Çözeltilerin absorbansları çizilen kalibrasyon eğrisinden alınarak eĢ değer Gallik asit (GAE) miktarı mg/ml olarak hesaplandı.
4.2.5. CUPRAC metodu
4.2.5.1. Materyal
CuCl2.2H2O, Etanol (Merck), Amonyum asetat (Merck), saf su, BHT , BHA,
Shimadzu U.V. 1700 spektrofotometre.
4.2.5.2. Metot
Bu yöntem Apak ve ark., 2006‟ na göre yapılmıĢtır. Bir test tüpüne 1‟er ml CuCl2.H2O (10-2M), Neocuprine etanolik çözeltisi (7,5.10-3M) ve Amonyum asetat
tamponu [(0,077 mg/ml) PH:7] çözeltisinden konuldu. Üzerine farklı 29
konsantrasyonlarda hazırlanmıĢ mantarların metanol (%70) ekstraktlarından ve yine %70‟lik metanolde hazırlanmıĢ standartlardan 0,8 ml ve 0,3 ml deiyonize su ilave edildi. 450 nm‟de absorbansları okundu.
4.2.6. β- Karoten- linoleik asit metodu
4.2.6.1. Materyal
Kloroform (CHCI3) (Merck), β- karoten, Linoleik asit, Tween 40, saf su,
evaporatör, Shimadzu 1700 UV spektrofotometre
4.2.6.2. Metot
Bu metot Amin ve Tan, 2002‟ ye göre yapıldı. β- karoten- linoleik asit emülsiyon karıĢımının hazırlanması; 0,2 mg β- karoten, 1 ml kloroformda çözüldü. Üzerine % 60‟lık 0,02 ml linoleik asit çözeltisi ve 200 mg Tween 40 ilave edildi. Vakum altında 40 0C de evaporatörde kloroform tamamen uzaklaĢtırıldıktan sonra
100 ml oksijenle doyurulmuĢ veya deiyonize su eklendi. ġiddetli Ģekilde karıĢtırıldı. Kontrol çözeltisi için aynı iĢlemler β-karoten ilave edilmeden tekrarlandı.
Numunelerin konsantrasyonu 1 mg/ml olacak Ģekilde % 70‟ lik metanolde hazırlandı. Deney tüplerine, hazırlanan bu çözeltilerden 0,2 ml alınarak üzerine 5 ml, hazırlanan emülsiyon çözeltisi ilave edildikten sonra 40 oC‟ de su banyosunda
inkübasyona bırakıldı. Deney tüplerindeki numunelerin ve kontrol çözeltisinin absorbansı 470 nm de okundu (t0). Bu andan itibaren inkübasyondaki çözeltilerin
absorbansı her 15 dakikada bir 2 saat süresince okundu.
4.3. Mantarlar ın Antimikrobiyal Aktivitelerinin Belirlenmesinde Ġzlenen Metot ve Materyal
4.3.1. Materyal
4.3.1.1. Kullanılan kimyasallar ve cihazlar
Metanol, kloroform (Merck), aseton (Merck), hekzan (Merck), 6 mm‟ lik steril boĢ diskler, mukayese antibiyotik diskleri (Kloramfenikol ve Nistatin), Mueller Hinton Agar (OXOID), Malt Extract Broth'da (DIFCO), Brain Heart Infusion Broth'da (OXOID)bitki değirmeni, soxhlet, deney tüpleri, petriler, evaporatör, etüv. 4.3.1.2. Test mikroorganizmaları
ÇalıĢmada kullanılan mikroorganizmaların tamamı Selçuk Üniversitesi Sağlık Meslek Yüksek Okulu‟ndan temin edilmiĢtir. Mantarların antimikrobiyal aktivitesi, altı Gram pozitif bakteri; Staphylococcus aureus ATCC 6538, Streptococcus
salivarius RSHE 606, Streptococcus pneumonia ATCC 10015, Streptococcus mutans
RSHE 676, Bacillus cereus ATCC 11778, Listeria monocytogenesis NCTC 5348; dört Gram negatif bakteri, Klebsiella pneumonia ATCC 5041, Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ve bir maya; Candida albicans üzerine denendi.
Kullanılan mikroorganizmaların neden olduğu hastalıklar ve rahatsızlıklar;
Bacillus cereus besin zehirlenmelerine,
Pseudomonas aeruginosa özellikle, bağıĢıklık yetersizliği olan hastalarda solunum ve
idrar yollarının, yanıkların ve açık yaraların fırsatçı patojenidir,
Listeria monocytogenesis menenjit ve septisemi,
Staphylococcus aureus toksik Ģok sendromu,
Streptococcus mutans diĢ çürükleri,
Streptococcus pneumonia menenjit,
Streptococcus salivarius endocarditis,
Klebsiella pneumonia zatürre,
Escherichia coli ishal ve idrar yolları enfeksiyonu,
Salmonella enteritidis besin zehirlenmesi,
Candida albicans pamukçuk.
4.3.2. Metot
4.3.2.1. Ekstraktların HazırlanıĢı
Makrofungus örnekleri uygun koĢullarda kurutulduktan sonra aseptik Ģartlara uyularak bir bitki değirmeni yardımı ile toz haline getirildi. Toz halindeki mantardan 25 g tartılarak, 200 ml çözgen içinde Soxhlet cihazına yerleĢtirildi ve 12 saat ekstraksiyona tabi tutuldu. Ekstraksiyon fazı evaporatörde ayrılarak, ekstreler +4°C'de saklandı. Bu iĢlem aynı numune ile sırasıyla non polar çözücüden polar çözücüye doğru; hekzan, aseton, kloroform ve metanol olarak 4 ayrı çözgende yapıldı.
4.3.2.2. Ekstrakt Ġçeren Disklerin ve Mikroorganizma Kültürlerinin Hazırlanması
Antimikrobiyal aktivitenin belirlenmesinde Disk Difuzyon metodu uygulandı. Bu metoda göre 6 mm çapındaki disklere, aseptik Ģartlara uyularak 30 mg/ml konsantrasyonunda hazırlanan ekstrelerden 20 l emdirilmiĢtir. ÇalıĢmada besiyeri olarak bakteri ve mayaların antimikrobiyal aktivitesini belirlemede Mueller Hinton Agar kullanıldı.
Denemede kullanılacak olan bakteri kültürlerini aktifleĢtirmek için Brain Heart Infusion Broth (OXOID), maya kültürieri için Malt Extract Broth (DIFCO) kullanılmıĢtır. Stok kültürden alınan bakteri suĢları ayrı ayrı 4-5 ml Brain Heart Infusion Broth'da (OXOID) süspanse edilerek 35 0C'de 24 saat , maya suĢları da Malt
Extract Broth'da (DIFCO) süspanse edilerek 25 0C'de 48 saat etüvde inkübe
edilmiĢtir. Bu süre sonunda bakteri süspansiyonu 0,5 McFarland standart tüpüne karĢı steril serum fizyolojik ile ayarlanmıĢtır. Ġyice karıĢtırıldıktan sonra steril petri kutularına 40' ar ml dağıtılmıĢtır. Tüm petri plakları bundan sonra 5-15 dakika süre ile oda ısısında kurumaya bırakılmıĢtır. Süre sonunda petrilerin içlerine aseptik olarak farklı ekstreler emdirilmiĢ diskler yerleĢtirilmiĢtir. Bakterilerin inokule edildiği plaklar 35°C‟ de 24 saat, mayaların inokule edildği plaklar ise 25 0C‟ de 3 gün
inkübasyona bırakılmıĢtır. Süre sonunda disklerin çevresinde oluĢan inhibisyon zonlarının çapları ölçülmüĢtür, inhibisyon zonlarının çapları ölçülürken disklerin çapı da ölçüme dahil edilmiĢtir. Buna ilaveten sadece çözgenlerin emdirilmiĢ olduğu diskler kontrol ve 6 mm çapındaki Kloramfenikol (CHL) ve Nistatin (Ns) antibiyotikleri diskleri mukayese amacı ile kullanıldı.
Tüm test mikroorganizmalarına karĢı yapılan antimikrobiyal aktivite deneyleri üç paralelli çalıĢılmıĢtır. Sonuçta her bir ekstre ve mukayese antibiyotikleri için inhibisyon zonlarının ortalaması alınmıĢtır.
4.4. Mantarların Yağ Asitlerinin BileĢiminin Tespit Edilmesinde Ġzlenen Metot ve Materyal
4.4.1. Materyal
Sodyum Hidroksit NaOH ( Merck ) ve Metanol CH3OH ( Merck ), % 2‟ lik
Metanolik NaOH : 2 gr NaOH, metanol ile 100 ml‟ ye tamamlanmıĢtır. % 14‟ lük BF3 – Metanol Kompleksi, n-Heptan (Merck), DoymuĢ NaCl : Bir litrelik ĢiĢeye
NaCl distile su ile doyurulmuĢtur, geri soğutucu, 45 cm, düz; yağ balonu, 250 ml, dibi düz ve 29*32 Ģilifli; ayırma hunisi, (100 ml.‟ lik) olmalıdır. Ayrıca, ekstraktör, milivial ve insert kullanılmıĢtır. Kullanılan cihazlar ise bitki değirmeni, gaz kromatografi, soxhlet cihazı, derin dondurucu, vorteks.
4.4.2. Metod
Mantarların toplanıp yağ asidi değerlerinin tespitine kadar takip edilen yöntemler aĢağıda sırasıyla verildi.
4.4.2.1. Mantarların öğütülmesi
Temin edilen mantarlar, 1 mm‟ lik elek içeren değirmende öğütüldü.
4.4.2.2. Yağ asidi analizleri için kullanılacak yağın elde edilmesi
Kullanılan mantarların ham yağ eldeleri A.O.A.C.,1990 metoduna göre, soxhelet cihazında yapılmıĢtır. Ekstraksiyonda dietil eter çözücüsü kullanıldı.
4.4.2.3. EsterleĢtirme iĢleminin yapılması
Yağ örneğinden 0,16 – 0,20 gr alınarak yağ balonlarına konulmuĢtur. Üzerine 4 ml % 2‟ lik metanolik NaOH çözeltisi ilave edildikten sonra; su banyosu üzerinde sabunlaĢma oluncaya kadar 10 dakika kaynatıldı. SabunlaĢma sonunda, yağ balonu içine 5 ml % 14‟ lük BF3 – metanol kompleksi eklenmiĢ ve 5 dakika daha
kaynamaya bırakıldı. Kaynama sonrasında balon sürekli ve yavaĢ bir Ģekilde çalkalandı, sonra üzerine 2 ml n– heptan ilave edildi. Tüm bunlar bir dakika daha kaynatıldıktan sonra, üzerine 4 ml doymuĢ NaCl çözeltisinden eklendi. KarıĢım iyice karıĢtırıldıktan sonra ayırma hunisine alındı ve 5 - 10 dakika kadar fazların ayrılması beklendi. En sonunda alttaki sulu faz atıldı, üstteki açık sarı renkli faz, viallere konularak analizin yapılacağı zamana kadar derin dondurucuda saklandı (Paquot 1979).
4.4.2.4. Numunelerin gaz kromatografiye enjekte edilmesi
Analizler GC-15A SHĠMADZU model gaz kromatografisi, integratör C- RV4A ve 1,8 m uzunluğunda paket kolon kullanıldı. Enjeksiyon portu ve Alev Ġyonizasyon Dedektörü (FID) arasına kolon bağlantısı yapıldı. Dedektör sıcaklığı 280 oC, Enjeksiyon bloku sıcaklığı 270 oC‟ dir. Kolon fırın sıcaklığı 190 oC‟ den baĢlayıp 35 dakika devam ederek, dakikada 30 o
C artarak 220 oC ulaĢıp, bu sıcaklıkta 5 dakika daha bekletildi. TaĢıyıcı gaz olarak azot kullanıldı, akıĢ hızı dakikada 20 ml/dk olacak Ģekilde ayarlandı. Bu akıĢ hızında basınç 47,51 psi basıncı göstermektedir. Dedektör için hidrojenin akıĢ hızı, dakikada 30 ml ve hava akıĢ hızı,
dakikada 300 ml olarak ayarlandı. Enjeksiyon hacmi 1µl‟ dir. Cihazdan çıkan pikler ise shimadzu C-4A ile analiz edildi.
ġekil 11. Yağ analizi sırasında meydana gelen reaksiyon (Alcantara 2000)